Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 81430099 و 31500704) ، ومشاريع التعاون والتبادل الدولي (رقم المنحة 2014DFA32950) ، وبرنامج البحوث من جامعة بكين للطب الصيني ( أرقام المنح BUCM-2019-JCRC006 و 2019-JYB-TD013).

وقد استعرضت جامعة بكين جميع الإجراءات التجريبية ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها بالطب الصيني.
ملاحظة: تم استخدام الفئران C57BL/6 (7-8 أسابيع من العمر).
1- عزل العدلات
<ol><li>اقتناء الخلايا الطاردة للبُرُقُيّة البُرُيّة<ol>
<li>إعداد الطازجة 10٪ محلول البر?...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

بروتوكولات مفصلة من العدلات عالية النقاء من الدم المحيطي7، نخاع العظام والأنسجة18 كانت متاحة لفترة طويلة. هنا نعتمد طريقة لعزل العدلات من السائل البتوني19 التي العدلات ناضجة لا تزال معطلة لمزيد من الدراسات المضادة للالتهابات والمضادة للأكسدة.
<p class...

العدلات هي خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتمثل 50-70٪ من إجمالي خلايا الدم البيضاء في البشر1. العدلات هي واحدة من المستجيبين الأولية خلال الالتهاب الحاد. يمكن تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines الصادرة عن الخلايا المقيمة في الأنسجة2،3،4، والتي تتوسطها التفاعلات بين جزيئات التصاق الخلية على سطح العدلات وخلايا بطانة الرحم الوعائية5. العدلات أساسية لاستضافة الدفاع وتلعب دورا في ردود الفعل الالتهابية المرضية بسبب قدرتها القوية على تلف الأنسجة عن طريق إطلاق أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) وغيرها من الجزيئات الضارة بالأنسجة3،6.
وقد وصفت الدراسات السابقة العديد من بروتوكولات العزلة العدلات من الفئران أو البشر. أوه وآخرون أظهرت طريقة فصل التدرج الكثافة لعزل العدلات البشرية من الدم البشري كله7. ومع ذلك ، فإن عزل العدلات الكافية من دم الفئران أمر صعب بسبب حجم الدم الصغير. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من العدلات الماوس نقية وقابلة للحياة من السائل الماوس الجانبية، ويمكن استخدام هذه العدلات تنقية الجسم الحي لفحص عدة جوانب من وظائف الخلوية في الجسم الحي، بما في ذلك تسلل العدلات، والهجرة، chemotaxis، انفجار الأكسدة، cytokine وفخ خارج الخلية (NET) الإنتاج8. يمكن استخدام المقالات عبر ويل9 أو مقالات غرفة Zigmond10،11 لتقييم هجرة العدلات في المختبر. ويستخدم نموذج الحقيبة الهوائية لتقييم الهجرة وتسلل العدلات في الجسم الحي. نموذج الحقيبة الهوائية تحت الجلد هو نموذج مناسب في الجسم الحي لدراسة هجرة الخلايا الالتهابية.
تقليديا ، كانت تعتبر العدلات مزيلات مسببات الأمراض في المراحل الحادة من الالتهاب. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن العدلات هي خلايا معقدة تؤدي مجموعة كبيرة ومتنوعة من الوظائف المتخصصة. العدلات يمكن تنظيم العديد من العمليات مثل الإصابة الحادة والإصلاح، تولد الورم، استجابة المناعة الذاتية، والالتهاب المزمن12،13. العدلات أيضا تعديل الاستجابات المناعية التكيفية ويمكن تنظيم الخلايا B والخلايا التائية14،15. نقص كبير في العدلات يؤدي إلى الوفيات أو نقص المناعة الحاد في البشر واستنفاد العدلات في الفئران يؤدي إلى الوفاة، في حين أن التنشيط المفرط أو تجنيد العدلات في الأعضاء يسبب العديد من الأمراض المناعية، مثل التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) والذئبة اللامعة الجهازية (SLE)6. العدلات هي الخلايا الأكثر وفرة في السائل الزليلي لمرضى RA. العدلات تنتج كميات مفرطة من النقويبأوكسيديز (MPO) والإيلاستاز العدلات (NE) عن طريق التدهور، مما يؤدي إلى تفاقم تآكل الغضاريف. MPO هو إنزيم بيروكسيديز أعرب عنه أساسا في حبيبات العدلات16. ويرتبط NE مع تدمير الغضاريف المفصلية17. يمكن استخدام MPO و NE لتقييم حالة هجرة العدلات والتسلل في أنسجة مرضى RA.
توفر هذه المقالة ثلاث طرق تقليدية لتقييم هجرة العدلات العادية المستحثة في كل من الجسم الحي والمختبر ، وكذلك تسلل العدلات المرضية في نموذج التهاب مشترك خاص بالماوس.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

العدلات هي عضو رئيسي في الجهاز المناعي الفطري وتلعب أدوارًا محورية في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض وردود الفعل الالتهابية المرضية. يمكن تجنيد العدلات في مواقع الالتهاب عن طريق توجيه السيتوكينات وchemokines. يمكن أن يؤدي التسلل الساحق من العدلات إلى تلف الأنسجة العشوائية، كما هو الحال في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA). العدلات المعزولة من exudate الباسيتي تستجيب لchemoattractant محددة، N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)، في المختبر في ترانسويل أو زغموند غرفة المقالات. يمكن استخدام تجربة الحقيبة الهوائية لتقييم الضريبة الكيميائية للالعدلات نحو البوليس الدهني (LPS) في الجسم الحي. وكثيرا ما يستخدم نموذج الماوس التهاب المفاصل الناجم عن الساعد (AA) في البحوث RA، وتلطيخ الهيستوكيميائية المناعية للأقسام المشتركة مع مكافحة النقوي (MPO) أو اللاستاز المضادة للالعدلات (NE) هو وسيلة راسخة لقياس قياس تسلل العدلات. يمكن استخدام هذه الطرق لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.

تم جمع الخلايا الطاردة البريتونية من سائل اللاعف من الفئران. أعيد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI-1640 متوسطة كاملة، الطبقات على خطوتين (54.8٪/70.2٪) من تدرج الكثافة المتقطع(الشكل 1A)،والطرد المركزي عند 1500 × ز لمدة 30 دقيقة. تم استرداد العدلات (≥95٪، ~ 1 × 10<s...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

هنا، نقدم ثلاث طرق لتقييم الهجرة العدلات والتسلل في كل من الجسم الحي وفي المختبر. ويمكن استخدام هذه الأساليب لاكتشاف العلاجات الواعدة التي تستهدف هجرة العدلات.

الكشف عن الهجرة وتسلل العدلات في الفئران

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

هذه الطريقة تحاول وصف ثلاث طرق تستخدم بشكل متكرر لتقييم هجرة العدلات العادية في الجسم الحي وفي المختبر وكذلك تسلل العدلات المرضية في نموذج التهاب المفاصل الماوس. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة يمكن أن تكون مفيدة للباحثين الآخرين في هذا المجال. يحتوي هذا البروتوكول على التفاصيل المنهجية لتقييم قدرة الهجرة من العدلات في مواقع الالتهاب باستخدام مقايسة الحقيبة الهوائية والتهاب المفاصل المستحث.الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو علاج التهاب المفاصل من خلال مقارنة المجموعة النموذجية مع مجموعة العلاج. هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الأمراض الالتهابية ويمكن تطبيقها على مرض التهاب الأمعاء. وسوف يكون إثبات الإجراء تشينغي لو وهايكو جيانغ، طلاب الدراسات العليا من مختبرنا.بعد تخدير الفئران في اليوم صفر، استخدم فلتر 0.22 ميكرون تعلق على حقنة خمسة ملليلتر للحصول على حجم ثلاثة ملليلتر من الهواء المعقم. رفع الجلد الخلفي من الفأر تخدير مع ملاقط واستخدام تحت الجلد قياس 26 من قبل 3/8 إبرة بوصة لحقن ثلاثة ملليلترات من الهواء تعقيم. بعد العلاج ، قم بإزالة الفئران من وحدة التنفس ووضعها في قفص جيد.مراقبة الفئران لضمان أنها على قيد الحياة حتى تبدأ في التحرك. وفي اليوم الثالث، حقن ثلاثة ملليلترات إضافية من الهواء المعقم في الجيب الجوي الذي سبق إنشاؤه للحفاظ على الحقيبة الهوائية. في اليوم السادس، تحقن علاجات مختلفة في الحقيبة الهوائية.حقن ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني كتحكم سلبي وحقن ملليلتر واحد من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر LPS كتحكم إيجابي للحث على التهاب المحلية. بعد ست ساعات، ضحي بالفئران لكل حقيبة هوائية، تحقن مليلتراً واحداً من عازلة الغسيل لغسل الحقيبة الهوائية وجمع الناضحات الالتهابية في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر.ثم غسل الحقيبة الهوائية مع مليلترين من العازلة غسل مرتين وجمع نضح التهاب في نفس أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 100 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من غسل العازلة.عد الخلايا لتحديد نسبة العدلات باستخدام محلل أمراض الدم التلقائي. تعليق كامل فريوند مساعد من خلال دوامة ما لا يقل عن خمس ثوان، ثم رسم 100 ميكرولترات من التعليق في حاقن الأنسولين. بعد تخدير, علامة مخلب المختار وحقن 20 microliters من مساعد فرويند كاملة من حاقن في أربع بقع حولية على مساحة مفصل الكاحل.ضع الفئران المعالجة في الغرفة الجديدة مراقبة الفئران للتأكد من أنها تتنفس حتى أنها استعادة القدرة على التحرك. كل ثلاثة أيام، واستخدام مقياس سمك الجيب لقياس قطر مفصل الكاحل.أيضا، تقييم شدة التهاب المفاصل من قبل معيار تسجيل التهاب المفاصل. الصفر طبيعي لا يوجد دليل على الحمامي والتورم.واحد هو التهاب المفاصل الاخف. اريثيما وتورم خفيف محصور في التارسال أو مفصل الكاحل. اثنان هو التهاب المفاصل المعتدل.اريثيما وتورم خفيف يمتد من الكاحل إلى التارسال. ثلاثة هو التهاب المفاصل الحاد. Erythema وتورم معتدل تمتد من الكاحل إلى المفاصل مشط القدم.أربعة هو التهاب المفاصل الأكثر شدة. الحمامي وتورم شديد تشمل الكاحل, قدم, والأرقام, أو ankylosis من الطرف. بعد التضحية بالماوس، قم بإزالة الجلد وجزء من العضلات من الساق الخلفية باستخدام الملاقط والمقص.رش المفصل مع 70٪ الإيثانول وإزالة بقية العضلات باستخدام منشفة ورقية. إصلاح مفصل الكاحل في 4٪ شبهformaldehyde لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة. ثم decalcify المشترك في 10٪ EDTA لمدة شهر واحد في درجة حرارة الغرفة وتغيير متوسط أسبوعيا.بعد شهر واحد، ضع الأنسجة في قالب ملحوظ مع حجم معين من البارافين السائل في حوالي 60 درجة مئوية لتضمين الأنسجة. بارد لفترة وجيزة. تعيين سمك على microtome في أربعة ميكرومتر وقطع شرائح.ثم تعويم المقاطع في حمام مائي 43 درجة مئوية لفترة قصيرة لتوسيع المقاطع. جبل المقاطع على الشرائح ووضع الشرائح في الفرن في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين. للاستخدام في المستقبل، والحفاظ على الشرائح في ناقص 20 درجة مئوية.بعد ذلك، ضع الشرائح في رف وأجر الغسلات في الزيلين والإيثانول وفقًا للمخطوطة لإعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، يغسل في مياه الصنبور الجارية لمدة ثلاث دقائق. ثم وصمة عار في 0.1٪ حل أخضر سريع لمدة خمس دقائق.شطف في 1٪ حمض الخليك لمدة 10 ثوان وصمة عار في 0.1٪ صفرارنين O تلطيخ حل لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، غمر الشرائح في محلولي غسل الزيلين والإيثانول وفقا للمخطوطة. جبل أقسام الأنسجة على مرحلة الكائن ومراقبة الأنسجة تحت المجهر.لتصور العدلات، أداء التلطخ الكيميائي المناعي عن طريق الخبز أولا أقسام البارافين لمدة ساعتين في 78 درجة مئوية. ضع الشرائح في رف وأجر الزيلين والإيثانول والماء وبساح PBS وفقًا للمخطوطة لإعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة. ثم إضافة قطرة واحدة من عازلة permeabilization لتغطية الأنسجة.احتضان المقاطع في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. تجنب شطف الأنسجة مباشرة.بعد ذلك، تنفيذ المستضد الناجم عن الحرارة استرجاع epitope. ترتيب الشرائح في رف. غمر الشرائح في المرجل الضغط مليئة المخزن المؤقت للاسترجاع.ضعي غلاية الضغط في فرن الميكروويف واضبطي فرن الميكروويف على 600 واط واسخني الشرائح لمدة 10 دقائق. بعد الغليان، والحفاظ على الشرائح في المرجل لتبرد إلى 90 درجة مئوية. أخرج الشرائح وشطفها في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات.إخماد نشاط البيروكسيديز الذاتية، غمر الشرائح في إعداد حديثا 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. مخطط دائرة كبيرة حول العينة مع قلم مبيد للماء.تجنب لمس العينة. إضافة على عينة 50 إلى 100 ميكرولترات من 3٪ البوم مصل البقر لمنع ووضع العينات في غرفة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم قم بإزالة حل الحظر.أضف 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة لبرنامج تلفزيوني إلى كل قسم بسرعة. احتضان الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثاني، أخرج الدرج واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.ثم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. إضافة 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة. يحتضن الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.ثم شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث دقائق ثلاث مرات. تطوير في محلول DAB المخفف لمدة خمس دقائق. تجنب تطور لون داكن بسبب رد الفعل المفرط للـ DAB.شطف الشرائح في الماء المقطر. قم بـ Counterstain الشرائح في الهماوكسيلين لمدة 10 ثوان واشطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة خمس دقائق. شطف في حمض الكحول سوبر حل التمايز السريع لمدة ثلاث ثوان، ثم شطف في مياه الصنبور لمدة 10 دقائق.اغمر الشرائح في الإيثانول ويغسل الزيلين في درجة حرارة الغرفة وفقًا للمخطوطة. إصلاح الغطاء مع حل تصاعد. مراقبة الأنسجة تحت المجهر.في هذه الدراسة، أجريت تجارب الحقيبة الهوائية للتحقيق في تجنيد العدلات التي حفزت عليها LPS في الجسم الحي. وكانت المجموعات الفرعية الكريات البيض في الحقيبة الهوائية exudates أعلى بكثير مما كانت عليه في السيطرة. بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، أظهرت مجموعة التهاب المفاصل المستحثة بـ adjuvant وذمة كبيرة في مخلب.زاد قطر مفصل الكاحل وارتفع نتيجة التهاب المفاصل باستمرار. تلف الغضاريف هو المتلازمة التمثيلية لالتهاب المفاصل الروماتويدي. تسبب التحدي CFA كمية كبيرة من تسلل الكريات البيض، وتآكل الغضاريف الكبيرة، وتضخم الزلق الزليلي.MPO في أي مستويات التعبير هي علامات تمثيلية لتسلل العدلات التي كانت مُنَتَكَّلة بشكل ملحوظ في القسم المشترك. تأكد من حقن الهواء في الجلد، ولكن ليس في العضلات. يمكننا أيضا التحقيق في تشكيل الفخاخ خارج الخلية العدلات عن طريق التلطيخ المناعية الكيميائية من أقسام أنسجة الكاحل المشتركة مع المضادة p84 أو هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة الأمراض الالتهابية الأخرى مثل مرض التهاب الأمعاء.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

التصوير خيوط متوسطة وميكروتوبوليس مع الفحص المجهري 2-الأبعاد التعمير البصرية العشوائية المباشرة

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

الببتيد40 موب للاستخدام في الكشف عن أحداث التهاب العَدلات بوساطة

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

الكشف عن وتوصيف البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

الكشف عن إنشاء إمدادات الدم المشتركة في الفئران الباربايوتيك عن طريق حقن الجلوكوز في الوريد Caudal

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

هجرة خدش فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

عزل العدلات البشرية من الدم الكامل والمعاطف بافي

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...