Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

이 작품은 영구 충격 보조금 (IPAP201601422)과 노보 노디스크 재단 생물 의학 프로젝트 보조금 (NNF17OC0028990)에 의해 지원되었다. YZ는 또한 시드니 대학에서 호주 대학원 상을 수상한 것을 인정합니다. 우리는 단핵구 격리 및 조직 문화에 도움을 주셔서 씨 팻 피산사라킷과 모건 존스 씨에게 감사드립니다.

HMDM은 시드니 지역 보건 지구의 윤리 승인을 받아 혈액 은행이 제공하는 인간 버피 코트 제제에서 분리되었습니다.
1. HMDM 문화
<ol><li>림프구를 분리하기 위해 시판되는 제제를 사용하여 건강한 인간 기증자의 말초 혈액으로부터 제조된 버피 코트 제제로부터 단핵구를 분리하고, 이어서 역전류 원심용해19, 20.</li>
	<li>단핵구 특성?...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

M1 분화된 HMDMs를 이용한 MET 형성의 생성 및 시각화는 이러한 대식세포 구조의 잠재적인 병리학적 역할을 조사하는 데 유용할 수 있는 새로운 시험관 내 모델을 나타내며, 특히 만성 염증성 하에서 조건. 그것은 또한 인간 단핵구 또는 뮤린 대식세포 세포주를 가진 관련 연구 결과에서 이용될 수 있는 MET를 풀어 주기 위하여 1 차적인 인간 대식세포의 자극을 위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. HMDM...

호중구에서 ETs의 방출은 세균성 감염에 의해 시작되는 선천적인 면역 반응으로 처음 확인되었습니다1. 그(것)들은 항균 특성을 가진 각종 과립 단백질이 호중구 엘라스타아제 및 골수페록시다아제2를포함하여 결합되는 DNA 백본으로 이루어져 있습니다. 호중구 ETs (NETs)의 주요 역할은 병원체를 포착하고 그들의 제거를 촉진하는것입니다 3. 그러나, 면역 방어에 있는 ETs의 보호 역할 이외에, 연구 결과의 증가는 또한 질병 병인에 있는 역할을, 특히 염증 구동한 질병의 발달 도중 발견했습니다 (즉, 류마치스성 관절염 및 죽상 동맥 경화증4). ETs의 방출은 인터류킨 8 (IL-8) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)5,6,및 국부적 인 축적을 포함한 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발될 수 있으며, ET의 국소축적은 조직 손상을 증가시키고 불러일으키고 프로 염증 반응7. 예를 들어, ETs는 동맥경화증8의발달에 인과적 역할을 하는 것으로, 혈전증9를촉진하고, 심혈관위험도 10을예측하는 것으로 연루되어 왔다.
이제 호중구 이외에, 다른 면역 세포(즉, 비만 세포, 호산구, 및 대식세포)가 미생물 또는 프로-염증 자극에 노출될 때 ET를 방출할 수 있다는 것을 인식하고있다 11,12. 이것은 만성 염증성 질병의 발달, 규칙 및 해결에 있는 그들의 중요한 역할을 고려하여 대식세포의 경우에 특히 중요할 지도 모릅니다. 따라서 대식세포에서 ET 방출과 염증 관련 질병 개발 사이의 잠재적 인 관계를 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 최근 연구는 그대로 인간의 죽상 경화성 플라크와 조직 혈전13에METs와 NETs의 존재를 보여 주었다. 유사하게, MET는 선동적인 반응의 규정을 통해 신장 상해를 운전에 연루되었습니다14. 그러나, 호중구와는 달리, 대식세포로부터의 MET 형성 메커니즘에 대한 제한된 데이터가 있다. MET 형성의 인간 체외 모델을 이용한 최근 연구는 각 세포 유형에 관여하는 경로에 약간의 차이를 보여준다 (즉, 대식세포와 히스톤 시트룰린의 부재에 관한)6. 그러나, 일부는 NET 방출이 히스톤 시트룰린(15)의부재에서 발생할 수 있음을 보여 주었다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상적으로 관련된 대식세포 모델에서 MET 방출을 평가하는 간단하고 직접적인 방법을 제공하는 것입니다. METs(즉, THP-1 인간 단핵구 세포주 및 다양한 뮤린 대식세포 세포주)를 연구하기 위해 사용되어 온 여러 가지 시험관내 대식세포 세포 모델이있다 16. 이러한 모델과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시키는 것은 일반적으로 단백질 키나아제 C(PKC) 의존적 경로를 활성화시키는 포르볼 마이스테이트 아세테이트(PMA)의 첨가와 같은 프라이밍 단계를 필요로 한다. 이 과정은 ET 방출4를 트리거하는 것으로 알려져 있으며 THP-1 세포로부터 낮은 기저 MET 방출을 초래한다. 다른 연구는 PMA 처리 된 THP-1세포17에비해 생체 내에서 대식세포에 의해 장착 된 생체 활성 및 염증 반응의 몇 가지 차이점을 강조했다.
유사하게, 상이한 뮤린 대식세포유사 세포주들의 거동및 염증반응은 1차 인간 대식세포의 반응 스펙트럼을 완전히 나타내지않는다(18). 따라서, 임상 적 설정에서 대식세포 ET 형성을 조사하기 위한 목적으로, 1차 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDMs)는 단낭 또는 무린 대식세포 유사 세포주보다는 보다 관련성이 있는 모델로 여겨진다.
M1 편광 HMDMs로부터의 ET 방출은 골수페록시다아제 유래 산화하이포염소산(HOCl), PMA, TNFα 및 IL-86을포함하는 다수의 상이한 염증 자극에 이들 세포를 노출시킨 후 입증되었다. 여기서 설명된 프로토콜은 HMDM을 M1 표현형으로 편광시키고 이러한 염증 자극에 노출될 때 후속 MET 방출을 시각화하는 프로토콜이다. PMA는 호중구를 사용한 이전 연구와의 비교를 용이하게 하기 위해 MET 방출의 자극으로 사용됩니다. 중요하게도, HOCl, IL-8, 및 TNFα는 또한 생체 내에서 염증 환경의 더 나은 모델로 여겨지는 MET 방출을 자극하는데 사용된다. ET 방출의 가시화를 위한 현미경 방법은 SYTOX 녹색을 사용하여 살아있는 세포 배양에 있는 세포외 DNA를 염색하는 관련시킵니다, 이전 호중구 연구 결과에서 성공적으로 적용된 불투과성 형광 녹색 핵산 얼룩. 이 방법은 ET 방출의 신속하고 질적 평가를 허용하지만 ET 방출 범위의 정량화를 위한 독립형 방법으로는 적절하지 않다. 다른 처리 조건 또는 내정간섭에서 유래한 ET 방출의 넓이비교하기 위하여 정량화가 요구되는 경우에 대체 방법론을 이용되어야 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

호중구에 의한 세포외 트랩(ETs)의 방출은 만성 염증과 관련된 질병의 발병에 기여하는 요인으로 확인되었습니다. 호중구 ETs (NETs)는 DNA, 히스톤 단백질 및 다양한 과립 단백질 (즉, 골수 페록시다제, 엘라스타아제 및 카테신 G)의 메쉬로 구성됩니다. 대 식 세포를 포함 하 여 다른 면역 세포, 또한 ETs를 생산할 수 있습니다.; 그러나, 이것이 생체 내에서 어느 정도 발생하고 대식세포 외 트랩(METs)이 병리학적 메커니즘에서 역할을 하는지 여부는 구체적으로 조사되지 않았다. 염증성 병리학에서 MET의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 면역 형광 실험에서 악용될 수 있는 시험관 내 1차 인간 대식세포로부터 MET 방출을 시각화하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 이것은 이 구조물의 추가 특성화 및 호중구에서 풀어 놓인 ETs에 그들의 비교를 허용합니다. 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDM)는 M1 프로-염증 표현형에 대한 분화 후 상이한 염증 자극에 노출시 MET를 생성한다. MET의 방출은 살아있는 세포 (예를 들어, SYTOX 녹색)에 불침투되는 녹색 형광 핵산 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 가시화 될 수 있습니다. HMDM과 같은 갓 분리된 1차 대식세포의 사용은 잠재적인 임상 적용과 관련된 생체 내 염증 성 이벤트를 모델링하는 데 유리합니다. 이 프로토콜은 또한 인간 단핵구 세포주(예를 들어, THP-1)로부터의 MET 방출을 연구하기 위해 포르볼 마이리스테이트 아세테이트 또는 다른 대식세포 세포주(예를 들어, 뮤린 대식세포-유사 J774A.1 세포)를 이용한 대식세포로의 분화에 사용될 수 있다.

세포 분화에 대한 자극에 반응하여 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 브라이트필드 이미지는 도 1에나타내고 있다. IFNγ 및 LPS에 노출된 HMDM을 사용하여 실험에서 M1 편광 대식세포는 도 1(중간 패널)의 검은 화살표에 의해 나타난 바와 같이 길쭉하고 스핀들 같은 세포 형상을 보였다. 비교를 위해, 48h에 대한 HMDM에 HMDM을 노출한 후 M2 편광 대식세포의 형태...

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In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

호중구 및 기타 면역 세포에 의한 세포 외 트랩의 방출은 타고난 면역에서 중요하지만 염증 성 병리학과 강하게 연결됩니다. 이 세포는 선동적인 반응에 있는 중요한 역할을 하기 때문에 아주 작은 대식세포에 있는 이 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 대식세포 세포 외 트랩 또는 마스트 릴리스의 기본 인간 체외 모델을 제공합니다.그것은 생체 내에서이 구조의 잠재적인 생리적 성장을 연구 하는 우리에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 기술의 주요 장점은 이 프로토콜의 세포가 인간 버피 코트 제제로부터 분리된 1차 세포라는 것입니다. 단핵구를 대식세포로 분화하는 데 필요한 프라이밍 단계는 없으며, 이는 THP-1 세포주와 같은 다른 단세포 세포주와 대조된다.이 프로토콜은 분리된 호중구 및 microglia를 포함하여 그밖 면역 세포에 쉽게 적응됩니다. 대식세포에 의해 생성된 세포외 트랩은 매우 깨지기 쉽기 때문에 스테인드 트랩의 무결성을 보존하기 위해 단계 사이에 주의를 기울여야 합니다. 멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 배양 배지, 인터페론 감마를 밀리리터당 20 나노그램의 농도로, 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 준비한다.밀리리터당 20나노그램의 농도에 완전한 RPMI-1640 배양 매체에 인터류신 4를 추가하여 M2 프라이밍 미디어를 준비한다. 멸균 조건하에서, HMDM을 포함하는 종자 및 배양 조직 배양 플레이트 우물에서 흡인 매체. 각 우물에 조심스럽게 추가, 멸균 PBS의 1 밀리리터는 섭씨 37도에 미리 따뜻하게.PBS 버퍼를 제거하고 두 번 더 세척합니다. HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 미디어의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 세포 인큐베이터에 이산화탄소 5%가 있는 경우 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.멸균 조건하에서, 완전한 RPMI-1640 미디어에 MET 방출의 다른 자극기를 포함하는 배양 매체를 준비합니다. 저혈당 자극실험을 위해, 37°C까지 예온된 HBSS를 가진 팔콘 튜브에 200개의 미세몰라 저혈당산을 준비하십시오. 편광 처리 후, 각 우물에서 세포 매체를 흡습하고 PMA, TNF 알파, 인터류키인 8 자극 또는 HBSS에 대한 멸균 PBS 중 하나의 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척하여 고압산 자극을 한다.최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNF 알파 또는 인터류빈 8을 포함하는 완전한 미디어의 1 밀리리터를 추가합니다. TNF 알파 자극을 위해 6시간 동안 세포 인큐베이터에서 37도 및 5%의 이산화탄소를 배양하고 PMA 또는 인터류키 8 자극을 위해 24시간 동안 세포를 배양합니다. 고염소산을 실험하기 위해, 마지막 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후, 갓 준비된 하이포클로산 1밀리리터를 추가합니다.그런 다음 세포 인큐베이터에 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 15 분 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 조심스럽게 세포의 수퍼 내수를 흡인하고 HBSS의 1 밀리리터 알리쿼트로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후 완전한 RPMI-1640 배양 매체의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.그런 다음 세포 인큐베이터에서 5 %의 이산화탄소가있는 경우 섭씨 37도에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 40 마이크로몰러의 농도로 HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 준비합니다. HMDM을 포함하는 각 우물에 25 마이크로리터의 염색기를 직접 추가합니다.어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 세포를 배양하십시오. 그런 다음 HMDM을 조직 배양 우물에 배치하여 이미징을 위한 반전형 형광 현미경의 현미경 단계에 놓습니다. 고해상도 컬러 디지털 카메라로 설치된 광스펙트럼 형광원, 밝은 광원 및 반전 현미경을 켭니다.504 나노미터및 치수 523 나노미터에서 발산과 녹색 형광을위한 번호 2 위치로 필터 휠을 회전합니다. 5X 목표를 사용하여 이미지를 거친 초점으로 초점을 맞춘 다음 이미지가 선명하고 선명하며 초점을 맞출 때까지 현미경에 미세 초점 노브를 집중시합니다. 현미경을 카메라 모드로 전환합니다.관련 소프트웨어를 시작합니다. Play 버튼을 클릭하여 이미지를 미리 보고 이미지가 소프트웨어 미리 보기 창에 선명하고 선명하게 표시될 때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다. 캡처 버튼을 클릭합니다.소프트웨어 내에서 파일을 클릭합니다. 필요한 이미지 파일 유형으로 저장합니다. 현미경에서 필터 휠을 밝은 필드 이미징을 위해 5번 위치로 회전하고 캡처 절차를 반복하여 해당 밝은 필드 이미지를 얻습니다.자극에 대한 응답으로 HMDM의 형태학적 변화를 보여주는 밝은 필드 이미지가 여기에 표시됩니다. 인터페론 감마및 리포폴리사카라이드에 노출된 HMDM을 실험한 M1 편광 대식세포는 길쭉하고 스핀들 같은 세포 모양을 보였다. 비교를 위해, 48시간 동안 HMDM을 인터류빈 4에 노출한 후 M2 편광 대식파지의 형태는 전형적으로 둥글고 평평했다.MDM 표현형을 방출하는 차별화된 HMDM 표현형의 능력은 SYTOX 그린을 통한 살아있는 세포 형광 이미징에 의해 시각화되었다. 어떤 프로 염증 자극의 부재에서 24 시간 동안 배양 각 HMDM 표현형에서 얻은 제어는 매우 제한된 녹색 염색을 보였다. 녹색 줄무늬로 표시된 MET에 대한 긍정적 인 염색은 고압산, PMA, 인터류키 8 또는 TNF 알파에 M1-HMDM을 노출하여 달성되었습니다.세포에서 명백한 몇몇 녹색 염색의 존재는 세포 외 함정 방출의 독립적인 세포 죽음에서 유래할 수 있는 막 무결성의 손실을 반영합니다. 인터류빈 4에 노출된 M2-HMDM로 수행된 실험은 세포외 DNA의 가닥이나 줄무늬가 없는 것으로 나타난 세포로부터 DNA의 방출을 보여주지 않았다. 그러나, 저염산 및 TNF 알파를 가진 녹색 형광염염의 몇몇 세포 조리가 있었습니다.이미징 전에 얼룩을 과열시킬 수 있는 직접적인 밝은 빛을 피하는 것이 중요합니다. 세포외 DNA는 세포 상수체에 존재하는 핵 및 미토콘드리아 DNA에 대한 qPCR 분석을 통해 정량화될 수 있다. HMDM을 이용한 만성 염증의 마스 구조 및 그 역할의 추가 특성화는 다른 불멸의 세포주 대식세포 매장에 비해 임상적으로 더 관련이 있을 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

연구

면역학 및 감염병학

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...