Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
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Wir danken Christine Örün und Jan A. M. Sochurek für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden.

Alle Verfahren, an denen Tiergewebe beteiligt ist, folgen den Richtlinien der örtlichen Tierpflege- und Ethikkommission.
1. Vorbereitung der Organkultur und Laserbehandlung
<ol><li>Erhalten Sie frisch enucleatierte Schweineaugen aus dem lokalen Schlachthof. Halten Sie sie kühl (4 °C) in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit hoher Glukose, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin/Streptomycin (1 %), und Schweineserum (10 %), fortan in diesem Artikel als vollmittel beze...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. 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D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Die Ergebnisse dieser Pilotstudie deuten darauf hin, dass ein Nd:YAG-Laser verwendet werden kann, um hornhaut-Endothelzellen selektiv abzuergänzen, wenn geeignete Parameter für Energiedosis und Fokuspunktposition gewählt werden.
Da die endotheliale Funktion wichtig für die Hornhauttransparenz und den Schutz der Hornhaut vor stromalen Ödemen ist, spielen Modelle der endothelialen Dysfunktion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antiödemoderoder-Verfahren. Es gibt mehrere etablierte...

Transparenz der Hornhaut ist wichtig für die Übertragung von Licht auf die Netzhaut und ihre Photorezeptoren1. In dieser Hinsicht ist ein relativer Zustand der Dehydrierung entscheidend, um die Kollagenfasern innerhalb der Hornhautstroma richtig ausgerichtet zu halten. Diese Homöostase wird von hornhauten Endothelzellen (CEC) auf der Descemet-Membran (DM)2aufrechterhalten. Das Endothel ist die innerste Hornhautschicht. Es hat eine wichtige Barriere- und Pumpenfunktion, die für die Hornhauttransparenz3von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Epithel ist das Endothel nicht in der Lage,sich 4zu erneuern. Daher stimuliert jede Durcherkrankung oder ein Trauma verursachte Zellschädigung die verbleibenden Endothelzellen, sich zu vergrößern und zu wandern, die resultierenden Defekte zu decken und die Hornhautfunktionalität aufrechtzuerhalten5. Wenn die CEC-Dichte jedoch unter einen kritischen Schwellenwert fällt, führt die Dekompensation des Endothels zu einem Ödem, was zu verschwommenem Sehen und Beschwerden oder sogar starkenSchmerzen4 führt. Trotz der Verfügbarkeit von Medikamenten zur Linderung von Symptomen ist derzeit die einzige definitive Behandlung in diesen Fällen die Hornhauttransplantation, die in Form eines Volldickentransplantats oder einer lamellaren Endotheltransplantation durchgeführt werden kann. Letzteres Verfahren ist als Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik (DMEK) sowie als Descemet-Abisolier-Automatik-Keratoplastik (DSAEK)6erhältlich. Der Schutz der verbleibenden KEK und die Verbesserung ihres Überlebens könnten jedoch ein alternatives Ziel sein, das ein angemessenes Krankheitsmodell benötigt, um potenzielle therapeutische Medikamente zu testen.
Aktuelle CEC-Verlustkrankheitsmodelle konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels durch Injektion von toxischen Wirkstoffen (z.B. Benzalkoniumchlorid) in die Vorderkammer oder durch mechanischea Briesion der Zellen mit einer invasiven Descemetorhexis-Technik7,8. Während diese Modelle gut etabliert sind, gibt es Nachteile wie allgemeine Entzündungsreaktionen und ungenaue Kollateralschäden. Daher stellen diese Modelle eher die Endstadien der Krankheit dar, wenn die oben genannten chirurgischen Optionen unvermeidlich sind.
Mit Fortschritten in zellulären Behandlungsstrategien wie Stammzellen und Gentherapie könnte die Anwendung dieser zellulären Therapien in frühen Stadien des CEC-Verlusts9nützlich sein. Anschließend brauchen wir ein Modell, das diese früheren Stadien der Krankheit angemessener darstellt. In dieser Hinsicht haben sich die Zellkulturmodelle in den letzten zehn Jahren verbessert, sind aber in ihrer Gültigkeit immer noch begrenzt, da Zellen in vitro nicht annähernd an die Replikation der komplexen Wechselwirkungen herankommen können, die zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Hornhaut10auftreten. Daher sind Ex-vivo- und In-vivo-Krankheitsmodelle nach wie vor sehr gefragt, und die Verbesserung der bestehenden sind von größtem Interesse.
Nichtinvasive, intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Neodym:YAG (Nd:YAG) Laser ist seit seiner Einführung ende der 1970er Jahre weltweit zu einem Routineverfahren für Augenärzte weltweit geworden11. Photodisruption beruht auf nichtlinearer Lichtabsorption, die zur Bildung von Plasma, der Erzeugung akustischer Stoßwellen und der Bildung von Kavitationsblasen führt, wenn sich der Einsatzort in einer flüssigen Umgebung befindet12. Im Allgemeinen tragen diese Prozesse zur beabsichtigten Wirkung eines präzisen Gewebeschneidens bei. Sie können jedoch auch die Quelle unnötiger Kollateralschäden sein, die die lokale Einschließung der Laserchirurgie begrenzen13.
Die Vorhersage der resultierenden mechanischen Effekte hat sich durch die Charakterisierung der Stoßwellenausbreitung und des Kavitationsverlaufs deutlich verbessert. Unser Ziel ist es, die KEK mit möglichst geringen Schäden an umgebendem Gewebe ins Visier zu nehmen, um ein nichtinvasives, lasergestütztes experimentelles Krankheitsmodell für die frühen Stadien des CEC-Verlusts bereitzustellen. Dazu ist es notwendig, die optimalen Pulsenergien und Positionen der Brennpunkte des Lasers zu bestimmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd:YAG-Laser werden seit mehreren Jahrzehnten zur Durchführung nichtinvasiver intraokularer Operationen wie Capsulotomie eingesetzt. Der prägnante Effekt beruht auf dem optischen Abbau am Laserfokus. Akustische Schockwellen und Kavitationsblasen werden erzeugt, was zu Gewebebrüchen führt. Blasengrößen und Druckamplituden variieren je nach Pulsenergie und Position des Brennpunkts. In dieser Studie wurden enukleierte Schweineaugen vor einem handelsüblichen Nd:YAG-Laser positioniert. Getestet wurden variable Pulsenergien sowie verschiedene Positionen der Brennpunkte hinter der Hornhaut. Die resultierenden Läsionen wurden durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und Histologie bewertet, um die besten Parameter für eine exklusive Ablösung von Hornhaut-Endothelzellen (CEC) mit minimalen Kollateralschäden zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die präzise Ablation der KEK, reduzierte Kollateralschäden und vor allem die berührungslose Behandlung.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren behandelten wir die Augen mit einem Nd:YAG-Laser, der verschiedene Pulsenergien (1,0 x 4,6 mJ) und Positionen von Brennpunkten (Abstand von der hinteren Oberfläche der Hornhaut: 0,0 x 0,2 mm) bewertete, um die optimalen Parameter zu finden. Für jede Konstellation der Laserparameter (12 x 21) wurden mehrere Replikationen (n = 3) ausgewertet.
Zusätzlich zu dem oben genannten Protokoll wurde die Probe vor der Fixierung und H&E-Färbung mit einem Zwei-Photon...

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Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Aktuelle Krankheitsmodelle für den Verlust von Hornhaut-Endothelzellen konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels und stellen eher die letzten Stadien der Krankheit dar, wenn eine Hornhauttransplantation unvermeidlich ist. Neue Behandlungen mit Stammzellen oder Gentherapie sind jetzt jedoch verfügbar, die für die frühen Stadien der Krankheit nützlicher sein könnten, für die Modelle fehlen. Die nichtinvasive intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Nd:YAG-Laser ist zu einem Routineverfahren für Augenärzte geworden.Nachdem Sie frisch enukleierte Schweineaugen aus dem lokalen Schlachthof erhalten haben, legen Sie die Proben in vier Grad Celsius volles Medium. Verwenden Sie eine Schere, um das extrazelluläre Gewebe zu entfernen und die Augen in 5%Povidon Jod ophthalmologische Lösung für fünf Minuten einweichen. Als nächstes legen Sie die desinfizierten Proben in sterilen PBS bei Raumtemperatur.Mit einem spektralen Bereich optische Kohärenz Tomographie Gerät, überprüfen Sie die Augen für große vordere Segment Pathologien wie Hornhautnarben, Ödeme, und andere Trübungen. Positionieren Sie nach dem Screening die Augen vor einer Rutschlampeneinheit, die mit einem Nd:YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 1.064 Nanometern und einem Brennpunktdurchmesser von 10 Mikrometern in der Luft ausgestattet ist. Wählen Sie die 12-fache Vergrößerung aus und lenken Sie die Beleuchtung ab, um die einzelnen Hornhautschichten zu visualisieren.Nachdem Sie die Pulsenergie und den Fokuspunkt auf die entsprechenden Parameter für die selektive Ablation der hornhauten Endothelzellen gesetzt haben, wenden Sie mehrere Laseraufnahmen auf das Gewebe an. Dann unter einem Sezieren Mikroskop, legen Sie eine klare Hornhaut paracentesis in der Nähe des Limbus und injizieren viskolastisch, um die vordere Kammer zu stabilisieren. Verwenden Sie dann ein acht Millimeter Trephin, um die laserbehandelte zentrale Hornhaut zu verbrauchen und legen Sie die isolierte Hornhaut in einen Brunnen einer 12-Well-Platte endotheliale Seite nach oben.Wenn alle Hornhäuten gesammelt wurden, fügen Sie drei Millimeter volles Medium zu jeder Probe gut hinzu und bebrüten die Proben für bis zu drei Tage bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation das Medium in jedem Brunnen durch methanolfreies 4%Paraformaldehyd in Sorensens Puffer für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen. Am Ende der Inkubation die fixen Proben in 20%Saccharose in PBS für etwa eine Stunde legen, bis die Hornhäuten sinken.Übertragen Sie die Proben über Nacht in 30% Saccharose in PBS, bevor Sie das Gewebe in eine optimale Schnitttemperatur für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius einbetten. Verwenden Sie einen Kryostat, der auf minus 27 Grad Celsius eingestellt ist, um 10 Mikrometer dicke Abschnitte des gefrorenen Gewebes zu erhalten, das jeden Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten innerhalb einer Minute nach seiner Erfassung sammelt. Dann lagern Sie die Dias bei minus 80 Grad Celsius bis zur Färbung.Für Hämatoxylin- und Eosinfärbung die gefrorenen Abschnitte für einige Minuten an der Luft trocknen, um Feuchtigkeit zu entfernen, bevor sie mit gefiltertem 0,1%Mayer-Hämatoxylin 10 Minuten lang in einem 50-Milliliter-Rohr färben. Am Ende der Inkubation die Dias in doppelt destilliertem Wasser für fünf Minuten in einer Küvette abspülen. Als nächstes tauchen Sie die Dias in 0,5%eosin 10 mal, gefolgt von Dip Spülung in doppelt destilliertem Wasser, bis das Eosin aufhört zu streifen.Tauchen Sie die entspülten Dias 10 Mal in 50% Ethanol und 10 mal in 70% Ethanol. Nach dem letzten 70%ethanol Dip, gleicht die Abschnitte in 95%Ethanol für 30 Sekunden, gefolgt von 60 Sekunden in 100%Ethanol vor mehreren Dips in Xylol. Montieren Sie dann die Proben mit Deckslip, bevor Sie Bilder auf einem Lichtmikroskop erhalten.Zwei Photonen- und Lichtmikroskopiebilder sollten unabhängig voneinander bewertet werden, da kein Schaden, zu viel Schaden oder korrekte Schadensmenge entstehen. Auf der Grundlage dieser Bewertungen kann dann eine Heatmap berechnet werden, um die richtige Konstellation von Laserparametern für die selektive Ablation der hornhauten Endothelzellen mit minimalen Schäden am umgebenden Gewebe auszuwählen. Frühere Analysen haben ergeben, dass der Brennpunkt des Lasers mindestens 0,15 Millimeter hinter dem Hornhautendothel liegen muss, um die niedrigste getestete Pulsenergie zu haben.Bei Pulsenergien über 2,9 Millijoule ist die längste getestete Brennweite noch zu nah am Endothel. Verschiedene zytoprotektive Mittel können getestet werden, während die ausgeschnittenen Proben in Kultur sind. Wenn sich dies als erfolgreich erwiesen hat, können sie der Bewässerungslösung zur Behandlung hinzugefügt werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medizin

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