Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

نشكر كريستين أورين ويان أ. م. سوشوريك على مساعدتهما في الأساليب التجريبية.

وتتبع جميع الإجراءات المتعلقة بالأنسجة الحيوانية المبادئ التوجيهية للجنة المحلية لرعاية الحيوان وأخلاقياته.
1. إعداد ثقافة الجهاز والعلاج بالليزر
<ol><li>الحصول على عيون porcine المهول ة الطازجة من المسلخ المحلي. الاحتفاظ بها باردة (4 درجات مئوية) في جلوج جلكو المعدلة المتوسطة (D...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease.">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li><li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell.">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047 (2016).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty.">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li><li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy.">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li><li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium.">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation.">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li><li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery:+a+preliminary+report.">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li><li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium:+YAG+lasers.">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li><li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+Nd:YAG+laser+surgery:+laser-tissue+interaction,+damage+range,+and+reduction+of+collateral+effects.">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li><li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro.">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing.">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+histological+and+permeability+evaluation.">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li><li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas.">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li><li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells.">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).</li><li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

تشير نتائج هذه الدراسة التجريبية إلى أنه يمكن استخدام ليزر Nd:YAG لإزالة الخلايا الانهوائية القرنية بشكل انتقائي عند اختيار المعلمات المناسبة لجرعة الطاقة ووضع نقطة التركيز.
بما أن وظيفة الانهوبيليال مهمة لشفافية القرنية وحماية القرنية من الوذمة سترومال ، تلعب نماذج الخلل ?...

شفافية القرنية أمر ضروري لنقل الضوء إلى شبكية العين ومستقبلاتها الضوئية1. في هذا الصدد ، فإن الحالة النسبية للجفاف أمر بالغ الأهمية للحفاظ على ألياف الكولاجين داخل ستروما القرنية محاذاة بشكل صحيح. يتم الحفاظ على هذا التوازن بواسطة خلايا بطانة القرنية (CEC) الموجودة على غشاء Descemet (DM)2. الإندوثيوليوم هو طبقة القرنية الأعمق. لديها حاجز مهم وظيفة مضخة، وهو أمر حاسم لشفافية القرنية3. على النقيض من ظهارة ، البطانة ليست قادرة على تجديد الذات4. لذلك ، فإن أي تلف في الخلايا يسببه المرض أو الصدمة يحفز الخلايا الانهوفية المتبقية على التكبير والهجرة ، لتغطية العيوب الناتجة والحفاظ على وظائف القرنية5. ومع ذلك ، إذا كانت كثافة CEC تقع تحت عتبة حرجة ، فإن فك تعويض البطانة يؤدي إلى وذمة ، مما يؤدي إلى عدم وضوح الرؤية وعدم الراحة أو حتى الألم الشديد4. على الرغم من توافر الأدوية لتخفيف الأعراض ، إلا أن العلاج النهائي الوحيد في هذه الحالات هو زرع القرنية ، والتي يمكن إجراؤها في شكل ترقيع كامل السماكة أو زرع الانهوثيلية الأعرج. الإجراء الأخير متاح كما Descemet الغشاء القرنية البطانة (DMEK) وكذلك Descemet تجريد الآلي بطانة القرنية (DSAEK)6. ومع ذلك، فإن حماية ما تبقى من لجنة CEC وتعزيز بقائها يمكن أن يكون هدفا بديلا، الذي يحتاج إلى نموذج مرض مناسب لاختبار الأدوية العلاجية المحتملة.
تركز نماذج مرض فقدان CEC الحالية على تدمير البطانة من خلال حقن العوامل السامة (على سبيل المثال، كلوريد البنزالكونيوم) في الغرفة الرضعة أو عن طريق الكشط الميكانيكي للخلايا باستخدام تقنية descemetorhexis الغازية7،8. وفي حين أن هذه النماذج راسخة، فإن هناك مساوئ مثل الاستجابة الالتهابية العامة والأضرار الجانبية غير الدقيقة. لذلك ، من المرجح أن تمثل هذه النماذج المراحل النهائية للمرض ، عندما تكون الخيارات الجراحية المذكورة أعلاه حتمية.
مع التقدم في استراتيجيات العلاج الخلوي مثل الخلايا الجذعية والعلاج الجيني ، يمكن أن يكون تطبيق هذه العلاجات الخلوية مفيدًا في المراحل المبكرة من خسارة CEC9. وفي وقت لاحق، نحتاج إلى نموذج يمثل هذه المراحل المبكرة من المرض على نحو أكثر ملاءمة. في هذا الصدد، وقد تحسنت نماذج ثقافة الخلية على مدى العقد الماضي ولكن لا تزال محدودة في صحتها، والخلايا في المختبر لا يمكن أن تقترب من تكرار التفاعلات المعقدة التي تحدث بين أنواع الخلايا المختلفة داخل القرنية10. لذلك ، لا تزال نماذج المرض على سبيل الفيو وفي الجسم الحي في ارتفاع الطلب وتحسين النماذج الموجودة هو من أقصى الأهمية.
غير الغازية, جراحة داخل العين عن طريق photodisruption باستخدام النيوديميوم: YAG (Nd:YAG) أصبح الليزر إجراء روتيني لأطباء العيون في جميع أنحاء العالم منذ عرضه في أواخر 1970s11. يعتمد التعطيل الضوئي على امتصاص الضوء غير الخطي مما يؤدي إلى تشكيل البلازما ، وتوليد موجات الصدمة الصوتية ، وإنشاء فقاعات التجويف ، كلما يقع موقع التطبيق في بيئة سائلة12. بشكل عام ، تساهم هذه العمليات في التأثير المقصود لقطع الأنسجة الدقيقة. ومع ذلك ، فإنها يمكن أيضا أن تكون مصدرا للأضرار الجانبية غير الضرورية التي تحد من الحبس المحلي لجراحة الليزر13.
وقد تحسن التنبؤ بالآثار الميكانيكية الناتجة بشكل كبير من خلال توصيف مسار انتشار موجة الصدمة والتجويف. هدفنا هو استهداف CEC بأقل قدر ممكن من الضرر للأنسجة المحيطة لتوفير نموذج مرض تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر للمراحل المبكرة من فقدان CEC. لهذا الغرض ، من الضروري تحديد طاقات النبض المثلى ومواقف البقع البؤرية للليزر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

وقد استخدمت ليزر YAG لإجراء جراحة داخل العين غير الغازية، مثل قطع المناظير لعدة عقود حتى الآن. يعتمد التأثير القاطع على الأعطال البصرية في التركيز بالليزر. يتم إنشاء موجات الصدمة الصوتية وفقاعات التجويف ، مما تسبب في تمزق الأنسجة. أحجام فقاعة ووسعة الضغط تختلف مع طاقة النبض وموقف النقطة المحورية. في هذه الدراسة، تم وضع عيون porcine enucleated أمام ليزر Nd:YAG المتاحة تجاريا. تم اختبار طاقات النبض المتغيرة وكذلك المواقف المختلفة للبقع البؤرية الخلفية للقرنية. تم تقييم الآفات الناتجة عن ذلك بواسطة المجهر الفوتون ين وعلم الأنسجة لتحديد أفضل المعلمات لمفرزة حصرية من الخلايا الانفية القرنية (CEC) مع الحد الأدنى من الأضرار الجانبية. مزايا هذه الطريقة هي الاستئصال الدقيق لCEC ، وتقليل الأضرار الجانبية ، وقبل كل شيء ، العلاج غير المتصل.

باستخدام الإجراء المعروض هنا، عالجنا العينين بليزر Nd:YAG، وتقييم طاقات النبض المختلفة (1.0-4.6 مليون جول) ومواقف النقاط المحورية (المسافة من السطح الخلفي للقرنية: 0.0-0.2 مم) للعثور على المعلمات المثلى. تم تقييم النسخ المتماثلة المتعددة (n = 3) لكل كوكبة من معلمات الليزر (12 × 21).
بالإضا?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

هنا، نقدم بروتوكولا لفصل الخلايا الانفية القرنية (CEC) من غشاء Descemet (DM) باستخدام النيوديميوم: YAG (Nd:YAG) ليزر كنموذج مرض الجسم الحي السابق لاعتلال القرنية المغرور (BK).

تطوير نموذج تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر لفقدان الخلايا الانهوفية القرنية

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

تركز نماذج المرض الحالية لفقدان الخلايا البطانية القرنية على تدمير بطانة الغدد العضلية وعلى الأرجح تمثل المراحل النهائية للمرض عندما يكون زرع القرنية أمرًا حتميًا. ومع ذلك، تتوفر الآن علاجات جديدة باستخدام الخلايا الجذعية أو العلاج الجيني يمكن أن تكون أكثر فائدة للمراحل المبكرة من المرض، والتي تفتقر إلى النماذج. جراحة العين غير الباضعة عن طريق التصوير الضوئي باستخدام ليزر Nd:YAG أصبح إجراء روتيني لأطباء العيون.بعد الحصول على عيون بورسين مُنْخَب حديثاً من المسلخ المحلي، ضع العينات في أربع درجات مئوية متوسطة كاملة. استخدام مقص لإزالة الأنسجة خارج الخلية ونقع العينين في 5٪ povidone اليود محلول العيون لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع العينات المطهرة في برنامج تلفزيوني معقمة في درجة حرارة الغرفة.باستخدام جهاز التصوير المقطعي البصري للنطاق الطيفي ، افحص العينين للأمراض الرئيسية في الجزء الأمامي مثل تندب القرنية والوذمة والعتامات الأخرى. بعد الفحص، ضع العينين أمام وحدة مصباح زلة مجهزة ليزر Nd:YAG مع طول موجي من 1، 064 نانومتر وقطر بقعة محورية من 10 ميكرومتر في الهواء. حدد التكبير 12X وحرف الإضاءة لتصور طبقات القرنية الفردية.بعد وضع طاقة النبض والتركيز تشير إلى المعلمات المناسبة للاستئصال الانتقائي للخلايا البطانية القرنية، وتطبيق عدة طلقات ليزر على الأنسجة. ثم تحت المجهر تشريح، وضع القرنية شفافة واضحة على مقربة من limbus وحقن الفيسكويلاستيك لتحقيق الاستقرار في الغرفة الأمامية. ثم استخدام 000 000 000 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000عندما تم جمع كل من القرنيات، إضافة ثلاثة ملليمترات من المتوسط الكامل لكل عينة جيدا واحتضان العينات لمدة تصل إلى ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استبدال المتوسطة في كل بئر مع الميثانول خالية من 4٪ شبهformaldehyde في العازلة سورنسن لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، ضع العينات الثابتة في 20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة تقريبا حتى تغرق القرنيات.نقل العينات إلى 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها قبل تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. استخدام مجموعة التبريد إلى ناقص 27 درجة مئوية للحصول على 10 ميكرومتر سميكة أجزاء من الأنسجة المجمدة جمع كل قسم على شريحة المجهر في غضون دقيقة واحدة من الحصول عليها. ثم تخزين الشرائح في ناقص 80 درجة مئوية حتى تلطيخ.للهماتروسيلين ويوسين تلطيخ، والهواء الجاف الأجزاء المجمدة لعدة دقائق لإزالة الرطوبة قبل تلطيخ مع تصفية 0.1٪ الهماوكسيلين ماير لمدة 10 دقائق في أنبوب 50 ملليلتر. في نهاية الحضانة، شطف الشرائح في الماء المقطر مزدوجة لمدة خمس دقائق في cuvette. بعد ذلك، تراجع الشرائح في 0.5٪ eosin 10 مرات، تليها تراجع الشطف في الماء المقطر مزدوجة حتى توقف eosin streaking.تراجع الشرائح المشطفة 10 مرات في 50٪ الإيثانول و 10 مرات في 70٪ الإيثانول. بعد تراجع الإيثانول 70٪ الماضي، اكويئية الأقسام في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية، تليها 60 ثانية في 100٪ الإيثانول قبل عدة تراجعات في إكسيلين. ثم جبل العينات مع الأغطية قبل الحصول على الصور على المجهر الخفيف.يجب تقييم صورتين ضوئيتين وصورة مجهرية خفيفة بشكل مستقل على أنه لا ضرر أو ضرر كبير أو كمية صحيحة من الضرر. وبناء على هذه التقييمات، يمكن بعد ذلك حساب خريطة حرارية لتحديد الكوكبة الصحيحة من معلمات الليزر للاستئصال الانتقائي للخلايا البطانية القرنية مع الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة. وقد حدد التحليل السابق أن النقطة المحورية بالليزر يجب أن تكون على الأقل 0.15 ملليمتر وراء الدوس القرنية لأدنى طاقة نبض اختبارها.بالنسبة لطاقات النبض أعلى من 2.9 ملليجول، فإن أطول مسافة بؤرية تم اختبارها لا تزال قريبة جدًا من بطانة الغدد. يمكن اختبار مختلف العوامل cytoprotective بينما عينات ختان في الثقافة. إذا ثبت نجاحها، يمكن إضافتها إلى محلول الري للعلاج.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

زرع مثلي الأورطي : نموذج الفأر لدراسة تطوير المزمنة اعتلال وعائي

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

القرنية تحضير الأنسجة من الجهات المانحة لغشائي keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

والقلوي حرق الإصابات نموذج من القرنية اتساع الأوعية الدموية في ماوس

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

الفئران زرع القرنية: نموذج لدراسة الشكل الأكثر شيوعا من الصلبة زراعة الأعضاء

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

القرنية تحضير الأنسجة المانحة لديسميه غشاء القرنية غشائي

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Evaluation of a Novel Laser-assisted Coronary Anastomotic Connector - the Trinity Clip - in a Porcine Off-pump Bypass Model

تقييم رواية الليزر بمساعدة التاجي توصيلي موصل - الثالوث كليب - في لحم الخنزير خارج مضخة تجاوز نموذج

To simplify and facilitate beating heart (i.e., off-pump), minimally invasive coronary artery bypass surgery, a new coronary anastomotic connector, the ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

العصبية زرع الخلايا الجذعية في التجريبية Contusive نموذج من إصابة الحبل الشوكي

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

وحديثي الولادة ماوس الحبل الشوكي ضغط إصابة نموذج

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

في فيفو تتبع من تطوير وذمة والأمراض الوعائية الوعائية في نموذج من الملاريا الدماغية التجريبية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

نموذج تجريبي لمتلازمة التمثيل الغذائي الناجمة عن النظام الغذائي في الأرانب: الاعتبارات المنهجية، والتنمية، والتقييم

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...