Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en varig IMPACT Grant (IPAP201601422) og Novo nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkjenner også mottak av en australsk Postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gjerne takke Mr. Pat Pisansarakit og MS Morgan Jones for å få hjelp med monocytt isolasjon og vev kultur.

Den HMDM ble isolert fra menneskelige Buffy pels preparater levert av Blodbanken med etikk godkjenning fra Sydney Local Health District.
1. HMDM kultur
<ol><li>Isolere monocytter fra Buffy coat forberedelser tilberedt fra perifert blod av friske menneskelige donorer ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig forberedelse til å isolere lymfocytter, etterfulgt av motstrøm sentrifugal elutriation19, og 20.</li>
	<li>Bekreft tilstedevæ...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

Generering og visualisering av MET-formasjonen ved hjelp av M1 differensiert HMDMs representerer en ny in vitro-modell som kan være nyttig for å undersøke den potensielle patologiske rollen til disse macrophage strukturene, spesielt under kronisk inflammatorisk Forhold. Det gir en robust protokoll for stimulering av primære menneskelige makrofager å løslate METs, som også kan benyttes i beslektede studier med menneskelige monocytt eller murine macrophage cellelinjer. Den vellykkede gjennomføringen av denne protok...

Utgivelsen av ETs fra nøytrofile ble først identifisert som en medfødt immunrespons utløst av bakteriell infeksjon1. De består av en DNA ryggrad som ulike granule proteiner med anti-bakterielle egenskaper er bundet, inkludert nøytrofile elastase og myeloperoxidase2. Den primære rollen til nøytrofile ETs (NETs) er å fange patogener og tilrettelegge deres eliminering3. Men i tillegg til den beskyttende rollen ETs i immunforsvaret, har et økende antall studier også oppdaget en rolle i sykdoms patogenesen, spesielt under utviklingen av betennelse-drevne sykdommer (dvs. revmatoid artritt og aterosklerose4). Utgivelsen av ETS kan utløses av ulike Pro-inflammatorisk cytokiner inkludert interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (TNFα)5,6, og den lokaliserte opphopning av ETs kan øke vevsskade og fremkalle en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har vært innblandet som spiller en årsakssammenheng rolle i utviklingen av aterosklerose8, fremme trombose9, og forutsi kardiovaskulær risiko10.
Det er nå anerkjent at i tillegg til nøytrofile, andre immunceller (dvs. mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigi ETs på eksponering for mikrobiell eller Pro-inflammatorisk stimulering11,12. Dette kan være spesielt viktig i tilfelle av makrofager, vurderer deres nøkkelrolle i utvikling, regulering, og oppløsning av kroniske inflammatoriske sykdommer. Derfor er det viktig å få en større forståelse av den potensielle forholdet mellom ET Release fra makrofager og betennelse-relaterte sykdomsutvikling. Nyere studier har vist tilstedeværelsen av METs og NETs i intakte menneskelige aterosklerotiske plaketter og organiserte trombi13. På samme måte har METs vært innblandet i å kjøre nyreskader gjennom regulering av inflammatoriske reaksjoner14. Men i motsetning til nøytrofile, er det begrensede data på mekanismer for MET formasjon fra makrofager. Nyere studier med human in vitro-modeller av MET-formasjonen viser noen forskjeller på banene som er involvert i hver celle type (dvs. om fraværet av histone citrullination med makrofager)6. Men, noen har vist at NET Release kan også forekomme i fravær av histone citrullination15.
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en enkel og direkte metode for å vurdere MET utgivelse i en klinisk relevant macrophage modell. Det finnes en rekke forskjellige in vitro macrophage celle modeller som har blitt brukt til å studere METs (dvs. THP-1 menneskelige monocytt cellelinje og ulike murine macrophage cellelinjer)16. Det er noen begrensninger knyttet til disse modellene. For eksempel, differensiering av THP-1 monocytter til makrofager krever vanligvis en grunning trinn, for eksempel tilsetning av phorbol isopropylmyristat acetate (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-avhengige trasé. Denne prosessen er kjent for å utløse ET Release4 og resulterer i en lav basal oppfylt utgivelse fra THP-1 celler. Andre studier har fremhevet noen forskjeller i bioactivity og inflammatoriske responser montert av makrofager i vivo sammenlignet med PMA-behandlet THP-1 celler17.
Tilsvarende, atferd og inflammatoriske reaksjoner av forskjellige murine macrophage-lignende cellelinjer ikke helt representerer responsen spekteret av primære menneskelige makrofager18. Derfor, i den hensikt å undersøke macrophage ET formasjon i klinisk setting, primære menneskelige monocytt-avledet makrofager (HMDMs) antas å være en mer relevant modell i stedet for monocyttisk eller murine macrophage-lignende cellelinjer.
ET Release fra M1 polarisert HMDMs har blitt demonstrert etter eksponering av disse cellene til en rekke ulike inflammatoriske stimuli, inkludert myeloperoxidase-avledet oksiderende subsyrer syre (HOCl), PMA, TNFα, og IL-86. Beskrevet her er en protokoll for å polariserer HMDMs til M1 fenotype og visualisere påfølgende MET utgivelse ved eksponering for disse inflammatoriske stimuli. PMA brukes som en stimulans av MET utgivelse for å lette sammenligninger til tidligere studier som har brukt nøytrofile. Viktigere, HOCl, IL-8, og TNFα brukes også til å stimulere MET utgivelse, som antas å være bedre modeller av inflammatorisk miljø in vivo. Mikroskopisk metode for visualisering av ET Release innebærer farging av ekstracellulære DNA i levende cellekulturer bruker SYTOX grønn, en ugjennomtrengelig fluorescerende grønn nukleinsyre syre flekken som har blitt brukt i tidligere nøytrofile studier. Denne metoden gir rask og kvalitativ vurdering av ET utgivelse, men det er ikke hensiktsmessig som en frittstående metode for kvantifisering av ET Release grad. Alternative metoder bør brukes hvis kvantifisering er nødvendig for å sammenligne omfanget av ET utslipp som følge av ulike behandlings forhold eller intervensjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Utgivelsen av ekstracellulære feller (ETs) av nøytrofile har blitt identifisert som en medvirkende faktor til utvikling av sykdommer knyttet til kronisk betennelse. De nøytrofile ETs (NETs) består av et maske av DNA, histone proteiner og ulike granule proteiner (dvs. myeloperoxidase, elastase og katepsin G). Andre immunceller, inkludert makrofager, kan også produsere ETs; men i hvilken utstrekning dette skjer i vivo og om macrophage ekstracellulære feller (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer har ikke blitt undersøkt i detalj. For bedre å forstå rollen som METs i inflammatoriske patologi, ble en protokoll utviklet for å visualisere MET utgivelse fra primære menneskelige makrofager in vitro, som også kan utnyttes i immunofluorescence eksperimenter. Dette gjør at ytterligere karakterisering av disse strukturene og deres sammenligning til ETs løslatt fra nøytrofile. Humant monocytt makrofager (HMDM) produserer METs ved eksponering for ulike inflammatoriske stimuli etter differensiering til M1 Pro-inflammatorisk fenotype. Utgivelsen av METs kan bli mikroskopi ved hjelp av en grønn fluorescerende nukleinsyre syre flekk som er impermeant til levende celler (f. eks SYTOX grønn). Bruk av nylig isolerte primære makrofager, slik som HMDM, er fordelaktig i modellering in vivo inflammatoriske hendelser som er relevante for potensielle kliniske anvendelser. Denne protokollen kan også brukes til å studere MET utgivelse fra menneskelige monocytt cellelinjer (f. eks, THP-1) følgende differensiering inn makrofager med phorbol isopropylmyristat acetate eller andre macrophage cellelinjer (f. eks den murine macrophage-lignende J774A. 1 celler).

Brightfield bilder som viser morfologiske endringer av HMDM som svar på stimuli for celle differensiering er vist i figur 1. M1 polarisert makrofager fra eksperimenter med HMDM eksponert for IFNγ og LPS viste en langstrakt og spindel-lignende celle form, som indikert av de svarte pilene i figur 1 (midtre panel). Til sammenligning, morfologi av m2 polarisert makrofager etter eksponering av HMDM til IL-4 for 48 h var vanligvis rund og flat, som indikert av de sv...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Presentert her er en protokoll for å oppdage macrophage ekstracellulære felle (MET) produksjon i levende cellekultur ved hjelp mikroskopi og fluorescens farging. Denne protokollen kan videre utvides til å undersøke bestemte MET protein markører ved immunofluorescence farging.

In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Frigjøring av ekstracellulære feller av nøytrofiler og andre immunceller er viktig i medfødt immunitet, men også sterkt forbundet med inflammatoriske patologier. Svært lite er kjent om denne prosessen i makrofager selv om disse cellene spiller en kritisk rolle i inflammatorisk respons. Denne protokollen gir en primær menneskelig in vitro modell av makrofager ekstracellulær felle eller mast utgivelse.Det gir en modell for oss å studere en potensiell fysiologisk vekst av denne strukturen in vivo. Den største fordelen med denne teknikken er at cellene fra denne protokollen er primære celler isolert fra menneskelige buffy pelspreparater. Det er ingen priming trinn som kreves for å skille monocytten til makrofager, som står i kontrast til andre monocytt cellelinje som THP-1 cellelinje.Denne protokollen er lett tilpasset andre immunceller, inkludert isolert nøytrofil og microglia. Ekstracellulær felle produsert av makrofager er svært skjøre, så det må tas hensyn mellom trinn for å bevare integriteten til de beisede fellene. Under sterile forhold, forberede M1 grunning medium ved å legge til hele RPMI-1640 kultur media, interferon gamma til konsentrasjonen av 20 nanogram per milliliter og lipopolysakkarid til konsentrasjonen av ett mikrogram per milliliter.Forbered M2 priming media ved å legge interleukin 4 til hele RPMI-1640 kultur medier til konsentrasjonen av 20 nanogram per milliliter. Under sterile forhold aspirerer du medier fra de sådede og kultiverte vevskulturplatebrønnene som inneholder HMDM. Legg forsiktig inn i hver brønn, en milliliter steril PBS forvarmet til 37 grader Celsius.Fjern PBS-bufferen og vask to ekstra ganger. Legg til en milliliter av enten M1 eller M2 priming media til hver brønn som inneholder HMDM. Inkuber cellene i 48 timer ved 37 grader Celsius i nærvær av 5% karbondioksid i en celleinkubator.Under sterile forhold, forberede kulturmediene som inneholder forskjellige stimulatorer av MET utgivelsen til hele RPMI-1640 media. For eksperimenter med hypoklorsyrestimulering, lag 200 mikromos hypoklorsyre i et Falcon-rør med HBSS som er forvarmet til 37 grader Celsius. Etter polariseringsbehandlingen aspirerer cellemediet fra hver brønn og vasker forsiktig cellene tre ganger med en milliliter aliquots av enten steril PBS for PMA, TNF alfa og interleukin 8 stimulering eller HBSS for hypoklorsyrestimulering.Etter å ha fjernet PBS i det siste vasketrinnet, legg til en milliliter komplette medier som inneholder PMA, TNF alfa eller interleukin 8. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en celleinkubator i seks timer for TNF alfastimulering og 24 timer for PMA eller interleukin 8 stimulering. For eksperimenter med hypoklorsyre, etter å ha fjernet HBSS i det siste vasketrinnet, legg til en milliliter nylaget hypoklorsyre.Inkuber deretter cellene i 15 minutter ved 37 grader Celsius i nærvær av 5% karbondioksid i en celleinkubator. Etter det, nøye aspirere cellenes supernatant og vaske cellene tre ganger med en milliliter aliquots av HBSS. Når du har fjernet HBSS fra det siste vasketrinnet, legger du til en milliliter komplett RPMI-1640 kulturmedier.Inkuber deretter cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius i nærvær av 5% karbondioksid i en celleinkubator. Forbered SYTOX grønt fargestoff i HBSS med en konsentrasjon på 40 mikromos. Tilsett direkte 25 mikroliter av fargestoffet til hver brønn som inneholder HMDM.Inkuber celler ved romtemperatur i 5 minutter i mørket. Plasser deretter HMDM i vevskulturbrønner på mikroskopstadiet til et omvendt fluorescerende mikroskop for avbildning. Slå på en bredspektret fluorescerende lyskilde, lysfeltlyskilde og invertert mikroskop installert med et høyoppløselig farge digitalkamera.Drei filterhjulet til nummer to posisjon for grønn fluorescens med eksitasjon på 504 nanometer og dimensjon på 523 nanometer. Bruk 5X-målet til å fokusere bildet med det grove fokuset og deretter de fine fokusknottene på mikroskopet til bildet ser skarpt, klart og fokusert ut. Bytt mikroskopet til kameramodus.Start den tilknyttede programvaren. Klikk på Spill av-knappen for å forhåndsvise bildet og justere finfokusknappen på mikroskopet til bildet vises skarpt, klart og fokusert i forhåndsvisningsvinduet for programvaren. Klikk på Capture-knappen.Klikk Fil i programvaren. Lagre som ønsket bildefiltype. På mikroskopet roterer du filterhjulet til nummer fem-posisjonen for bildebehandling på lysfelt, og gjentar opptaksprosedyrene for å få det tilsvarende lysfeltbildet.Bright-field bilder som viser de morfologiske endringene av HMDM som svar på stimuli er vist her. M1-polariserte makrofager fra eksperimenter med HMDM utsatt for interferon gamma og lipopolysakkarid viste en langstrakt og spindellignende celleform. Til sammenligning var morfologien til de M2-polariserte makrofagene etter eksponering av HMDM til interleukin 4 i 48 timer vanligvis runde og flate.Evnen til differensierte HMDM fenotyper for å frigjøre METs ble visualisert ved live-celle fluorescens imaging med SYTOX grønn. Kontrollen hentet fra hver HMDM fenotype inkubert i 24 timer i fravær av noen pro-inflammatoriske stimuli viste svært begrenset grønn farging. Positiv farging for METs, vist som grønne striper, ble oppnådd ved eksponering av M1-HMDMs til hypoklorsyre, PMA, interleukin 8 eller TNF alfa.Tilstedeværelsen av noen grønne flekker tydelig i cellene gjenspeiler tap av membran integritet som kan skyldes celledød som er uavhengig av ekstracellulær felle utgivelse. Forsøkene utført med M2-HMDMs utsatt for interleukin 4 viste ingen frigjøring av DNA fra cellene, som indikert ved fravær av tråder eller striper av ekstracellulært DNA. Det var imidlertid noe cellulært opptak av grønt fluorescerende fargestoff med hypoklorsyre og TNF alfa.Det er viktig å unngå direkte sterkt lys som kan overeksponere fargingen før avbildning. Ekstracellulært DNA kan kvantifiseres ved qPCR-analyse på kjernefysisk og mitokondrie-DNA tilstede i cellesupernatant. Videre karakterisering av maststruktur og dens roller i kronisk betennelse ved hjelp av HMDM kan være mer klinisk relevant i forhold til andre udødeliggjorte cellelinje makrofager butikker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Høy gjennomstrømning Måling av ekstracellulært DNA Slipp og kvantitative NET-formasjonen i Human Neutrophils<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel Fluorescens analyse for Kvantifisering av Canine nøytrofile ekstracellulær felle utløsning

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...