Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

אנו מודים לכריסטין וררן וליאן א. סוצ'יורק על עזרתם בשיטות נסיוניות.

כל ההליכים הכרוכים ברקמת בעלי חיים עוקבים אחר ההנחיות של ועדת האתיקה המקומית לטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת תרבות איברים וטיפול לייזר
<ol><li>השיגו עיניים פורקליות טריות מהמטבחיים שמור אותם קריר (4 ° c) ב שונה בינונית הנשר של דולבco (dmem) עם גלוקוז גבוה, שיושלם עם L-גלוטמין, נתרן פירובט, ...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease.">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li><li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell.">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047 (2016).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty.">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li><li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy.">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li><li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium.">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation.">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li><li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery:+a+preliminary+report.">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li><li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium:+YAG+lasers.">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li><li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+Nd:YAG+laser+surgery:+laser-tissue+interaction,+damage+range,+and+reduction+of+collateral+effects.">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li><li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro.">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing.">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+histological+and+permeability+evaluation.">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li><li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas.">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li><li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells.">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).</li><li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

התוצאות של המחקר הטיס הזה עולה כי Nd: YAG לייזר ניתן להשתמש באופן סלקטיבי בתאי הקרנית בצורה סלקטיבית כאשר הפרמטרים המתאימים למינון האנרגיה ומיקום נקודת המיקוד נבחרים.
כמו הפונקציה אנדותל חשוב עבור שקיפות הקרנית ושמירה על הקרנית מתוך בצקת סטרומה, מודלים של בעיות אנדותל לשחק ת?...

שקיפות הקרנית חיונית להעברת האור לרשתית ולפוטוטורטורים1. בהקשר זה, מצב יחסי של התייבשות הוא קריטי כדי לשמור על סיבי הקולגן בתוך משתית הקרנית מיושרים כראוי. הומאוסטזיס זה מתוחזק על ידי תאי הקרנית אנדותל (CEC) ממוקם על קרום האמת (DM)2. האנדותל היא שכבת הקרניות הפנימית ביותר. יש לו מכשול חשוב ותפקוד המשאבה, אשר חיונית עבור שקיפות הקרנית3. בניגוד האפיתל, האנדותל אינו מסוגל לחדש את העצמי4. לפיכך, כל נזק תאי שנגרם על-ידי מחלה או טראומה מגרה את התאים האנדותל הנותרים כדי להגדיל ולהגר, לכסות את הפגמים הנובעים ולשמור על פונקציונליות הקרנית5. עם זאת, אם צפיפות ה-CEC נופלת מתחת לסף קריטי, פירוק האנדותל מוביל לבצקת, וכתוצאה מכך ראייה מטושטשת וחוסר נוחות או כאב חמור אפילו4. למרות הזמינות של תרופות כדי להקל על הסימפטומים, כיום הטיפול הסופי היחיד במקרים אלה הוא השתלת הקרנית, אשר ניתן לבצע בצורה של השתל בעובי מלא או השתלת אנדותל מלצ'יני. הנוהל האחרון הינו זמין בתור ממברנה של הממברנה האנדוספיה (DMEK), כמו גם של התפשטות הנוכחות האוטומטית של מתיחת העומק (DSAEK)6. עם זאת, ההגנה של שנותרו CEC ושיפור ההישרדות שלהם יכול להיות יעד חלופי, אשר זקוק למודל מחלה נאותה כדי לבחון תרופות טיפוליות פוטנציאליות.
הנוכחי CEC מחלת הפסד מודלים להתמקד בהשמדת האנדותל באמצעות הזרקה של סוכנים רעילים (g., בנזלקוניום כלוריד) לתוך החדר הקדמי או על ידי שחיקה מכנית של התאים באמצעות שיטה של ירידות פולשני7,8. בעוד מודלים אלה מבוססים היטב, חסרונות כגון תגובה דלקתית כללית ונזק סביבתי לא מדויק קיימים. לכן, מודלים אלה נוטים יותר לייצג את השלבים הסופיים של המחלה, כאשר האפשרויות הכירורגי הנ ל הם בלתי נמנעים.
עם ההתקדמות אסטרטגיות הטיפול הסלולרי כגון בתאי גזע וטיפול גנטי, היישום של אלה טיפולים סלולריים יכול להיות שימושי בשלבים המוקדמים של הפסד CEC9. לאחר מכן, אנו זקוקים למודל המייצג את השלבים המוקדמים האלה של המחלה בצורה מספקת יותר. בהקשר זה, מודלים של תרבות התא השתפרו בעשור האחרון אבל הם עדיין מוגבלים בתוקף שלהם, כמו תאים בתחום החוץ לא יכול להתקרב לשכפול האינטראקציות המורכבות המתרחשות בין סוגי התא השונים בתוך הקרנית10. לכן, vivo ex ובדגמי המחלות vivo עדיין בביקוש גבוה ושיפור הקיימים הוא בעל אינטרס מוחלט.
פולשני, ניתוח תוך העינית על ידי פוטושיבוש באמצעות מניאודימיום: YAG (Nd: YAG) לייזר הפך הליך שגרתי עבור רופאי עיניים ברחבי העולם מאז השקתו בסוף שנות ה-7011. פוטושיבוש מסתמך על קליטת אור לא לינארית המובילה להקמת פלזמה, הדור של גלי הלם אקוסטי, ויצירת בועות קוויטציה, בכל פעם שאתר היישום ממוקם בסביבה נוזלית12. באופן כללי, תהליכים אלה תורמים להשפעה המיועדת של חיתוך רקמות מדויק. עם זאת, הם יכולים גם להיות מקור נזק סביבתי מיותרים הגבלת הכליאה המקומית של ניתוח לייזר13.
החיזוי של השפעות מכניות כתוצאה מכך השתפר באופן משמעותי באמצעות אפיון של הפצת גל ההלם וקורס החפירה. זוהי המטרה שלנו למקד את CEC עם נזק קטן לרקמות שמסביב ככל האפשר כדי לספק מודל פולשני, לייזר בסיוע ניסיוני המודל עבור בשלבים המוקדמים של הפסד CEC. לצורך זה, יש צורך לקבוע את האנרגיות האופטימליות של הדופק ומיקומי הנקודות של מוקדי הלייזר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd: לייזרים YAG שימשו כדי לבצע ניתוח בעינית לא פולשנית, כגון capsulotomy במשך כמה עשורים עכשיו. האפקט המרחיק מסתמך על התמוטטות אופטית במוקד הלייזר. גלי הלם אקוסטי בועות הקצף נוצרות, גרימת קרע ברקמה. גודל בועה והגברה של הלחץ משתנים באמצעות אנרגיית הדופק ומיקומו של נקודת המוקד. במחקר זה, עיניים פורקלסי חזירי הוקמו מול מסחרית זמין Nd: YAG לייזר. משתנה אנרגיות הדופק, כמו גם עמדות שונות של נקודות מיקוד אחורי הקרנית נבדקו. נגעים וכתוצאה מכך הוערכו על ידי שני פוטון מיקרוסקופ ו היסטולוגיה כדי לקבוע את הפרמטרים הטובים ביותר עבור התנתקות בלעדית של תאים אנדותל הקרנית (CEC) עם נזק מינימלי השני. היתרונות של שיטה זו הם הצריבה המדויקת של CEC, מופחתת נזק סביבתי, ומעל לכל, טיפול ללא מגע.

באמצעות ההליך המוצג כאן, התייחסו לעיניים עם Nd: YAG לייזר, הערכת אנרגיות פולס שונות (1.0-4.6 mJ) ועמדות של נקודות מוקד (מרחק מהמשטח האחורי של הקרנית: 0.0-0.2 מ"מ) כדי למצוא את הפרמטרים האופטימליים. מספר משכפל (n = 3) הוערך עבור כל קבוצת כוכבים של פרמטרי הלייזר (12 x 21).
בנוסף לפרוטוקול הנ ל, הדג?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

מודלים המחלה הנוכחית עבור אובדן תאים אנדותל הקרנית להתמקד בהרס של אנדותל וסביר יותר לייצג את השלבים הסופיים של המחלה כאשר השתלת הקרנית היא בלתי נמנעת. טיפולים חדשים באמצעות תאי גזע או ריפוי גנטי, עם זאת, זמינים כעת כי יכול להיות שימושי יותר עבור השלבים המוקדמים של המחלה, המודלים שעבורם חסרים. ניתוח תוך עיני פולשני לא פולשני על ידי פוטודירופציה באמצעות לייזר Nd:YAG הפך הליך שגרתי עבור רופאי עיניים.לאחר קבלת עיני פורצ'ין טריות מבית המטבחיים המקומי, מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מדיום מלא. השתמש במספריים כדי להסיר את הרקמות החוץ תאיות ולהשרות את העיניים בתספוס עיניים יוד 5%povidone במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות המחטאות ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.באמצעות התקן טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות תחום ספקטרלי, לסנן את העיניים עבור פתולוגיות קטע מרכזיות לפנים כגון צלקות הקרנית, בצקת, ואטימות אחרות. לאחר ההקרנה, מקם את העיניים מול יחידת מנורת החלקה המצוידת בלייזר Nd:YAG עם אורך גל של 1, 064 ננומטר וקוטר נקודת מוקד של 10 מיקרומטר באוויר. בחרו בהגדלה של פי 12 והסיטו את התאורה כדי לדמיין את שכבות הקרנית הבודדות.לאחר הגדרת אנרגיית הדופק ונקודת המיקוד לפרמטרים המתאימים לאבלציה הסלקטיבית של תאי ה אנדותל הקרנית, החל מספר יריות לייזר על הרקמה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ ניתוח, מניחים מצנח קרנית ברור קרוב ללימבוס ומזריקים ויסקולסטי כדי לייצב את התא הקדמי. לאחר מכן השתמשו בטרפין באורך שמונה מילימטרים כדי למלמל את הקרנית המרכזית שטופלה בלייזר ולהמקם את הקרנית המבודדת לתוך באר אחת של צד אנדותל צלחת 12 היטב למעלה.לאחר איסוף כל הקרניות, הוסיפו שלושה מילימטרים של מדיום מלא לכל דגימה היטב והדגירה את הדגימות עד שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, החליפו את המדיום בכל באר ב-4% פרפורמלדהיד ללא מתנול במאגר של סורנסן עבור דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מניחים את הדגימות הקבועות ב 20% סוכרוז ב PBS במשך כשעה עד הקרניות לשקוע.מעבירים את הדגימות ל-30% סוכרוז ב-PBS בן לילה לפני הטמע את הרקמות בטמפרטורת חיתוך אופטימלית לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש קריוסטט להגדיר מינוס 27 מעלות צלזיוס כדי להשיג 10 חלקים עבים מיקרומטר של רקמות קפואות איסוף כל קטע על שקופית מיקרוסקופ בתוך דקה אחת של זה נרכש. לאחר מכן לאחסן את השקופיות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הכתם.עבור כתמי המטוקסילין ואאוסין, האוויר מייבש את החלקים הקפואים במשך מספר דקות כדי להסיר לחות לפני הכתמה עם המטוקסילין מסונן של מאייר במשך 10 דקות בצינור 50 מיליליטר. בסוף הדגירה, שוטפים את המגלשות במים מזוקקים כפולים במשך חמש דקות בקובט. לאחר מכן, טובלים את המגלשות ב-0.5% אאוסין 10 פעמים, ואחריהן טובלים במים מזוקקים כפולים עד שהאוסין מפסיק לפסים.טובלים את השקופיות שטוף 10 פעמים ב 50% אתנול ו 10 פעמים 70% אתנול. לאחר מטבל האתנול האחרון של 70%, יש לצייד את החלקים ב-95% אתנול למשך 30 שניות, ואחריו 60 שניות ב-100% אתנול לפני מספר מטבלים בקסילן. לאחר מכן הר את הדגימות עם כיסוי לפני קבלת תמונות על מיקרוסקופ אור.יש להעריך באופן עצמאי שתי תמונות מיקרוסקופיה של פוטון ואור ללא נזק, נזק רב מדי או כמות נכונה של נזק. בהתבסס על הערכות אלה, מפת חום לאחר מכן ניתן לחשב כדי לבחור את הקונסטלציה הנכונה של פרמטרי לייזר עבור אבלציה סלקטיבית של תאי אנדותל הקרנית עם נזק מינימלי לרקמה שמסביב. ניתוח קודם קבע כי המוקד של הלייזר חייב להיות לפחות 0.15 מילימטרים מאחורי אנדותל הקרנית עבור אנרגיית הדופק הנמוכה ביותר שנבדקה.עבור אנרגיות דופק גבוהות מ-2.9 מילי-ג'אול, מרחק המוקד הארוך ביותר שנבדק עדיין קרוב מדי לא אנדותל. סוכנים ציטופרוטקטיביים שונים יכולים להיבדק בזמן שהדגימות הנפלטות נמצאות בתרבות. אם הוכח מוצלח, הם יכולים להתווסף לפתרון ההשקיה לטיפול.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopic אבי העורקים להשתלות: מודל עכברוש לחקר התפתחות vasculopathy כרונית

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

קרנית התורם רקמות הכנה Keratoplasty האנדותל

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

הכנת רקמות התורמות קרנית לממברנה האנדותל Keratoplasty של Descemet

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Evaluation of a Novel Laser-assisted Coronary Anastomotic Connector - the Trinity Clip - in a Porcine Off-pump Bypass Model

הערכה בהשקת מחבר כלילית סייע-לייזר רומן - קליפ טריניטי - בדגם עקיפה בשר חזירים Off-משאבה

To simplify and facilitate beating heart (i.e., off-pump), minimally invasive coronary artery bypass surgery, a new coronary anastomotic connector, the ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

מדגם ניסיוני של דיאטה-Induced סינדרום מטבולי בקרב ארנב: שיקולים מתודולוגי, פיתוח והערכה

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...