Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
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Agradecemos a Christine y Jan A. M. Sochurek por su ayuda con métodos experimentales.

Todos los procedimientos relacionados con el tejido animal siguen las directrices del Comité local de cuidado y ética de los animales.
1. Preparación del cultivo de órganos y tratamiento con láser
<ol><li>Obtenga ojos porcinos recién enucledados del matadero local. Manténgalos frescos (4oC) en el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, complementado con L-glutamina, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina (1%), y suero porcino (10%), a partir de ahora mencion...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. 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D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Los resultados de este estudio piloto indican que un láser Nd:YAG se puede utilizar para ablar selectivamente las células endoteliales corneales cuando se eligen los parámetros adecuados para la dosis de energía y la posición del punto de enfoque.
Como la función endotelial es importante para la transparencia corneal y la protección de la córnea del edema estromales, los modelos de disfunción endotelial juegan un papel importante en el desarrollo de fármacos antiedematosos o procedim...

La transparencia de la córnea es esencial para la transmisión de la luz a la retina y sus fotorreceptores1. En este sentido, un estado relativo de deshidratación es fundamental para mantener las fibras de colágeno dentro del estroma corneal correctamente alineados. Esta homeostasis es mantenida por células endoteliales corneales (CEC) ubicadas en la membrana del Descemet (DM)2. El endotelio es la capa corneal más interna. Tiene una importante función de barrera y bomba, que es crucial para la transparencia corneal3. A diferencia del epitelio, el endotelio no es capaz de renovarse así mismo 4. Por lo tanto, cualquier daño celular causado por enfermedad o trauma estimula las células endoteliales restantes para agrandar y migrar, para cubrir los defectos resultantes y para mantener la funcionalidad corneal5. Sin embargo, si la densidad CEC cae por debajo de un umbral crítico, la descompensación del endotelio conduce a un edema, lo que resulta en visión borrosa y malestar o incluso dolor intenso4. A pesar de la disponibilidad de fármacos para aliviar los síntomas, actualmente el único tratamiento definitivo en estos casos es el trasplante de córnea, que se puede realizar en forma de un injerto de espesor completo o un trasplante endotelial lamelar. Este último procedimiento está disponible como queratoplastia endotelial de membrana (DMEK) de Descemet, así como como queratoplastia endotelial automatizada de Descemet (DSAEK)6. Sin embargo, la protección de la CEC restante y la mejora de su supervivencia podrían ser un objetivo alternativo, que necesita un modelo adecuado de enfermedad para probar posibles medicamentos terapéuticos.
Los modelos actuales de enfermedad por pérdida de CEC se centran en la destrucción del endotelio mediante la inyección de agentes tóxicos (por ejemplo, cloruro de benzalconio) en la cámara anterior o por abrasión mecánica de las células mediante una técnica invasiva dedescemetorhexis7,8. Si bien estos modelos están bien establecidos, existen desventajas como la respuesta inflamatoria general y los daños colaterales imprecisos. Por lo tanto, estos modelos son más propensos a representar las etapas finales de la enfermedad, cuando las opciones quirúrgicas antes mencionadas son inevitables.
Con los avances en las estrategias de tratamiento celular como las células madre y la terapia génica, la aplicación de estas terapias celulares podría ser útil en las primeras etapas de la pérdida de CEC9. Posteriormente, necesitamos un modelo que represente estas etapas tempranas de la enfermedad de manera más adecuada. En este sentido, los modelos de cultivo celular han mejorado en la última década, pero todavía están limitados en su validez, ya que las células in vitro no pueden acercarse a replicar las complejas interacciones que se producen entre los diferentes tipos de células dentro de la córnea10. Por lo tanto, los modelos de enfermedad ex vivo e in vivo siguen siendo muy demandados y mejorar los existentes es de suma interés.
La cirugía intraocular no invasiva por fotodisfial utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) se ha convertido en un procedimiento de rutina para oftalmólogos de todo el mundo desde su introducción a finales de la década de 197011. La fotorinterrupción se basa en la absorción de luz no lineal que conduce a la formación de plasma, generación de ondas de choque acústicas y creación de burbujas de cavitación, siempre que el sitio de aplicación se encuentra en un entorno líquido12. En general, estos procesos contribuyen al efecto previsto del corte preciso de tejidos. Sin embargo, también pueden ser la fuente de daños colaterales innecesarios que limitan el confinamiento local de la cirugía láser13.
La predicción de los efectos mecánicos resultantes ha mejorado significativamente a través de la caracterización del curso de propagación de ondas de choque y cavitación. Nuestro objetivo es atacar la CEC con el menor daño posible al tejido circundante para proporcionar un modelo de enfermedad experimental no invasiva, asistida por láser para las primeras etapas de la pérdida de CEC. Para ello, es necesario determinar las energías óptimas del pulso y las posiciones de los puntos focales del láser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Los láseres Nd:YAG se han utilizado para realizar cirugía intraocular no invasiva, como la capsulotomía desde hace varias décadas. El efecto incisivo se basa en la descomposición óptica en el foco láser. Se generan ondas de choque acústicas y burbujas de cavitación, causando ruptura del tejido. Los tamaños de burbuja y las amplitudes de presión varían con la energía del pulso y la posición del punto focal. En este estudio, los ojos porcinos enucleados se colocaron frente a un láser Nd:YAG disponible comercialmente. Se probaron las energías de pulso variables, así como las diferentes posiciones de los puntos focales posteriores a la córnea. Las lesiones resultantes fueron evaluadas por microscopía de dos fotones e histología para determinar los mejores parámetros para un desprendimiento exclusivo de células endoteliales corneales (CEC) con un daño colateral mínimo. Las ventajas de este método son la ablación precisa de la CEC, la reducción de los daños colaterales y, sobre todo, el tratamiento sin contacto.

Usando el procedimiento presentado aquí, tratamos los ojos con un láser Nd:YAG, evaluando diferentes energías de pulso (1.0-4.6 mJ) y posiciones de los puntos focales (distancia de la superficie posterior de la córnea: 0.0-0.2 mm) para encontrar los parámetros óptimos. Se evaluaron múltiples réplicas (n x 3) para cada constelación de los parámetros láser (12 x 21).
Además del protocolo antes mencionado, la muestra fue analizada con un microscopio de dos fotones antes de la fijació...

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Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Aquí, presentamos un protocolo para separar las células endoteliales corneales (CEC) de la membrana de Descemet (DM) utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) como modelo de enfermedad ex vivo para la queratopatía bullosa (BK).

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Los modelos actuales de enfermedades para la pérdida de células endoteliales corneales se centran en la destrucción del endotelio y más probablemente representan las etapas finales de la enfermedad cuando el trasplante de córnea es inevitable. Sin embargo, ahora están disponibles nuevos tratamientos con células madre o terapia génica que podrían ser más útiles para las primeras etapas de la enfermedad, cuyos modelos faltan. La cirugía intraocular no invasiva por fotodisrupción con un láser Nd:YAG se ha convertido en un procedimiento de rutina para los oftalmólogos.Después de obtener los ojos de cerdo recién enucleados del matadero local, coloque las muestras en cuatro grados Celsius medio completo. Use tijeras para extraer los tejidos extracelulares y remojar los ojos en una solución oftálmica de yodo 5%povidona durante cinco minutos. A continuación, coloque las muestras desinfectadas en PBS estériles a temperatura ambiente.Usando un dispositivo de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, examina los ojos para detectar las principales patologías del segmento anterior, como cicatrices corneales, edema y otras opacidades. Después del cribado, coloque los ojos delante de una unidad de lámpara deslizante equipada con un láser Nd:YAG con una longitud de onda de 1.064 nanómetros y un diámetro de punto focal de 10 micrómetros en el aire. Seleccione el aumento 12X y desvíe la iluminación para visualizar las capas corneales individuales.Después de establecer la energía del pulso y el punto de enfoque a los parámetros apropiados para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales, aplique varias tomas láser en el tejido. Luego, bajo un microscopio diseccionado, coloque una paracentesis clara de córnea cerca del limbo e inyecte viscoelástico para estabilizar la cámara anterior. A continuación, utilice una tretina de ocho milímetros para extirpar la córnea central tratada con láser y coloque la córnea aislada en un pozo de un lado endotelial de placa de 12 pozos hacia arriba.Una vez recolectadas todas las córneas, añada tres milímetros de medio completo a cada muestra e incubar los especímenes durante hasta tres días a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, reemplace el medio en cada pozo por 4%paraformaldehído libre de metanol en el tampón de Sorensen para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, coloque las muestras fijas en 20% sacarosa en PBS durante aproximadamente una hora hasta que las córneas se hundan.Transfiera las muestras a una sacarosa al 30% en PBS durante la noche antes de incrustar los tejidos a una temperatura de corte óptima para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Utilice un criostato establecido en menos 27 grados Celsius para obtener secciones de 10 micrómetros de espesor de los tejidos congelados que recogen cada sección en una diapositiva del microscopio dentro de un minuto después de que se adquiera. A continuación, guarde los portaobjetos a menos 80 grados centígrados hasta que se manche.Para la tinción de hematoxilina y eosina, seque al aire las secciones congeladas durante varios minutos para eliminar la humedad antes de mancharlas con hematoxilina filtrada de 0,1% de Mayer durante 10 minutos en un tubo de 50 mililitros. Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua doble destilada durante cinco minutos en una cubeta. A continuación, sumerja los toboganes en 0,5%eosina 10 veces, seguido de enjuagar en agua doble destilada hasta que la eosina deje de rayar.Sumerja los portaobjetos enjuagados 10 veces en 50%etanol y 10 veces en 70%etanol. Después de la última caída de 70%etanol, equilibre las secciones en 95%etanol durante 30 segundos, seguido de 60 segundos en 100%etanol antes de varias caídas en xileno. A continuación, monte las muestras con cubreobjetos antes de obtener imágenes en un microscopio de luz.Dos imágenes de microscopía de fotón y luz deben evaluarse de forma independiente como sin daños, demasiado daño o cantidad correcta de daño. Sobre la base de estas evaluaciones, se puede calcular un mapa de calor para seleccionar la constelación correcta de parámetros láser para la ablación selectiva de las células endoteliales corneales con un daño mínimo al tejido circundante. El análisis previo ha determinado que el punto focal del láser debe estar al menos 0,15 milímetros detrás del endotelio corneal para la energía de pulso más baja probada.Para las energías de pulso superiores a 2,9 milioules, la distancia focal más larga probada sigue siendo demasiado cercana al endotelio. Varios agentes citoprotectores pueden ser probados mientras los especímenes extirpados están en cultivo. Si se demuestra que tienen éxito, se pueden añadir a la solución de riego para el tratamiento.

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