Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Vi takker Christine Örün og Jan A. M. Sochurek for deres hjelp med eksperimentelle metoder.

Alle prosedyrer som involverer dyrevev følger retningslinjene til den lokale dyreomsorgs- og etikkkomiteen.
1. Tilberedning av organkultur og laserbehandling
<ol><li>Få nyenucleated svineøyne fra den lokale slakterien. Hold dem kjølige (4 °C) i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med høyt glukose, supplert med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), og svineserum (10%), heretter referert til i denne artikkelen som fullt medium.</li>
	<li>Fjern ekstracellulære v...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease.">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li><li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell.">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047 (2016).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty.">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li><li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy.">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li><li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium.">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation.">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li><li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery:+a+preliminary+report.">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li><li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium:+YAG+lasers.">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li><li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+Nd:YAG+laser+surgery:+laser-tissue+interaction,+damage+range,+and+reduction+of+collateral+effects.">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li><li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro.">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing.">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+histological+and+permeability+evaluation.">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li><li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas.">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li><li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells.">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).</li><li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Resultatene av denne pilotstudien indikerer at en Nd:YAG laser kan brukes til å selektivt ablate hornhinne endotelceller når passende parametere for energidose og fokuspunktposisjon velges.
Siden endotelfunksjonen er viktig for hornhinnens gjennomsiktighet og sikring av hornhinnen mot stromal ødem, spiller modeller av endoteldysfunksjon en viktig rolle i utviklingen av anti-edematøse legemidler eller kirurgiske prosedyrer. Det er flere etablerte in vitro modeller for å etterligne in vivo ...

Gjennomsiktighet av hornhinnen er avgjørende for overføring av lys til netthinnen og dens fotoreseptorer1. I denne forbindelse er en relativ tilstand av dehydrering avgjørende for å holde kollagenfibrene i hornhinnen stroma riktig justert. Denne homeostase opprettholdes av hornhinnen endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotelet er det innerste hornhinnenlaget. Den har en viktig barriere og pumpefunksjon, som er avgjørende for hornhinnens gjennomsiktighet3. I motsetning til epitelet er epitelet ikke i stand til å fornye4. Derfor stimulerer enhver celleskade forårsaket av sykdom eller traumer de gjenværende endotelcellene til å forstørre og migrere, for å dekke resulterende defekter og for å opprettholde hornhinnefunksjonalitet5. Men hvis CEC tetthet faller under en kritisk terskel, dekompensasjon av endotelet fører til et ødem, noe som resulterer i tåkesyn og ubehag eller til og med alvorlig smerte4. Til tross for tilgjengeligheten av legemidler for å lindre symptomer, er for tiden den eneste definitive behandlingen i disse tilfellene hornhinnetransplantasjon, som kan utføres i form av en fulltykkelsestransplantat eller en lamellær endoteltransplantasjon. Sistnevnte prosedyre er tilgjengelig som Descemets membran endotelkeratoplastikk (DMEK) samt Descemets stripping automatisert endotelkeratoplasty (DSAEK)6. Men, beskyttelse av gjenværende CEC og forbedre deres overlevelse kan være et alternativt mål, som trenger en tilstrekkelig sykdommodell for å teste potensielle terapeutiske legemidler.
Nåværende CEC tap sykdom modeller fokus på ødeleggelse av endotelet gjennom injeksjon av giftige midler (f.eks benzalkonium klorid) inn i fremre kammeret eller ved mekanisk slitasje av cellene ved hjelp av en invasiv descemetorhexis teknikk7,8. Mens disse modellene er godt etablert, finnes ulemper som generell inflammatorisk respons og upresis sivile skader. Derfor er disse modellene mer sannsynlig å representere sluttstadier av sykdommen, når de ovennevnte kirurgiske alternativene er uunngåelige.
Med fremskritt i cellulære behandlingsstrategier som stamceller og genterapi, kan anvendelsen av disse cellulære terapiene være nyttig i tidlige stadier av CEC-tap9. Deretter trenger vi en modell som representerer disse tidligere stadiene av sykdommen mer tilstrekkelig. I denne forbindelse har cellekulturmodeller forbedret seg i løpet av det siste tiåret, men er fortsatt begrenset i deres gyldighet, da celler in vitro ikke kan komme i nærheten av å replikere de komplekse interaksjonene som oppstår mellom de forskjellige celletypene i hornhinnen10. Derfor er ex vivo og in vivo sykdomsmodeller fortsatt i høy etterspørsel og forbedrer de eksisterende er av største interesse.
Ikke-invasiv, intraokulær kirurgi ved fotoavbrudd ved hjelp av en neodym: YAG (Nd:YAG) laser har blitt en rutinemessig prosedyre for øyeleger over hele verden siden introduksjonen på slutten av 1970-tallet11. Photodisruption er avhengig av ikke-lineær lysabsorpsjon som fører til dannelse av plasma, generering av akustiske sjokkbølger og opprettelse av kavitasjonsbobler, når applikasjonsstedet ligger i et flytende miljø12. Generelt bidrar disse prosessene til den tiltenkte effekten av presis vevsskjæring. Men, de kan også være kilden til unødvendigsikkerhet skade begrense den lokale innesperring av laser kirurgi13.
Prediksjonen av resulterende mekaniske effekter har betydelig forbedret seg gjennom karakterisering av sjokkbølgeforplantningog kavitasjonskurs. Det er vårt mål å målrette CEC med så lite skade på omkringliggende vev som mulig for å gi en ikke-invasiv, laserassistert eksperimentell sykdomsmodell for de tidlige stadiene av CEC-tap. For dette formålet er det nødvendig å bestemme optimalpulsenergier og posisjoner av brennviddene på laseren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd: YAG lasere har blitt brukt til å utføre ikke-invasiv intraokulær kirurgi, som capsulotomy i flere tiår nå. Den incisive effekten er avhengig av den optiske nedbrytningen ved laserfokus. Akustiske sjokkbølger og kavitasjonsbobler genereres, noe som forårsaker vevsbrudd. Boblestørrelser og trykkamplituder varierer med pulsenergi og fokuspunkt. I denne studien ble enucleated svineøyne plassert foran en kommersielt tilgjengelig Nd:YAG laser. Variabel pulsenergier samt ulike posisjoner av brennplassene posterior til hornhinnen ble testet. Resulterende lesjoner ble evaluert av tofotonmikroskopi og histologi for å bestemme de beste parametrene for en eksklusiv løsrivelse av hornhinneendotelceller (CEC) med minimal sikkerhetsskade. Fordelene med denne metoden er nøyaktig ablasjon av CEC, redusert sikkerhet skade, og fremfor alt, ikke-kontakt behandling.

Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, behandlet vi øynene med en Nd:YAG laser, evaluere ulike pulsenergier (1,0-4,6 mJ) og posisjoner av kontaktpunkter (avstand fra den bakre overflaten av hornhinnen: 0,0-0,2 mm) for å finne de optimale parametrene. Flere replikater (n = 3) ble evaluert for hver konstellasjon av laserparametrene (12 x 21).
I tillegg til den ovennevnte protokollen ble prøven analysert med et tofotnmikroskop før fiksering og H&E-farging. Tofotonmikroskopet brukte en s...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Her presenterer vi en protokoll for å løsne hornhinne endotelceller (CEC) fra Descemets membran (DM) ved hjelp av en neodymium:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sykdommodell for bullous keratopathy (BK).

Utvikling av en ikke-invasiv, laserassistert eksperimentell modell av hornhinne endotelcelletap

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Nåværende sykdomsmodeller for hornhinne endotelcelletap fokuserer på ødeleggelsen av endotelet og representerer mer sannsynlig de siste stadiene av sykdommen når hornhinnen transplantasjon er uunngåelig. Nye behandlinger ved hjelp av stamceller eller genterapi er imidlertid nå tilgjengelige som kan være mer nyttige for de tidlige stadiene av sykdommen, modellene som mangler. Ikke-invasiv intraokulær kirurgi ved fotodisrupsjon ved hjelp av en Nd: YAG laser har blitt en rutinemessig prosedyre for oftalmologer.Etter å ha fått nyutdannede svineøyne fra det lokale slakteriet, legg prøvene i fire grader Celsius fullt medium. Bruk saks for å fjerne det ekstracellulære vevet og suge øynene i 5% povidon jodoftalmisk løsning i fem minutter. Deretter plasserer du desinfiserte prøvene i steril PBS ved romtemperatur.Ved hjelp av et spektralt domene optisk sammenhengtomografienhet, skjerm øynene for store fremre segmentpatologier som hornhinne arrdannelse, ødem og andre opacities. Etter screening plasserer du øynene foran en sklilampeenhet utstyrt med en Nd:YAG-laser med en bølgelengde på 1, 064 nanometer og en fokal flekkdiameter på 10 mikrometer i luft. Velg 12X forstørrelsen og avlede belysningen for å visualisere de enkelte hornhinnen lag.Etter å ha satt pulsenergien og fokuspunktet til de riktige parametrene for selektiv ablasjon av hornhinnens endotelceller, bruk flere laserskudd på vevet. Deretter under et dissekeremikroskop, legg en klar hornhinneparacentese nær limbus og injiser viskoelastisk for å stabilisere det fremre kammeret. Bruk deretter en åtte millimeter trephine for å avgifte laserbehandlet sentral hornhinnen og plassere den isolerte hornhinnen i en brønn av en 12-brønns plate endotelside opp.Når alle hornhinnene er samlet, legg til tre millimeter full medium til hver prøvebrønn og inkuber prøvene i opptil tre dager ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen erstatter du mediet i hver brønn med metanolfri 4 % paraformaldehyd i Sorensens buffer for en 20-minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen plasserer du de faste prøvene i 20% sukrose i PBS i omtrent en time til hornhinnen synker.Overfør prøvene til 30% sukrose i PBS over natten før du bygger inn vevet i optimal skjæretemperatur for lagring ved minus 80 grader Celsius. Bruk et kryostatsett satt til minus 27 grader Celsius for å oppnå 10 mikrometer tykke deler av det frosne vevet som samler hver seksjon på et mikroskopsklie innen ett minutt etter at det er kjøpt. Oppbevar deretter lysbildene på minus 80 grader Celsius til farging.For hematoksylin og eosinfarging tørker luften de frosne delene i flere minutter for å fjerne fuktighet før farging med filtrert 0,1% Mayers hematoksylin i 10 minutter i et 50 milliliter rør. På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene i dobbelt destillert vann i fem minutter i en cuvette. Deretter dypper du lysbildene i 0,5% eosin 10 ganger, etterfulgt av dip skylling i dobbelt destillert vann til eosin slutter å streke.Dypp de skyllede lysbildene 10 ganger i 50% etanol og 10 ganger i 70% etanol. Etter de siste 70% etanol dip, likevekt seksjonene i 95% etanol i 30 sekunder, etterfulgt av 60 sekunder i 100% etanol før flere dips i xylen. Monter deretter prøvene med dekkglass før du får bilder på et lett mikroskop.To foton- og lette mikroskopibilder bør vurderes uavhengig som ingen skade, for mye skade eller riktig skade. Basert på disse vurderingene kan et varmekart deretter beregnes for å velge riktig konstellasjon av laserparametere for selektiv ablasjon av hornhinnens endotelceller med minimal skade på det omkringliggende vevet. Tidligere analyse har fastslått at fokuspunktet for laseren må være minst 0,15 millimeter bak hornhinnen endotelet for den laveste pulsenergien som testes.For pulsenergier høyere enn 2,9 millijoules, er den lengste brennvidden testet fortsatt for nær endotelet. Ulike cytobeskyttende midler kan testes mens de utskåret prøvene er i kultur. Hvis det er bevist vellykket, kan de legges til vanningsløsningen for behandling.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Corneal Donor Tissue Forberedelse til endotel keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-brenner Injury Modell av Corneal neovaskulariseringen i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhinnen Transplantasjon: En modell for å studere den vanligste formen for organtransplantasjon

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hornhinnen Donor Vevpreparerina for Descemefs Membrane endotel Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Evaluation of a Novel Laser-assisted Coronary Anastomotic Connector - the Trinity Clip - in a Porcine Off-pump Bypass Model

Evaluering av en Novel Laser-assistert Coronary anastomotisk Connector - treenigheten Clip - i en svinekjøtt Off-pumpe Bypass Modell

To simplify and facilitate beating heart (i.e., off-pump), minimally invasive coronary artery bypass surgery, a new coronary anastomotic connector, the ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Nevrale stamcelletransplantasjon i Experimental Contusive Modell av ryggmargsskade

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In vivo- sporing av ødemutvikling og mikrovaskulær patologi i en modell av eksperimentell cerebral malaria ved hjelp av magnetisk resonans-bildebehandling

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

En eksperimentell modell av diett-indusert Metabolsk syndrom i Rabbit: metodologiske hensyn og utviklingen vurdering

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...