Name: in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) och Novo Nordisk Foundation Biomedicinskt projekt Grant (NNF17OC0028990). YZ erkänner också mottagandet av en australisk doktorand utmärkelse från University of Sydney. Vi skulle vilja tacka Mr Pat pisansarakit och MS Morgan Jones för hjälp med monocyt isolering och vävnad kultur.

Den HMDM isolerades från Human Buffy Coat preparat som tillhandahålls av Blodbanken med etik godkännande från Sydney Local Health District.
1. HMDM kultur
<ol><li>Isolera monocyterna från Buffy Coat preparat som framställts av perifert blod av friska humana givare med hjälp av en kommersiellt tillgänglig beredning för att isolera lymfocyter, följt av motströms centrifugalelutriation19, 20.</li>
	<li>Bekräfta närvaron av...

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation:+implication+for+the+inflammatory+disease+condition.">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).</li><li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hypochlorous+acid+(HOCl)+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation.">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li><li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival.">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis.">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li><li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis.">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li><li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk.">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li><li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+world+of+extracellular+traps:+not+only+neutrophils+but+much+more.">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li><li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+derived+from+macrophages,+mast+cells,+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis.">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li><li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury.">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Extracellular+Traps:+A+Scoping+Review.">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li><li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages.">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li><li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production.">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li><li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+&#176;C+to+35+&#176;C.">The acid ionization constant of HOCl from 5 &#176;C to 35 &#176;C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li><li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid.">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li></ol>

Generering och visualisering av MET formation med hjälp av M1 differentierade HMDMs representerar en ny in vitro-modell som kan vara användbara för att undersöka den potentiella patologiska roll dessa makrofagstrukturer, särskilt under kroniska inflammatoriska Villkor. Det ger ett robust protokoll för stimulering av primära mänskliga makrofager att frigöra METs, som också kan utnyttjas i relaterade studier med Human monocyt eller murin makrofage cellinjer. Det framgångsrika genomförandet av detta protokoll f?...

Frisläppandet av ETs från neutrofiler identifierades först som ett medfödda immunsvar utlöst av bakteriell infektion1. De består av en DNA-ryggrad som olika granule proteiner med anti-bakteriella egenskaper är bundna, inklusive neutrofila elastase och myeloperoxidas2. Den primära rollen för neutrofila (NETs) är att fånga patogener och underlätta deras eliminering3. Men förutom den skyddande roll ETs i immunförsvaret, ett ökande antal studier har också upptäckt en roll i sjukdomens patogenes, särskilt under utvecklingen av inflammations drivna sjukdomar (dvs., reumatoid artrit och åderförkalkning4). Frisläppandet av ETS kan utlösas av olika pro-inflammatoriska cytokiner inklusive interleukin 8 (Il-8) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα)5,6, och den lokaliserade ansamling av ETS kan öka vävnadsskada och framkalla en Pro-inflammatoriskt svar7. Till exempel, ETs har varit inblandade som spelar en kausala roll i utvecklingen av åderförkalkning8, främja trombos9, och förutsäga kardiovaskulär risk10.
Det är nu erkänt att förutom neutrofiler, andra immunceller (dvs mastceller, eosinofiler, och makrofager) kan också släppa ETS på exponering för den mikrobiella eller pro-inflammatorisk stimulering11,12. Detta kan vara särskilt betydelsefullt när det gäller makrofager, med tanke på deras centrala roll i utvecklingen, regleringen och lösningen av kroniska inflammatoriska sjukdomar. Därför är det viktigt att få en större förståelse för den potentiella relationen mellan ET release från makrofager och inflammation-relaterade sjukdomsutveckling. Nyligen genomförda studier har visat närvaron av METs och nät i intakt mänskliga aterosklerotiska plack och organiserade Trombi13. På samma sätt har METs varit inblandade i att köra njurskada genom regleringen av inflammatoriska svar14. Men i motsats till neutrofiler, det finns begränsade data om mekanismerna för MET formation från makrofager. Nyligen genomförda studier med humana in vitro-modeller av met formation visar några skillnader i de vägar som ingår i varje celltyp (dvs., om avsaknaden av Histon citrullination med makrofager)6. Emellertid, vissa har visat att netto frisättning kan också förekomma i avsaknad av Histon citrullination15.
Det övergripande målet med detta protokoll är att ge en enkel och direkt metod för att bedöma MET release i en kliniskt relevant makrofagmodell. Det finns ett antal olika in vitro-makrofagceller modeller som har använts för att studera Mets (dvs, den THP-1 Human monocyt cellinjer och olika murin makrofage cellinjer)16. Det finns vissa begränsningar i samband med dessa modeller. Till exempel, differentiering av THP-1 monocyter till makrofager kräver vanligtvis en priming steg, såsom tillsats av phorbol myristate acetat (PMA), som själv aktiverar proteinkinas C (PKC)-beroende vägar. Denna process är känd för att utlösa ET release4 och resulterar i en låg basal met release från THP-1 celler. Andra studier har belyst vissa skillnader i bioaktivitet och inflammatoriska reaktioner monterade av makrofager in vivo jämfört med PMA-behandlade THP-1-celler17.
På samma sätt representerar beteendet och inflammatoriska reaktioner av olika murina makrofage-liknande cellinjer inte helt svaret spektrum av primära mänskliga makrofager18. Därför, i syfte att utreda makrofaget bildas i den kliniska inställningen, primära humana monocyte-härledda makrofager (HMDMs) tros vara en mer relevant modell snarare än monocytiska eller murina makrofage-liknande cellinjer.
ET release från M1 polariserade HMDMs har visats efter exponering av dessa celler till ett antal olika inflammatoriska stimuli, inklusive myeloperoxidas-derived antioxidant hypoklorös syra (HOCl), PMA, TNFα, och IL-86. Beskrivs här är ett protokoll för att polarisera HMDMs till M1 fenotyp och visualisera efterföljande MET release vid exponering för dessa inflammatoriska stimuli. PMA används som en stimulans av MET release för att underlätta jämförelser med tidigare studier som har använt neutrofiler. Viktigt, HOCl, IL-8, och TNFα används också för att stimulera MET release, som tros vara bättre modeller av den inflammatoriska miljön in vivo. Den mikroskopiska metoden för visualisering av ET release innebär färgning av extracellulära DNA i levande cellkulturer med hjälp av SYTOX Green, en ogenomtränglig fluorescerande grön nukleinsyra fläck som har framgångsrikt tillämpats i tidigare neutrofila studier. Denna metod möjliggör snabb och kvalitativ bedömning av ET-frisättning, men det är inte lämpligt som en fristående metod för kvantifiering av ET-frigöringsgrad. Alternativa metoder bör användas om kvantifieringen krävs för att jämföra omfattningen av ET-frisättningen till följd av olika behandlings villkor eller interventioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120Q broad spectrum fluorescent light source</td>
			<td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3336</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>24606</td>
			<td>Characterisation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14025050</td>
			<td>For washing steps and HOCl treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypochlorous acid (HOCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon gamma</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>PMC4031</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 4</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>rhil-4</td>
			<td>For M2 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin 8</td>
			<td>Miltenyl Biotec</td>
			<td>130-093-943</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59202C</td>
			<td>Added to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Integrated Sciences</td>
			<td>tlrl-eblps</td>
			<td>For M1 priming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td>1114544</td>
			<td>For isolation of monocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>For washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>For MET visulaization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-200 brightfield light source</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>x-cite series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>300-01A-50</td>
			<td>For MET stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro stimulation and visualization of extracellular trap release in differentiated human monocyte-derived macrophages

Frisläppandet av extracellulära fällor (ETs) av neutrofiler har identifierats som en bidragande faktor till utvecklingen av sjukdomar relaterade till kronisk inflammation. Neutrofila eter (NETs) består av ett nät av DNA, histonproteiner, och olika granule proteiner (dvs., myeloperoxidas, elastase, och cathepsin G). Andra immunceller, inklusive makrofager, kan också producera ETs; men i vilken utsträckning detta sker in vivo och om makrofagextracellulära fällor (METs) spelar en roll i patologiska mekanismer har inte undersökts i detalj. För att bättre förstå den roll som METs i inflammatoriska sjukdomar, ett protokoll utvecklades för att visualisera MET release från primära mänskliga makrofager in vitro, som också kan utnyttjas i immunofluorescensexperiment. Detta möjliggör ytterligare karakterisering av dessa strukturer och deras jämförelse med ETs frigörs från neutrofiler. Humana monocyte-härledda makrofager (HMDM) producerar METs vid exponering för olika inflammatoriska stimuli efter differentiering till M1 pro-inflammatorisk fenotyp. Frisättningen av METs kan visualiseras genom mikroskopi med hjälp av en grön fluorescerande nukleinsyrafotsfläck som är okänsliggjort för levande celler (t. ex. SYTOX Green). Användning av nyligen isolerade primära makrofager, såsom HMDM, är fördelaktigt vid modellering in vivo inflammatoriska händelser som är relevanta för potentiella kliniska tillämpningar. Detta protokoll kan också användas för att studera met release från Human monocyt cellinjer (t. ex., THP-1) efter differentiering till makrofager med phorbol myristate acetat eller andra makrofagcellinjer (t. ex., den murina makrofage-liknande J774A. 1 celler).

Brightfield-bilder som visar de morfologiska förändringarna av HMDM som svar på stimuli för celldifferentiering visas i figur 1. M1 polariserade makrofager från experiment med HMDM som exponerats för IFNγ och LPS visade en långsträckt och spindelliknande cell form, vilket indikeras av de svarta pilarna i figur 1 (Mittenpanelen). För jämförelse, morfologin av m2 polariserade makrofager efter exponering av HMDM till IL-4 för 48 h var typiskt runda och...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages at JoVE.com

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka makrofag extracellulära Trap (Met) produktion i levande cellkultur med hjälp av mikroskopi och fluorescens färgning. Detta protokoll kan utökas ytterligare för att undersöka specifika MET-proteinmarkörer genom färgning av immunofluorescensteknik.

In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Frisättningen av extracellulära fällor av neutrofiler och andra immunceller är viktigt med medfödd immunitet men också starkt kopplat till inflammatoriska patologier. Mycket lite är känt om denna process i makrofager även om dessa celler spelar en avgörande roll i inflammatoriska svar. Detta protokoll ger en primär mänskliga in vitro-modell av makrofager extracellulära fälla eller mast release.Det ger en modell för oss att studera en potentiell fysiologisk tillväxt av denna struktur in vivo. Den största fördelen med denna teknik är att cellerna från detta protokoll är primära celler isolerade från mänskliga buffy coat preparat. Det finns ingen priming steg som krävs för att differentiera monocyten i makrofager, vilket är kontrast med andra monocyter cellinje såsom THP-1 cellinje.Detta protokoll är lätt anpassas till andra immunceller inklusive isolerade neutrofil och microglia. Extracellulär fälla som produceras av makrofager är mycket bräckliga, så bryr måste tas mellan steg för att bevara integriteten hos de färgade fällor. Under sterila förhållanden, förbereda M1 priming medium genom att till den kompletta RPMI-1640 kulturmedier, interferon gamma till koncentrationen av 20 nanogram per milliliter och lipopolysackarid till koncentrationen av ett mikrogram per milliliter.Förbered M2 priming media genom att lägga till interleukin 4 till den kompletta RPMI-1640 kultur media till koncentrationen av 20 nanogram per milliliter. Under sterila förhållanden aspirerar man från de sådde och odlade vävnadskulturplattans brunnar som innehåller HMDM. Tillsätt försiktigt i varje brunn, en milliliter steril PBS förvörd till 37 grader Celsius.Ta bort PBS-bufferten och tvätta ytterligare två gånger. Tillsätt en milliliter av antingen M1 eller M2 priming media till varje brunn som innehåller HMDM. Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cellinkubator.Under sterila förhållanden, förbereda den kultur media som innehåller olika stimulatorer av MET release till den kompletta RPMI-1640 media. För experiment med hypokloös syra stimulering, förbereda 200 mikromolar hypokloös syra i en Falcon rör med HBSS som har förvämrats till 37 grader Celsius. Efter polarisationsbehandlingen aspirerar du cellmedierna från varje brunn och tvättar försiktigt cellerna tre gånger med en milliliter-alikvoter av antingen steril PBS för PMA, TNF alfa och interleukin 8 stimulering eller HBSS för hypokloös syrastimulering.När du har tagit bort PBS i det slutliga tvättsteget, tillsätt en milliliter av kompletta medier som innehåller PMA, TNF alfa eller interleukin 8. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i en cellinkubator i sex timmar för TNF alfastimulering och 24 timmar för PMA eller interleukin 8 stimulering. För experiment med hypokloös syra, efter att ha tagit bort HBSS i det slutliga tvättsteget, tillsätt en milliliter nyberedda hypokloössyra.Sedan inkubera cellerna i 15 minuter vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cellinkubator. Därefter aspirerar försiktigt cellernas supernatant och tvättar cellerna tre gånger med en milliliter alikvoter av HBSS. När HBSS har tagits ut från det sista tvättsteget, tillsätt en milliliter komplett RPMI-1640-odlingsmedia.Sedan inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 grader Celsius i närvaro av 5%koldioxid i en cell inkubator. Förbered SYTOX grönt färgämne i HBSS vid en koncentration av 40 mikromolar. Direkt tillsätt 25 mikroliter av färgämnet till varje brunn som innehåller HMDM.Inkubera celler i rumstemperatur i 5 minuter i mörker. Placera sedan HMDM i vävnadskultur brunnar på mikroskopet skede av en inverterad fluorescerande mikroskop för avbildning. Slå på en bredspektrum fluorescerande ljuskälla, ljuskälla på ljusa fält och inverterat mikroskop installerat med en högupplöst digitalkamera i färg.Rotera filterhjulet till nummer två-positionen för grön fluorescens med excitation vid 504 nanometer och dimension vid 523 nanometer. Använda 5X objektivet, fokusera bilden med grov fokus sedan den fina fokus knoppar på mikroskopet tills bilden visas skarpa, tydliga och fokuserade. Växla mikroskopet till Kameraläge.Starta den tillhörande programvaran. Klicka på knappen Spela upp för att förhandsgranska bilden och justera den fina fokusratten på mikroskopet tills bilden visas skarp, tydlig och fokuserad i fönstret för förhandsgranskning av programvara. Klicka på capture-knappen.Klicka på Arkiv inom programvaran. Spara som den nödvändiga bildfiltypen. På mikroskopet roterar du filterhjulet till nummer fem-positionen för avbildning med ljusa fält och upprepar infångningsprocedurerna för att erhålla motsvarande ljusfältsbild.Ljusa fältbilder som visar de morfologiska förändringarna av HMDM som svar på stimuli visas här. M1-polariserade makrofager från experiment med HMDM utsätts för interferon gamma och lipopolysaccharide visade en långsträckt och spindel-liknande cell form. Som jämförelse var morfologi m2-polariserade makrofager efter exponering av HMDM till interleukin 4 för 48 timmar vanligtvis runda och platta.Förmågan hos differentierade HMDM fenotyper att släppa METs visualiserades av levande-cell fluorescens imaging med SYTOX grön. Kontrollen erhålls från varje HMDM fenotyp inkuberas i 24 timmar i avsaknad av eventuella pro-inflammatoriska stimuli visade mycket begränsad grön färgning. Positiv färgning för METs, som visas som gröna streck, uppnåddes med exponering av M1-HMDM för hypokloös syra, PMA, interleukin 8 eller TNF alfa.Förekomsten av vissa gröna färgning uppenbara i cellerna återspeglar förlust av membran integritet som kan resultera från celldöd som är oberoende av extracellulära fällan release. Experimenten som utfördes med M2-HMDMs exponerade för interleukin 4 visade ingen frisättning av DNA från cellerna, vilket indikeras av frånvaron av strängarna eller streck av extracellulärt DNA. Det fanns dock några cellulära upptag av gröna fluorescerande färgämne med hypokloous syra och TNF alfa.Det är viktigt att undvika det direkta starka ljuset som kan överexponera färgningen innan avbildning. Extracellulära DNA kan kvantifieras genom qPCR analys på nukleära och mitokondriellt DNA som finns i cellen supernatant. Ytterligare karakterisering av mast struktur och dess roller i kronisk inflammation med hjälp av HMDM kan vara mer kliniskt relevant i jämförelse med andra förevigade celllinje makrofager butiker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hög genomströmning Mätning av extracellulärt DNA utsläpp och Kvantitativ NET bildning i humana neutrofiler<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag kolonistimulerande faktor Differentierad Human Monocyte-härledda makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

En enkel fluorescensanalys för kvantifiering av Canine neutrofila Extracellulär Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analys av Microglia och monocyt-härledda makrofager från det centrala nervsystemet genom flödescytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...