Name: development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Vi tackar Christine Örün och Jan A. M. Sochurek för deras hjälp med experimentella metoder.

Alla försök som involverar djurvävnad följer den lokala djurvårds- och etikkommitténs riktlinjer.
1. Beredning av organkultur och laserbehandling
<ol><li>Få nyutbildade svinögon från det lokala slakteriet. Håll dem svala (4 °C) i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med hög glukos, kompletterad med L-glutamin, natriumpyruvat, penicillin/streptomycin (1%), och svin serum (10%), hädanefter kallas i denna artikel som fullt medium.</li>
	<li>Ta bort extracellulära vävnader med...

<ol>
	<li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+cornea.">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li><li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balance+between+corneal+transparency+and+edema:+the+Proctor+Lecture.">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li><li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+corneal+endothelium.">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, 389-424 (1990).</li><li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease.">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li><li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell.">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047 (2016).</li><li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty.">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li><li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy.">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li><li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium.">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation.">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li><li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery:+a+preliminary+report.">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li><li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium:+YAG+lasers.">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li><li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+Nd:YAG+laser+surgery:+laser-tissue+interaction,+damage+range,+and+reduction+of+collateral+effects.">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li><li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro.">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing.">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li><li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs:+histological+and+permeability+evaluation.">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li><li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas.">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li><li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells.">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).</li><li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+repair+following+Nd:YAG+laser+injury.">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd:+YAG+Laser.">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li><li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation.">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li><li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+damage+following+focal+laser+intervention.">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li></ol>

Resultaten av denna pilotstudie visar att en Nd:YAG-laser kan användas för att selektivt ablate hornhinnans endotelceller när lämpliga parametrar för energidos och fokuspunktsposition väljs.
Eftersom endotelfunktionen är viktig för hornhinnans öppenhet och skydda hornhinnan från stromal ödem, modeller av endotel dysfunktion spelar en viktig roll i utvecklingen av anti-edematous läkemedel eller kirurgiska ingrepp. Det finns flera etablerade in vitro-modeller för att härma in vivo ...

Insyn i hornhinnan är viktigt för överföring av ljus till näthinnan och dess fotoreceptorer1. I detta avseende är ett relativt tillstånd av uttorkning avgörande för att hålla kollagenfibrerna inom hornhinnans stroma korrekt anpassade. Denna homeostas underhålls av hornhinnans endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotel är det innersta hornhinnans skikt. Den har en viktig barriär och pump funktion, vilket är avgörande för hornhinnans öppenhet3. I motsats till epitelet kan endotelet inteförnyas 4. Därför stimulerar alla cellskador orsakade av sjukdom eller trauma de återstående endotelcellerna att förstora och migrera, för att täcka resulterande defekter och för att bibehålla hornhinnans funktionalitet5. Men om CEC densitet faller under en kritisk tröskel, decompensation av endotel leder till ett ödem, vilket resulterar i dimsyn och obehag eller till och med svår smärta4. Trots tillgången på läkemedel för att lindra symtom, för närvarande den enda slutgiltiga behandlingen i dessa fall är hornhinnans transplantation, som kan utföras i form av en full-tjocklek moderplantor eller en lamellar endotel transplantation. Det senare förfarandet finns som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemets strippning automatiserad endotel keratoplasty (DSAEK)6. Skyddet av återstående cec och öka deras överlevnad kan dock vara ett alternativt mål, som behöver en adekvat sjukdomsmodell för att testa potentiella terapeutiska läkemedel.
Nuvarande CEC förlust sjukdom modeller fokuserar på förstörelsen av endotel genom injektion av giftiga ämnen (t.ex. bensalkoniumklorid) i den främre kammaren eller genom mekanisk nötning av cellerna med hjälp av en invasiv descemetorhexis teknik7,,8. Även om dessa modeller är väl etablerade, nackdelar såsom allmän inflammatorisk reaktion och oprecisa indirekta skador finns. Därför är dessa modeller mer benägna att representera slutskedet av sjukdomen, när de ovan nämnda kirurgiska alternativen är oundvikliga.
Med framsteg inom cellulära behandlingsstrategier såsom stamceller och genterapi, tillämpningen av dessa cellulära terapier kan vara användbart i ett tidigt skede av CEC förlust9. Därefter behöver vi en modell som representerar dessa tidigare stadier av sjukdomen på ett mer adekvat sätt. I detta avseende, cellodling modeller har förbättrats under det senaste decenniet, men är fortfarande begränsade i sin giltighet, som celler in vitro kan inte komma i närheten av att replikera de komplexa interaktioner som uppstår mellan de olika celltyperna inom hornhinnan10. Därför är ex vivo- och in vivo-sjukdomsmodeller fortfarande i hög efterfrågan och att förbättra de befintliga är av yttersta intresse.
Noninvasive, intraokulär kirurgi genom fotosubkultion med hjälp av en neodym: YAG (Nd: YAG) laser har blivit ett rutinförfarande för ögonläkare över hela världen sedan introduktionen i slutet av 1970-talet11. Fotodisruption bygger på ickelinjär ljusabsorption som leder till bildandet av plasma, generering av akustiska chockvågor och skapande av kavitationsbubblor, när applikationsstället är beläget i en flytande miljö12. I allmänhet bidrar dessa processer till den avsedda effekten av exakt vävnadsskärning. Men de kan också vara källan till onödiga indirekta skador som begränsar den lokala inneslutning av laserkirurgi13.
Förutsägelsen av resulterande mekaniska effekter har förbättrats avsevärt genom karakterisering av chockvågens förökning och kavitationskurs. Det är vårt mål att rikta CEC med så lite skada på omgivande vävnad som möjligt för att ge en noninvasive, laser-assisted experimentell sjukdom modell för de tidiga stadierna av CEC förlust. För detta ändamål är det nödvändigt att bestämma de optimala pulsenergierna och positionerna för laserns fokalfläckar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:933px;" width="932">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">BARRON VACUUM TREPHINE</td>
			<td style="width:213px;">Katena</td>
			<td style="width:344px;">K20-2058</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E-15009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eye holder</td>
			<td>Self</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Na2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nd:YAG laser</td>
			<td>Zeiss Meditec</td>
			<td>visuLAS YAG II plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT Tissue Tek</td>
			<td>Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spectral-domain optical coherence tomograph</td>
			<td>Heidelberg Engineering</td>
			<td>Spectralis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Two-Photon Microscope</td>
			<td>JenLab</td>
			<td>DermaInspect</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Viscoelastic</td>
			<td>OmniVision</td>
			<td>Methocel</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a noninvasive, laser-assisted experimental model of corneal endothelial cell loss

Nd: YAG lasrar har använts för att utföra noninvasive intraokulär kirurgi, såsom capsulotomy i flera decennier nu. Den skarpt aktiverade effekten bygger på den optiska nedbrytningen vid laserfokus. Akustiska chockvågor och kavitationsbubblor genereras, vilket orsakar vävnadsbristning. Bubble storlekar och tryck amplituder varierar med puls energi och position i fokus. I denna studie, enucleated svin ögon placerades framför en kommersiellt tillgänglig Nd:YAG laser. Variabel puls energier samt olika positioner i fokalfläckarna posteriort till hornhinnan testades. Resulterande skador utvärderades av två foton mikroskopi och histologi för att bestämma de bästa parametrarna för en exklusiv avskildhet av hornhinnans endotel celler (CEC) med minsta indirekta skador. Fördelarna med denna metod är den exakta ablation av CEC, minskad oavsiktlig skada, och framför allt, den beröringsfria behandlingen.

Med hjälp av det förfarande som presenteras här behandlade vi ögon med en Nd:YAG-laser, utvärderar olika pulsenergier (1,0−4,6 mJ) och positioner av kontaktpunkter (avstånd från hornhinnans bakre yta: 0,0−0,2 mm) för att hitta de optimala parametrarna. Flera replikat (n = 3) utvärderades för varje konstellation av laserparametrarna (12 x 21).
Förutom ovanstående protokoll analyserades exemplaret med ett tvåfotonmikroskop före fixering och H&E-färgning. Den två-foton mikrosk...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss at JoVE.com

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Här presenterar vi ett protokoll för att lossa hornhinnans endotelceller (CEC) från Descemets membran (DM) med hjälp av en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sjukdom modell för bullous keratopathy (BK).

Utveckling av en noninvasive, Laser-Assisted experimentell modell av hornhinnans endotel cellförlust

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Nuvarande sjukdomsmodeller för hornhinnans endotel cellförlust fokusera på förstörelsen av endotel och mer sannolikt representerar de sista stadierna av sjukdomen när hornhinnans transplantation är oundviklig. Nya behandlingar med stamceller eller genterapi finns nu dock tillgängliga som kan vara mer användbara för de tidiga stadierna av sjukdomen, vars modeller saknas. Noninvasive intraokulära kirurgi genom photodisruption med hjälp av en Nd:YAG laser har blivit ett rutinförfarande för ögonläkare.Efter att ha erhållit nyutbildade svin ögon från det lokala slakteriet, placera proverna i fyra grader Celsius fullt medium. Använd sax för att ta bort de extracellulära vävnaderna och blöta ögonen i 5%povidone jod oftalmisk lösning i fem minuter. Därefter placerar du de desinficerade proverna i steril PBS i rumstemperatur.Med hjälp av en spektral domän optisk koherens tomografi enhet, skärm ögonen för större främre segmentet patologier såsom hornhinnans ärrbildning, ödem och andra opaciteter. Efter screening, placera ögonen framför en slip lampenhet utrustad med en Nd:YAG laser med en våglängd på 1, 064 nanometer och en fokal spot diameter på 10 mikrometer i luft. Välj 12X-förstoringen och avleda belysningen för att visualisera de enskilda hornhinnelagren.Efter inställning av pulsenergi och fokuspunkt till lämpliga parametrar för selektiv ablation av hornhinnans endotelceller, applicera flera laserskott på vävnaden. Sedan under en dissekera mikroskop, placera en klar hornhinna paracentesis nära limbus och injicera viskoelastiska att stabilisera den främre kammaren. Använd sedan en åtta millimeter trefin att punktskatt lasern behandlas centrala hornhinnan och placera den isolerade hornhinnan i en brunn av en 12-väl platta endotel sida upp.När alla hornhinnor har samlats in, tillsätt tre millimeter fullt medium till varje prov väl och inkubera exemplaren i upp till tre dagar vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, byt ut mediet i varje brunn med metanolfri 4%paraformaldehyd i Sorensens buffert för en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen, placera de fasta proverna i 20%sackaros i PBS i ungefär en timme tills hornhinnorna sjunker.Överför proverna till 30%sackaros i PBS över natten innan du bäddar in vävnaderna i optimal skärtemperatur för lagring vid minus 80 grader Celsius. Använd en kryostat inställd på minus 27 grader Celsius för att få 10 mikrometer tjocka delar av de frysta vävnader som samlar varje avsnitt på ett mikroskop bild inom en minut efter det förvärvas. Förvara sedan rutschkanorna vid minus 80 grader Celsius tills färgningen.För hematoxylin och eosinfärgning torkar luften de frusna sektionerna i flera minuter för att avlägsna fukt innan du färgar med filtrerad 0,1%Mayers hematoxylin i 10 minuter i ett 50 milliliterrör. Vid slutet av inkubationen, skölj diabilderna i dubbeldestillerat vatten i fem minuter i en cuvette. Därefter doppa diabilderna i 0,5%eosin 10 gånger, följt av doppsköljning i dubbelt destillerat vatten tills eosin slutar strimma.Doppa sköljda objektglasen 10 gånger i 50%etanol och 10 gånger i 70%etanol. Efter den sista 70%etanoldippen, jämvikt sektionerna i 95%etanol i 30 sekunder, följt av 60 sekunder i 100%etanol före flera dopp i xylen. Montera sedan proverna med täckskydd innan du erhåller bilder på ett ljusmikroskop.Två foton- och ljusmikroskopibilder ska utvärderas oberoende som ingen skada, för mycket skada eller korrekt skademängd. Baserat på dessa bedömningar kan en värmekarta sedan beräknas för att välja rätt konstellation av laserparametrar för selektiv ablation av de hornhinnans endotelceller med minimal skada på den omgivande vävnaden. Tidigare analys har fastställt att brännpunkten för lasern måste vara minst 0,15 millimeter bakom hornhinnans endotel för lägsta pulsenergi som testas.För pulsenergier som är högre än 2,9 millijoule är det längsta brännavstånd som testas fortfarande för nära endotelet. Olika cytoprotective medel kan testas medan de strukna exemplaren är i kultur. Om det bevisats framgångsrikt, kan de läggas till bevattningslösningen för behandling.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopic Aorta Transplantation: En Rat modell för att studera utvecklingen av kronisk vaskulopati

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Hornhinnan donatorvävnad Förberedelse för Endothelial keratoplasti

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-bränna Skada Modell av hornhinneneovaskularisering i musen

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murina hornhinnetransplantation: En modell för att studera vanligaste formen av organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hornhinnan donatorvävnad Förberedelse för Descemets Membrane Endothelial Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Evaluation of a Novel Laser-assisted Coronary Anastomotic Connector - the Trinity Clip - in a Porcine Off-pump Bypass Model

Utvärdering av en roman Laser-assisted Coronary anastomotic Connector - treenigheten Clip - i ett Svin Off-pump Bypass Modell

To simplify and facilitate beating heart (i.e., off-pump), minimally invasive coronary artery bypass surgery, a new coronary anastomotic connector, the ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neural stamcellstransplantation i experimentell Contusive Modell av ryggmärgsskada

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

In vivo- spårning av ödemutveckling och mikrovaskulär patologi i en modell av experimentell cerebral malaria med användning av magnetisk resonansbildning

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

En experimentell modell av kost-inducerad metabola syndromet i kanin: metodologiska överväganden, utveckling och bedömning

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...