Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
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Agradecemos a Christine Örün e Jan A. M. Sochurek pela ajuda com métodos experimentais.

Todos os procedimentos envolvendo tecido animal seguem as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidado Animal local.
1. Preparação da cultura de órgãos e tratamento a laser
<ol><li>Obtenha olhos suínos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frios (4 °C) no meio águia modificado (DMEM) modificado de Dulbecco com alta glicose, suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina (1%) e soro suíno (10%), a partir de agora referido neste artigo como meio co...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. 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D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Os resultados deste estudo piloto indicam que um laser Nd:YAG pode ser usado para abmar seletivamente células endoteliais da córnea quando forem escolhidos parâmetros apropriados para dose de energia e posição de ponto de foco.
Como a função endotelial é importante para a transparência da córnea e para a salvaguarda da córnea a partir de edema estromo, os modelos de disfunção endotelial desempenham um papel importante no desenvolvimento de medicamentos anti-edematosos ou procedime...

A transparência da córnea é essencial para a transmissão da luz para a retina e seus fotorreceptores1. Nesse sentido, um estado relativo de desidratação é fundamental para manter as fibras de colágeno dentro do estroma da córnea corretamente alinhadas. Esta homeostase é mantida por células endoteliais córneas (CEC) localizadas na membrana de Descemet (DM)2. O endotélio é a camada córnea mais interna. Possui uma importante função de barreira e bomba, que é crucial para a transparência da córnea3. Em contraste com o epitélio, o endotélio não é capaz de se auto-renovar4. Portanto, qualquer dano celular causado por doença ou trauma estimula as células endoteliais remanescentes a aumentar e migrar, para cobrir defeitos resultantes e manter a funcionalidade da córnea5. No entanto, se a densidade do CEC cair abaixo de um limiar crítico, a descompensação do endotélio leva a um edema, resultando em visão turva e desconforto ou até mesmo dor severa4. Apesar da disponibilidade de medicamentos para aliviar os sintomas, atualmente o único tratamento definitivo nesses casos é o transplante de córnea, que pode ser realizado na forma de enxerto de espessura total ou transplante endotelial lamellar. Este último procedimento está disponível como a ceratoplastia endotelial de membrana de Descemet (DMEK), bem como a ceratoplastia automatizada de descascamento de Descemet (DSAEK)6. No entanto, a proteção da CEC remanescente e o aumento de sua sobrevivência podem ser um alvo alternativo, que precisa de um modelo de doença adequado para testar possíveis drogas terapêuticas.
Os modelos atuais de doença de perda de CEC concentram-se na destruição do endotélio através da injeção de agentes tóxicos (por exemplo, cloreto de benzalkonium) na câmara anterior ou por abrasão mecânica das células utilizando uma técnica de descemetorhexis invasiva7,8. Embora esses modelos estejam bem estabelecidos, existem desvantagens como a resposta inflamatória geral e danos colaterais imprecisos. Portanto, esses modelos são mais propensos a representar os estágios finais da doença, quando as opções cirúrgicas acima mencionadas são inevitáveis.
Com os avanços nas estratégias de tratamento celular, como células-tronco e terapia genética, a aplicação dessas terapias celulares poderia ser útil nos estágios iniciais da perda de CEC9. Posteriormente, precisamos de um modelo que represente esses estágios iniciais da doença de forma mais adequada. Nesse sentido, os modelos de cultura celular melhoraram na última década, mas ainda são limitados em sua validade, pois as células in vitro não podem chegar perto de replicar as interações complexas que ocorrem entre os diferentes tipos de células dentro da córnea10. Portanto, os modelos de doenças ex vivo e in vivo ainda estão em alta demanda e melhorar os existentes é de extremo interesse.
A cirurgia intraocular não invasiva por fotodisrupção usando um laser neodímio:YAG (Nd:YAG) tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas em todo o mundo desde sua introdução no final da década de 197011. A fotointerrupção depende da absorção de luz não linear que leva à formação de plasma, geração de ondas de choque acústicas e criação de bolhas de cavitação, sempre que o local de aplicação estiver localizado em um ambiente líquido12. Em geral, esses processos contribuem para o efeito pretendido do corte preciso do tecido. No entanto, eles também podem ser a fonte de danos colaterais desnecessários que limitam o confinamento local da cirurgia a laser13.
A previsão de efeitos mecânicos resultantes melhorou significativamente através da caracterização do curso de propagação e cavitação da onda de choque. Nosso objetivo é atingir a CEC com o mínimo de dano possível ao tecido circundante para fornecer um modelo de doença experimental não invasiva, assistida a laser para os estágios iniciais da perda de CEC. Para isso, é necessário determinar as energias e posições de pulso ideais dos pontos focais do laser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Os lasers Nd:YAG têm sido usados para realizar cirurgias intraoculares não invasivas, como a capsulotomia há várias décadas. O efeito incisivo depende da quebra óptica no foco do laser. Ondas de choque acústicas e bolhas de cavitação são geradas, causando ruptura tecidual. Os tamanhos das bolhas e as amplitudes de pressão variam com a energia do pulso e a posição do ponto focal. Neste estudo, os olhos de porco enucleados foram posicionados em frente a um laser Nd:YAG comercialmente disponível. Foram testadas energias de pulso variáveis, bem como diferentes posições dos pontos focais posteriores à córnea. As lesões resultantes foram avaliadas por microscopia e histologia de dois fótons para determinar os melhores parâmetros para um descolamento exclusivo de células endoteliais córneas (CEC) com dano colateral mínimo. As vantagens deste método são a ablação precisa da CEC, redução dos danos colaterais e, sobretudo, o tratamento sem contato.

Utilizando o procedimento aqui apresentado, tratamos os olhos com um laser Nd:YAG, avaliando diferentes energias de pulso (1,0-4,6 mJ) e posições de pontos focais (distância da superfície posterior da córnea: 0,0−0,2 mm) para encontrar os parâmetros ideais. Foram avaliadas múltiplas réplicas (n = 3) para cada constelação dos parâmetros do laser (12 x 21).
Além do protocolo acima mencionado, a amostra foi analisada com um microscópio de dois fótons antes da fixação e coloraç?...

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Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Os modelos atuais da doença para a perda de células endoteliais da córnea concentram-se na destruição do endotélio e, provavelmente, representam os estágios finais da doença quando o transplante de córnea é inevitável. Novos tratamentos usando células-tronco ou terapia genética, no entanto, estão agora disponíveis que poderiam ser mais úteis para os estágios iniciais da doença, os modelos para os quais faltam. A cirurgia intraocular não invasiva por fotodistração usando um laser Nd:YAG tornou-se um procedimento de rotina para oftalmologistas.Após a obtenção de olhos suínos recém-enucleados do matadouro local, coloque as amostras em quatro graus Celsius meio completo. Use uma tesoura para remover os tecidos extracelulares e mergulhe os olhos em solução oftalmômica de iodo povidona de 5% povidone por cinco minutos. Em seguida, coloque as amostras desinfetadas em PBS estéreis à temperatura ambiente.Usando um dispositivo de tomografia de coerência óptica de domínio espectral, tela os olhos para as principais patologias do segmento anterior, como cicatrizes córneas, edema e outras opacities. Após a triagem, posicione os olhos na frente de uma unidade de lâmpada de deslizamento equipada com um laser Nd:YAG com um comprimento de onda de 1.064 nanômetros e um diâmetro focal de 10 micrômetros no ar. Selecione a ampliação de 12X e desvie a iluminação para visualizar as camadas corneais individuais.Após definir a energia do pulso e o foco apontam para os parâmetros apropriados para a ablação seletiva das células endoteliais da córnea, aplique várias injeções a laser no tecido. Em seguida, sob um microscópio dissecando, coloque uma clara paracentese de córnea perto do limbus e injete viscoelstic para estabilizar a câmara anterior. Em seguida, use uma trefina de oito milímetros para extirpar a córnea central tratada a laser e coloque a córnea isolada em um poço de uma placa de 12 poços endotelial.Quando todas as córneas tiverem sido coletadas, adicione três milímetros de meio completo a cada amostra bem e incubar os espécimes por até três dias a 37 graus Celsius. No final da incubação, substitua o meio em cada poço por 4% de paraformaldeído sem metanol no tampão de Sorensen para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, coloque as amostras fixas em 20% de sacarose na PBS por cerca de uma hora até as córneas afundarem.Transfira as amostras para 30% de sacarose em PBS durante a noite antes de incorporar os tecidos em temperatura de corte ideal para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um conjunto criostat para menos 27 graus Celsius para obter seções de 10 micrômetros de espessura dos tecidos congelados coletando cada seção em um slide de microscópio dentro de um minuto após sua aquisição. Em seguida, armazene os slides a menos 80 graus Celsius até a coloração.Para a coloração de hematoxilina e eosina, o ar seque as seções congeladas por vários minutos para remover a umidade antes de colorir com hematoxilina filtrada de 0,1% Mayer por 10 minutos em um tubo de 50 mililitros. No final da incubação, enxágue os slides em água dupla destilada por cinco minutos em uma cuvette. Em seguida, mergulhe os slides em 0,5% eosin 10 vezes, seguido de mergulho enxaguando em água dupla destilada até que a eosina pare de estorar.Mergulhe os slides enxaguados 10 vezes em 50% de etanol e 10 vezes em 70% de etanol. Após a última queda de 70% do etanol, equilibre as seções em 95% de etanol por 30 segundos, seguido por 60 segundos em 100% etanol antes de várias quedas no xileno. Em seguida, monte os espécimes com deslizamento de tampa antes de obter imagens em um microscópio de luz.Duas imagens de microscopia de fótons e leves devem ser avaliadas independentemente como nenhum dano, muito dano ou quantidade correta de dano. Com base nessas avaliações, um mapa de calor pode então ser calculado para selecionar a constelação certa de parâmetros a laser para ablação seletiva das células endoteliais da córnea com danos mínimos ao tecido circundante. Análises anteriores determinaram que o ponto focal do laser deve estar pelo menos 0,15 milímetros atrás do endotélio córnea para a menor energia de pulso testada.Para energias de pulso superiores a 2,9 milijoules, a maior distância focal testada ainda está muito próxima do endotélio. Vários agentes citoprotetores podem ser testados enquanto os espécimes excisados estão em cultura. Se comprovadamente bem sucedidas, elas podem ser adicionadas à solução de irrigação para tratamento.

Research

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