Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjælp med eksperimentelle metoder.

Alle procedurer, der involverer animalsk væv, følger retningslinjerne fra den lokale dyrepleje- og etiske komité.
1. Forberedelse af organkultur og laserbehandling
<ol><li>Få frisk enucleated svin øjne fra det lokale slagteri. Hold dem afkøles (4 °C) i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med høj glukose, suppleret med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), og svineserum (10%), fremover benævnt i denne artikel som fuld medium.</li>
	<li>Fjern ekstracellulær...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease.">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li><li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell.">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047 (2016).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty.">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li><li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy.">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li><li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium.">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation.">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li><li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery:+a+preliminary+report.">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li><li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium:+YAG+lasers.">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li><li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+Nd:YAG+laser+surgery:+laser-tissue+interaction,+damage+range,+and+reduction+of+collateral+effects.">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li><li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro.">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing.">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+histological+and+permeability+evaluation.">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li><li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas.">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li><li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells.">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).</li><li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Resultaterne af denne pilotundersøgelse viser, at en Nd:YAG-laser kan anvendes til selektivt at ablate hornhinde endotelceller, når der vælges passende parametre for energidosis og fokuspunktsposition.
Da endotelfunktionen er vigtig for hornhindens gennemsigtighed og beskyttelse af hornhinden mod stromale ødem, spiller modeller af endoteldysfunktion en vigtig rolle i udviklingen af anti-ødemerende lægemidler eller kirurgiske procedurer. Der er flere etablerede in vitro modeller til efter...

Gennemsigtighed af hornhinden er afgørende for transmission af lys til nethinden og dens fotoreceptorer1. I denne henseende er en relativ tilstand af dehydrering afgørende for at holde kollagen fibre i hornhinden stroma korrekt justeret. Denne homøostase vedligeholdes af hornhindeens endotelceller (CEC), der er placeret på Descemets membran (DM)2. Endotel er det inderste hornhindelag. Det har en vigtig barriere og pumpe funktion, som er afgørende for hornhinde gennemsigtighed3. I modsætning til epitel, endotel er ikke i stand til selvforny4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaget af sygdom eller traumer de resterende endotelceller til at forstørre og migrere, for at dække resulterende defekter og for at opretholde hornhindens funktionalitet5. Men hvis CEC tæthed falder til under en kritisk tærskel, decompensation af endotel fører til et ødem, resulterer i sløret syn og ubehag eller endda alvorlige smerter4. På trods af tilgængeligheden af lægemidler til at lindre symptomerne, i øjeblikket den eneste endelige behandling i disse tilfælde er hornhinde transplantation, som kan udføres i form af en fuld tykkelse graft eller en lamel endotel transplantation. Sidstnævnte procedure er tilgængelig som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemet's stripping automatiseret endotel keratoplasty (DSAEK)6. Men beskyttelsen af resterende CEC og forbedre deres overlevelse kunne være et alternativt mål, som har brug for en passende sygdommodel til at teste potentielle terapeutiske lægemidler.
De nuværende CEC-tabssygdomsmodeller fokuserer på ødelæggelse af endotel ved injektion af giftige agenser (f.eks. benzalkoniumchlorid) i det forreste kammer eller ved mekanisk slid af cellerne ved hjælp af en invasiv descemetorhexis-teknik7,8. Mens disse modeller er veletablerede, ulemper såsom generel inflammatorisk respons og upræcise følgeskader findes. Derfor er disse modeller er mere tilbøjelige til at repræsentere de sidste stadier af sygdommen, når de ovennævnte kirurgiske muligheder er uundgåelige.
Med fremskridt inden for cellulære behandlingsstrategier såsom stamceller og genterapi kan anvendelsen af disse cellulære behandlinger være nyttig i de tidlige stadier af CEC-tab9. Derefter har vi brug for en model, der repræsenterer disse tidligere stadier af sygdommen mere hensigtsmæssigt. I denne henseende er cellekulturmodellerne blevet bedre i løbet af det seneste årti, men er stadig begrænset i deres gyldighed, da celler in vitro ikke kan komme tæt på at gentage de komplekse interaktioner, der opstår mellem de forskellige celletyper i hornhinden10. Derfor er ex vivo og in vivo sygdom modeller stadig i høj efterspørgsel og forbedre de eksisterende er af største interesse.
Noninvasive, intraokulær kirurgi ved photodisruption ved hjælp af en neodym: YAG (Nd:YAG) laser er blevet en rutinemæssig procedure for øjenlæger over hele verden siden dens indførelse i slutningen af 1970'erne11. Photodisruption er afhængig af ikke-lineær lysabsorption, der fører til dannelse af plasma, generation af akustiske chokbølger, og skabelse af kavitationsbobler, når påføringsstedet er placeret i et flydende miljø12. Generelt bidrager disse processer til den tilsigtede virkning af præcis vævsskæring. Men, de kan også være kilden til unødvendige følgeskader begrænse den lokale indespærring af laser kirurgi13.
Forudsigelsen af de deraf følgende mekaniske virkninger er blevet væsentligt forbedret gennem karakterisering af chokbølgen formering og kavitation kursus. Det er vores mål at målrette CEC med så lidt skade på omgivende væv som muligt at give en noninvasive, laser-assisteret eksperimentel sygdom model for de tidlige stadier af CEC tab. Til dette formål er det nødvendigt at bestemme de optimale pulsenergier og positioner af laserens brændpunkter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd: YAG lasere er blevet brugt til at udføre noninvasive intraokulær kirurgi, såsom capsulotomy i flere årtier nu. Den skarpe effekt er afhængig af den optiske opdeling på laser fokus. Akustiske chokbølger og kavitationsbobler genereres, hvilket forårsager vævsbrud. Boblestørrelser og trykamplitudes varierer med pulsenergi og position af omdrejningspunktet. I denne undersøgelse, enucleated svin øjne var placeret foran en kommercielt tilgængeligE Nd: YAG laser. Variable puls energier samt forskellige positioner af brændpunkterne posteriort til hornhinden blev testet. Resulterende læsioner blev evalueret ved to-foton mikroskopi og histologi for at bestemme de bedste parametre for en eksklusiv løsrivelse af hornhinde endotelceller (CEC) med minimal følgeskader. Fordelene ved denne metode er den præcise ablation af CEC, reduceret følgeskader, og frem for alt, den ikke-kontakt behandling.

Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, behandlede vi øjne med en Nd:YAG laser, der evaluerer forskellige pulsenergier (1,0−4,6 mJ) og positioner af brændpunkter (afstand fra den bageste overflade af hornhinden: 0,0−0,2 mm) for at finde de optimale parametre. Flere replikater (n = 3) blev evalueret for hver konstellation af laserparametrene (12 x 21).
Ud over ovennævnte protokol blev prøven analyseret med et tofotonmikroskop før fiksering og H&E-farvning. De to-foton mikros...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Her præsenterer vi en protokol til at frigøre hornhinde endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjælp af en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sygdom model for bullous keratopathy (BK).

Udvikling af en noninvasive, Laser-Assisteret eksperimentel model af Hornhinde Endotel Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Nuværende sygdomsmodeller for hornhinde endotel celletab fokus på ødelæggelse af endotel og mere sandsynligt repræsenterer de sidste faser af sygdommen, når hornhinde transplantation er uundgåelig. Nye behandlinger ved hjælp af stamceller eller genterapi, dog er nu tilgængelige, der kunne være mere nyttige for de tidlige stadier af sygdommen, hvis modeller mangler. Noninvasive intraokulære kirurgi ved fotodisruption ved hjælp af en Nd: YAG laser er blevet en rutinemæssig procedure for øjenlæger.Efter at have fået frisk enucleated svin øjne fra det lokale slagteri, placere prøverne i fire grader Celsius fuld medium. Brug saks til at fjerne det ekstracellulære væv og sættetid øjnene i 5% povidone jod oftalmologiske opløsning i fem minutter. Dernæst skal du placere de desinficerede prøver i steril PBS ved stuetemperatur.Ved hjælp af en spektral domæne optisk sammenhæng tomografi enhed, screen øjnene for større forreste segment patologier såsom hornhinde ardannelse, ødem, og andre opaciteter. Efter screening, placere øjnene foran en slip lampe enhed udstyret med en Nd:YAG laser med en bølgelængde på 1, 064 nanometer og en brændpunkt diameter på 10 mikrometer i luften. Vælg 12X forstørrelse og aflede belysningen for at visualisere de enkelte hornhindelag.Efter indstilling af puls energi og fokus punkt til de relevante parametre for selektiv ablation af hornhinden endotelceller, anvende flere laser skud til vævet. Derefter under en dissekerende mikroskop, placere en klar hornhinde paracentesis tæt på limbus og injicere viskoelastisk at stabilisere den forreste kammer. Brug derefter en otte millimeter trephin til punktafgifter laserbehandlet centrale hornhinde og placere den isolerede hornhinde i en brønd af en 12-godt plade endotel side op.Når alle hornhinden er indsamlet, tilsættes tre millimeter fuldt medium til hver prøve godt og inkubere prøverne i op til tre dage ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning udskiftes mediet i hver brønd med methanolfri 4%paraformaldehyd i Sørensens buffer for en 20-minutters inkubation ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning hældes de faste prøver i 20 % saccharose i PBS i ca. en time, indtil hornhinden synker.Prøverne overføres til 30 %saccharose i PBS natten over, før væv i optimal skæretemperatur indlejres til opbevaring ved minus 80 grader Celsius. Brug en kryostat indstillet til minus 27 grader Celsius for at opnå 10 mikrometer tykke dele af det frosne væv indsamle hver sektion på et mikroskop dias inden for et minut efter det er erhvervet. Derefter opbevares diasene på minus 80 grader Celsius, indtil de farvning.For hæmatoxylin og eosin farvning, lufttørre de frosne sektioner i flere minutter for at fjerne fugt, før farvning med filtreret 0,1% Mayer's hæmatoxylin i 10 minutter i en 50 milliliter rør. Ved slutningen af inkubationen skylles objektglassene i dobbeltdestilleret vand i fem minutter i en kuvette. Dernæst dyppe dias i 0,5% eosin 10 gange, efterfulgt af dip skylning i dobbelt destilleret vand, indtil eosin stopper striber.Dyp de skyllede dias 10 gange i 50% ethanol og 10 gange i 70% ethanol. Efter den sidste 70% ethanol dip, ækvilibrer sektionerne i 95% ethanol i 30 sekunder, efterfulgt af 60 sekunder i 100% ethanol før flere dips i xylen. Monter derefter prøverne med coverslip, før du får billeder på et let mikroskop.To foton og lys mikroskopi billeder bør vurderes uafhængigt som ingen skade, for meget skade, eller korrekt mængde af skader. Baseret på disse vurderinger, kan en varme kort derefter beregnes for at vælge den rigtige konstellation af laser parametre for selektiv ablation af hornhinden endotelceller med minimal skade på det omgivende væv. Tidligere analyse har fastslået, at omdrejningspunktet for laseren skal være mindst 0,15 millimeter bag hornhinden endotel for den laveste puls energi testet.For pulsenergier, der er højere end 2,9 millijoule, er den længste testet brændvidde stadig for tæt på endotelet. Forskellige cytoprotektive midler kan testes, mens de punkterede prøver er i kultur. Hvis det viser sig vellykket, kan de føjes til vanding løsning til behandling.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Corneal donorvæv Forberedelse til Endothelial keratoplasti

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-burn Injury Model hornhindeneovaskularisering i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murin hornhindetransplantation: en model til at studere den mest almindelige form for organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Cornea donorvæv Forberedelse til Descemet membran Endothelial Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Evaluation of a Novel Laser-assisted Coronary Anastomotic Connector - the Trinity Clip - in a Porcine Off-pump Bypass Model

Evaluering af en Novel Laser-assisteret koronar anastomotisk Connector - Treenigheden Clip - i et porcint Off-pumpe Bypass Model

To simplify and facilitate beating heart (i.e., off-pump), minimally invasive coronary artery bypass surgery, a new coronary anastomotic connector, the ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural stamcelletransplantation i Eksperimentel Contusive Model for Rygmarvsskader

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In vivo- sporing af edemaudvikling og mikrovaskulær patologi i en model af eksperimentel cerebral malaria ved anvendelse af magnetisk resonansbilleddannelse

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

En eksperimentel Model af kost-induceret metabolisk syndrom i kanin: metodiske overvejelser, udvikling og vurdering

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...