Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
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Nous remercions Christine 'ron et Jan A. M. Sochurek pour leur aide à l’expérimentation.

Toutes les procédures impliquant des tissus animaux suivent les lignes directrices du Comité local de soins aux animaux et d’éthique.
1. Préparation de la culture d’organe et du traitement au laser
<ol><li>Obtenez des yeux porcins fraîchement enuclésés de l’abattoir local. Gardez-les au frais (4 oC) dans le milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec un glucose élevé, complété par de la L-glutamine, du pyruvate de sodium, de la pénicilline/streptomycine (1 %), et du séru...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. 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Les résultats de cette étude pilote indiquent qu’un laser Nd:YAG peut être utilisé pour abler sélectivement les cellules endothéliales cornéennes lorsque des paramètres appropriés pour la dose d’énergie et la position de point de focalisation sont choisis.
Comme la fonction endothéliale est importante pour la transparence cornéenne et la sauvegarde de la cornée contre l’oedème stromal, les modèles de dysfonctionnement endothélial jouent un rôle important dans le dévelop...

La transparence de la cornée est essentielle pour la transmission de la lumière à la rétine et ses photorécepteurs1. À cet égard, un état relatif de déshydratation est essentiel pour garder les fibres de collagène dans le stroma cornéen correctement aligné. Cette homéostasie est maintenue par des cellules endothéliales cornéennes (CEC) situées sur la membrane du Descemet (DM)2. L’endothélium est la couche cornéenne la plus intime. Il a une barrière importante et la fonction de pompe, qui est cruciale pour la transparence cornéenne3. Contrairement à l’épithélium, l’endothélium n’est pas en mesure de se renouvelersoi-même 4. Par conséquent, tout dommage cellulaire causé par la maladie ou le traumatisme stimule les cellules endothéliales restantes à agrandir et à migrer, à couvrir les défauts résultants et à maintenir la fonctionnalité cornéenne5. Cependant, si la densité de la CEC tombe en dessous d’un seuil critique, la décompensation de l’endothélium conduit à un œdème, entraînant une vision floue et l’inconfort ou même une douleur sévère4. En dépit de la disponibilité des drogues pour soulager des symptômes, actuellement le seul traitement définitif dans ces cas est la transplantation cornéenne, qui peut être exécutée sous la forme d’une greffe pleine épaisseur ou d’une transplantation endothéliale lamellaire. Cette dernière procédure est disponible sous forme de kératomie endothéliale membrane de Descemet (DMEK) ainsi que de la kératothéplastie endothéliale automatisée de Descemet (DSAEK)6. Cependant, la protection du maintien de la CEC et l’amélioration de leur survie pourraient être une cible alternative, qui a besoin d’un modèle de maladie adéquat pour tester les médicaments thérapeutiques potentiels.
Les modèles actuels de la maladie de perte de CEC se concentrent sur la destruction de l’endothélium par l’injection d’agents toxiques (p. ex., chlorure de benzalkonium) dans la chambre antérieure ou par abrasion mécanique des cellules utilisant une technique invasive de descemétorhexis7,8. Bien que ces modèles soient bien établis, des inconvénients tels que la réponse inflammatoire générale et les dommages collatéraux imprécis existent. Par conséquent, ces modèles sont plus susceptibles de représenter les derniers stades de la maladie, lorsque les options chirurgicales mentionnées ci-dessus sont inévitables.
Avec les progrès dans les stratégies de traitement cellulaire tels que les cellules souches et la thérapie génique, l’application de ces thérapies cellulaires pourrait être utile dans les premiers stades de la perte de CEC9. Par la suite, nous avons besoin d’un modèle qui représente ces premiers stades de la maladie de façon plus adéquate. À cet égard, les modèles de culture cellulaire se sont améliorés au cours de la dernière décennie, mais sont encore limités dans leur validité, que les cellules in vitro ne peuvent pas venir près de reproduire les interactions complexes qui se produisent entre les différents types de cellules dans la cornée10. Par conséquent, les modèles de maladies ex vivo et in vivo sont toujours en forte demande et l’amélioration des modèles existants est d’un intérêt primordial.
La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes du monde entier depuis son introduction à la fin des années 197011. La photodissoupstion repose sur l’absorption de la lumière non linéaire conduisant à la formation de plasma, à la génération d’ondes de choc acoustiques et à la création de bulles de cvitation, chaque fois que le site d’application est situé dans un environnement liquide12. En général, ces processus contribuent à l’effet prévu de la coupe précise des tissus. Cependant, ils peuvent également être la source de dommages collatéraux inutiles limitant l’enfermement local de la chirurgie au laser13.
La prédiction des effets mécaniques résultants s’est considérablement améliorée grâce à la caractérisation de la propagation de l’onde de choc et du cours de cvitation. Notre objectif est de cibler la CEC avec le moins de dommages possible aux tissus environnants afin de fournir un modèle de maladie expérimentale non invasif et assisté par laser pour les premiers stades de la perte de la CEC. À cette fin, il est nécessaire de déterminer les énergies et les positions optimales des impulsions du laser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd:YAG lasers ont été utilisés pour effectuer la chirurgie intraoculaire non invasive, comme la capsulotomie depuis plusieurs décennies maintenant. L’effet incisif repose sur la dégradation optique au laser. Des ondes de choc acoustiques et des bulles de cavitation sont générées, provoquant une rupture tissulaire. La taille des bulles et les amplitudes de pression varient en fonction de l’énergie des impulsions et de la position du point focal. Dans cette étude, des yeux porcins enucléés ont été placés devant un laser Nd:YAG disponible dans le commerce. Des énergies variables d’impulsion ainsi que différentes positions des taches focales postérieures à la cornée ont été testées. Les lésions résultantes ont été évaluées par microscopie et histologie à deux photon pour déterminer les meilleurs paramètres pour un détachement exclusif des cellules endothéliales cornéennes (CEC) avec des dommages collatéraux minimaux. Les avantages de cette méthode sont l’ablation précise de la CEC, la réduction des dommages collatéraux, et surtout le traitement sans contact.

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité les yeux avec un laser Nd:YAG, évaluant différentes énergies d’impulsion (1,0 à 4,6 mJ) et les positions des points focaux (distance de la surface postérieure de la cornée : 0,0 à 0,2 mm) pour trouver les paramètres optimaux. Plusieurs répliques (n - 3) ont été évaluées pour chaque constellation des paramètres laser (12 x 21).
En plus du protocole mentionné ci-dessus, le spécimen a été analysé avec un microsc...

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Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Ici, nous présentons un protocole pour détacher les cellules endothéliales cornéennes (CEC) de la membrane de Descemet (DM) à l’aide d’un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser comme modèle de maladie ex vivo pour la kératompathie bullous (BK).

Développement d’un modèle expérimental non invasif assisté au laser de la perte de cellules endothéliales cornéennes

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Les modèles actuels de maladie pour la perte cornéenne de cellules endothéliales se concentrent sur la destruction de l’endothélium et représentent plus probablement les étapes finales de la maladie quand la transplantation cornéenne est inévitable. De nouveaux traitements utilisant des cellules souches ou une thérapie génique, cependant, sont maintenant disponibles qui pourraient être plus utiles pour les premiers stades de la maladie, dont les modèles font défaut. La chirurgie intraoculaire non invasive par photodisruption à l’aide d’un laser Nd:YAG est devenue une procédure de routine pour les ophtalmologistes.Après avoir obtenu des yeux de porc fraîchement édulés de l’abattoir local, placez les échantillons dans un milieu plein de quatre degrés Celsius. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus extracellulaires et tremper les yeux dans 5% povidone solution ophtalmique d’iode pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons désinfectés dans du PBS stérile à température ambiante.À l’aide d’un dispositif spectral de tomographie optique de cohérence de domaine, filtrez les yeux pour les pathologies antérieures principales de segment telles que la cicatrisation cornéenne, l’oedème, et d’autres opacities. Après le criblage, placez les yeux devant une lampe à glissement équipée d’un laser Nd:YAG avec une longueur d’onde de 1 064 nanomètres et un diamètre de tache focale de 10 micromètres dans l’air. Sélectionnez le grossissement 12X et déviez l’éclairage pour visualiser les différentes couches cornéennes.Après avoir défini l’énergie pulsée et point de focalisation vers les paramètres appropriés pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles, appliquer plusieurs coups de laser sur le tissu. Puis, sous un microscope disséquant, placer une paracentesis de cornée claire près du limbus et injecter viscoélastique pour stabiliser la chambre antérieure. Ensuite, utilisez une tréphine de huit millimètres pour exciser la cornée centrale traitée au laser et placer la cornée isolée dans un puits d’un côté endothélial de plaque de 12 puits vers le haut.Lorsque toutes les cornées ont été récoltées, ajouter trois millimètres de plein milieu à chaque puits d’échantillon et incuber les spécimens jusqu’à trois jours à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de chaque puits par du paraformaldéhyde sans méthanol dans le tampon de Sorensen pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, placer les échantillons fixes dans 20 % de saccharose dans le PBS pendant environ une heure jusqu’à ce que les cornées coulent.Transférer les échantillons dans 30% saccharose en PBS pendant la nuit avant d’intégrer les tissus dans la température optimale de coupe pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un cryostat réglé à moins 27 degrés Celsius pour obtenir des sections de 10 micromètres d’épaisseur des tissus congelés recueillant chaque section sur une lame de microscope dans la minute qui a été acquise. Rangez ensuite les glissières à moins 80 degrés Celsius jusqu’à coloration.Pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine, séchez l’air des sections gelées pendant plusieurs minutes pour éliminer l’humidité avant de tacher avec de l’hématoxyline filtrée de 0,1 % mayer pendant 10 minutes dans un tube de 50 millilitres. À la fin de l’incubation, rincer les glissières à l’eau distillée double pendant cinq minutes dans une cuvette. Ensuite, trempez les diapositives dans 0,5% d’éosine 10 fois, suivie d’une croûte de trempette dans de l’eau distillée double jusqu’à ce que l’éosine cesse de strier.Tremper les glissières rincées 10 fois dans 50% d’éthanol et 10 fois dans 70% d’éthanol. Après la dernière baisse de 70 % d’éthanol, équilibrer les sections à 95 % d’éthanol pendant 30 secondes, puis 60 secondes dans 100 % d’éthanol avant plusieurs immersions dans le xylène. Montez ensuite les spécimens avec des coverslip avant d’obtenir des images sur un microscope léger.Deux images de microscopie photon et légère doivent être évaluées indépendamment car il n’y a pas de dommages, trop de dommages ou une quantité correcte de dommages. Sur la base de ces évaluations, une carte thermique peut ensuite être calculée pour sélectionner la bonne constellation de paramètres laser pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéeles avec un minimum de dommages au tissu environnant. L’analyse précédente a déterminé que le point focal du laser doit être d’au moins 0,15 millimètre derrière l’endothélium cornéen pour l’énergie légumineuse la plus basse testée.Pour les énergies pulsées supérieures à 2,9 millijoules, la plus longue distance focale testée est encore trop proche de l’endothélium. Divers agents cytoprotecteurs peuvent être testés pendant que les spécimens excisés sont en culture. S’ils sont couronnés de succès, ils peuvent être ajoutés à la solution d’irrigation pour le traitement.

Research

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