Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
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Ringraziamo Christine En e Jan A. M. Sochurek per il loro aiuto con metodi sperimentali.

Tutte le procedure relative al tessuto animale seguono le linee guida del Comitato locale per la cura e l'etica degli animali.
1. Preparazione della coltura degli organi e del trattamento laser
<ol><li>Ottenere occhi di porcina appena enucleated dal mattatoio locale. Mantenerli freschi (4 gradi centigradi) nel mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, integrato con L-glutamina, pyruvate di sodio, penicillina/streptomicina (1%), e siero di porcina (10%), d'ora in poi indic...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. 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I risultati di questo studio pilota indicano che un laser Nd:YAG può essere utilizzato per ablamare selettivamente le cellule endoteliali corneali quando vengono scelti i parametri appropriati per la dose di energia e la posizione del punto di messa a fuoco.
Poiché la funzione endoteliale è importante per la trasparenza corneale e la salvaguardia della cornea dall'edema stromale, i modelli di disfunzione endoteliale svolgono un ruolo importante nello sviluppo di farmaci anti-edematosi o pro...

La trasparenza della cornea è essenziale per la trasmissione della luce alla retina e ai suoi fotorecettori1. A questo proposito, uno stato relativo di disidratazione è fondamentale per mantenere le fibre di collagene all'interno dello stroma corneale correttamente allineate. Questa omeostasi è mantenuta da cellule endoteliali corneali (CEC) situate sulla membrana del Descemet (DM)2. L'endotelio è lo strato corneale più interno. Ha un'importante barriera e funzione di pompaggio, che è fondamentale per la trasparenza corneale3. A differenza dell'epitelio, l'endotelio non è in grado di auto-rinnovarsi4. Pertanto, qualsiasi danno cellulare causato da malattie o traumi stimola le cellule endoteliali rimanenti ad ingrandire e migrare, a coprire i difetti risultanti e a mantenere la funzionalità corneale5. Tuttavia, se la densità CEC scende al di sotto di una soglia critica, lo scompenso dell'endotelio porta ad un edema, con conseguente visione e disagio offuscati o anche dolore grave4. Nonostante la disponibilità di farmaci per alleviare i sintomi, attualmente l'unico trattamento definitivo in questi casi è il trapianto di cornea, che può essere eseguito sotto forma di un trapianto endoteliale a tutto spessore o un trapianto endoteliale lamellare. Quest'ultima procedura è disponibile come keratoplastica endoteliale a membrana (DMEK) di Descemet e come keratoplastica endoteliale di Descemet (DSAEK)6. Tuttavia, la protezione della CEC rimanente e il miglioramento della loro sopravvivenza potrebbe essere un obiettivo alternativo, che necessita di un modello di malattia adeguato per testare potenziali farmaci terapeutici.
Gli attuali modelli di malattia da perdita CEC si concentrano sulla distruzione dell'endotelio attraverso l'iniezione di agenti tossici (ad esempio, il cloruro di benzalkonium) nella camera anteriore o per abrasione meccanica delle cellule utilizzando una tecnica di descemetorhexis invasiva7,8. Mentre questi modelli sono ben consolidati, esistono svantaggi come la risposta infiammatoria generale e danni collaterali imprecisi. Pertanto, questi modelli hanno maggiori probabilità di rappresentare le fasi finali della malattia, quando le opzioni chirurgiche di cui sopra sono inevitabili.
Con i progressi nelle strategie di trattamento cellulare come le cellule staminali e la terapia genica, l'applicazione di queste terapie cellulari potrebbe essere utile nelle prime fasi della perdita di CEC9. Successivamente, abbiamo bisogno di un modello che rappresenti queste fasi precedenti della malattia in modo più adeguato. A questo proposito, i modelli di coltura cellulare sono migliorati nell'ultimo decennio, ma sono ancora limitati nella loro validità, in quanto le cellule in vitro non possono avvicinarsi alla replica delle complesse interazioni che si verificano tra i diversi tipi di cellule all'interno della cornea10. Pertanto, i modelli ex vivo e in vivo sono ancora molto richiesti e migliorare quelli esistenti è del massimo interesse.
Chirurgia intraoculare non invasiva da fotodisruption utilizzando un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser è diventato una procedura di routine per oftalmologi in tutto il mondo dalla sua introduzione alla fine del 11 anni11. La fotodisruption si basa sull'assorbimento della luce non lineare che porta alla formazione di plasma, alla generazione di onde acustiche d'urto e alla creazione di bolle di cavitazione, ogni volta che il sito di applicazione si trova in un ambiente liquido12. In generale, questi processi contribuiscono all'effetto previsto di un taglio preciso dei tessuti. Tuttavia, possono anche essere la fonte di danni collaterali non necessari che limitano il confinamento locale della chirurgia laser13.
La previsione degli effetti meccanici risultanti è notevolmente migliorata attraverso la caratterizzazione del corso di propagazione e cavitazione dell'onda d'urto. Il nostro obiettivo è quello di indirizzare la CEC con il minor danno possibile al tessuto circostante per fornire un modello di malattia sperimentale non invasivo assistito dal laser per le prime fasi della perdita di CEC. A questo scopo, è necessario determinare le energie di impulso ottimali e le posizioni dei punti focali del laser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

I laser Nd:YAG sono stati utilizzati per eseguire interventi chirurgici intraoculari non invasivi, come la capsulotomia da diversi decenni. L'effetto incisivo si basa sulla rottura ottica al fuoco laser. Vengono generate onde d'urto acustiche e bolle di cavitazione, causando la rottura del tessuto. Le dimensioni delle bolle e le ampiezza di pressione variano a seconda dell'energia dell'impulso e della posizione del punto focale. In questo studio, gli occhi di porcina enucleati sono stati posizionati di fronte a un laser Nd:YAG disponibile in commercio. Sono state testate le energie di impulso variabili e le diverse posizioni dei punti focali posteriori alla cornea. Le lesioni risultanti sono state valutate dalla microscopia a due fotoni e dall'istologia per determinare i migliori parametri per un distacco esclusivo delle cellule endoteliali corneali (CEC) con un danno collaterale minimo. I vantaggi di questo metodo sono l'ablazione precisa della CEC, la riduzione dei danni collaterali e, soprattutto, il trattamento senza contatto.

Usando la procedura qui presentata, abbiamo trattato gli occhi con un laser Nd:YAG, valutando diverse energie di impulso (1,0,6 mJ) e posizioni dei punti focali (distanza dalla superficie posteriore della cornea: 0,0,2 mm) per trovare i parametri ottimali. Sono state valutate repliche multiple (n n e 3) per ogni costellazione dei parametri laser (12 x 21).
Oltre al protocollo di cui sopra, l'esemplare è stato analizzato con un microscopio a due fotoni prima della fissazione e della colorazion...

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Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Gli attuali modelli di malattia per la perdita di cellule endoteliali corneali si concentrano sulla distruzione dell'endotelio e più probabilmente rappresentano le fasi finali della malattia quando il trapianto corneale è inevitabile. Sono ora disponibili nuovi trattamenti con cellule staminali o terapia genica, tuttavia, che potrebbero essere più utili per le prime fasi della malattia, i cui modelli sono carenti. La chirurgia intraoculare non invasiva per fotodisrruzione utilizzando un laser Nd:YAG è diventata una procedura di routine per gli oftalmologi.Dopo aver ottenuto occhi suini appena enucleati dal mattatoio locale, posizionare i campioni in quattro gradi Celsius mezzo pieno. Utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti extracellulari e immergere gli occhi in una soluzione oftalmica di iodio al 5%povidone per cinque minuti. Quindi, posizionare i campioni disinfettati in PBS sterile a temperatura ambiente.Utilizzando un dispositivo di tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, scherma gli occhi per le principali patologie del segmento anteriore come cicatrici corneali, edema e altre opacità. Dopo lo screening, posizionare gli occhi davanti a un'unità di lampada a slittamento dotata di un laser Nd:YAG con una lunghezza d'onda di 1.064 nanometri e un diametro del punto focale di 10 micrometri nell'aria. Selezionate l'ingrandimento 12X e deviate l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.Dopo aver impostando l'energia dell'impulso e il punto di messa a fuoco sui parametri appropriati per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali, applicare diversi colpi laser al tessuto. Quindi, al microscopio sezionato, posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare viscoelastico per stabilizzare la camera anteriore. Quindi utilizzare una trefina di otto millimetri per asportare la cornea centrale trattata al laser e posizionare la cornea isolata in un pozzo di un lato endoteliale a piastre di 12 po 'verso l'alto.Una volta raccolte tutte le cornee, aggiungere tre millimetri di mezzo pieno per ogni campione e incubare i campioni per un massimo di tre giorni a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con paraformaldeide al 4% priva di metanolo nel tampone di Sorensen per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, posizionare i campioni fissi in saccarosio al 20% in PBS per circa un'ora fino a quando le cornee affondano.Trasferire i campioni in saccarosio al 30% in PBS durante la notte prima di incorporare i tessuti in una temperatura di taglio ottimale per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un criostato impostato su meno 27 gradi Celsius per ottenere sezioni spesse 10 micrometri dei tessuti congelati che raccolgono ogni sezione su uno scivolo al microscopio entro un minuto dall'acquisizione. Quindi conservare le diapositive a meno 80 gradi Celsius fino alla colorazione.Per la colorazione di ematossilina ed eosina, asciugare all'aria le sezioni congelate per diversi minuti per rimuovere l'umidità prima di macchiare con ematossilina filtrata dello 0,1% Mayer per 10 minuti in un tubo da 50 millilitri. Al termine dell'incubazione, sciacquare gli scivoli in acqua doppia distillata per cinque minuti in una cuvetta. Successivamente, immergere le diapositive nello 0,5% eosin 10 volte, seguite da risciacquo a immersione in acqua distillata doppia fino a quando l'eosina smette di strisciare.Immergere le diapositive risciacquate 10 volte in 50%etanolo e 10 volte in 70%etanolo. Dopo l'ultimo dip di etanolo del 70%, equilibrare le sezioni in 95%etanolo per 30 secondi, seguite da 60 secondi in etanolo al 100% prima di diversi tuffo in xilene. Quindi montare i campioni con coverlip prima di ottenere immagini al microscopio luminoso.Due immagini fotone e microscopia luminosa devono essere valutate in modo indipendente come nessun danno, troppi danni o una corretta quantità di danni. Sulla base di queste valutazioni, una mappa termica può quindi essere calcolata per selezionare la giusta costellazione di parametri laser per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali con danni minimi al tessuto circostante. Analisi precedenti hanno determinato che il punto focale del laser deve essere di almeno 0,15 millimetri dietro l'endotelio corneale per l'energia dell'impulso più bassa testata.Per energie di impulso superiori a 2,9 millijoule, la distanza focale più lunga testata è ancora troppo vicina all'endotelio. Vari agenti citoprotettivi possono essere testati mentre i campioni asportati sono in coltura. Se si sono dimostrati efficaci, possono essere aggiunti alla soluzione di irrigazione per il trattamento.

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