Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud numre 81430099 og 31500704), Internationalt samarbejde og udvekslingsprojekter (tilskud nummer 2014DFA32950), og forskningsprogram af Beijing University of Chinese Medicine ( tilskudsnumre NEM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).

Alle eksperimentelle procedurer blev gennemgået og godkendt af Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
BEMÆRK: C57BL/6 mus (7-8 uger gamle) blev brugt.
1. Neutrofil isolation
<ol><li>Erhvervelse af peritoneale ekssudatceller<ol>
<li>Forbered frisk 10% proteose peptone opløsning i ddH2O. Beregn den nødvendige mængde i henhold til antallet af mus. BEMÆRK: Indstil antallet af mus som N(2N+1) ml opløsning skal opløse...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Detaljerede protokoller af højt rensede neutrofiler fra perifert blod7,knoglemarv og væv18 har været tilgængelige i lang tid. Her vedtager vi en metode til at isolere neutrofiler fra peritoneal væske19, hvor modne neutrofiler forbliver inaktiveret for yderligere anti-inflammatoriske og antioxidant undersøgelser.
Vi brugte luftpose eksperimentet til at udforske LPS-induceret infiltration af neutrofiler in vivo. Denne ...

Neutrofiler er de mest rigelige hvide blodlegemer og tegner sig for 50-70% af hele hvide blodlegemer population hos mennesker1. Neutrofiler er en af de primære responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation ssteder via vejledning af cytokiner og chemokiner frigivet af væv-hjemmehørende celler2,3,4, som formidles af samspillet mellem celle vedhæftning molekyler på overfladen af neutrofiler og vaskulære endothelium celler5. Neutrofiler er grundlæggende for at være vært for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaktioner på grund af deres magtfulde evne til at skade væv via frigivelse af reaktive iltarter (ROS) og andre vævsskadelige molekyler3,6.
Tidligere undersøgelser har beskrevet flere neutrofile isolationprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerede en densitetgradient separation metode til at isolere menneskelige neutrofiler fra hele humant blod7. Men isolationen af tilstrækkelige neutrofiler fra museblod er vanskelig på grund af den lille blodvolumen. Alternativt kan et stort antal rene og levedygtige mus neutrofiler fremkaldes fra museperitoneal væske, og disse rensede neutrofiler kan bruges ex vivo til at undersøge flere aspekter af cellulære funktioner ex vivo, herunder neutrofil infiltration, migration, kemotaxis, oxidativ brast, cytokin og neutrophil ekstracellulære fælde (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer assays10,11 kan bruges til at vurdere neutrofile migration in vitro. Luftposemodellen bruges til at evaluere migration og infiltration af neutrofiler in vivo. Den subkutane luft pose model er en bekvem in vivo dyremodel til at studere migration af inflammatoriske celler.
Traditionelt blev neutrofiler betragtet som patogeneliminatorer i akutte faser af inflammation. Men, nylige resultater har vist, at neutrofiler er komplicerede celler, der udfører en betydelig række specialiserede funktioner. Neutrofiler kan regulere mange processer såsom akut skade og reparation, tumorigenese, autoimmun reaktion, og kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerer også adaptive immunrespons og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på neutrofiler fører til dødelighed eller svær immundefekt hos mennesker og neutrofiludtynding hos mus fører til dødsfald, mens overdreven aktivering eller rekruttering af neutrofiler i organer forårsager flere immunsygdomme, såsom leddegigt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler er de mest rigelige celler i synovial væsken af RA patienter. Neutrofiler producerer store mængder myeloperoxidase (MPO) og neutrofile elastase (NE) via nedbrydning, hvilket forværrer bruskerosion. MPO er et peroxidaseenzym, der hovedsagelig udtrykkes i granulatet af neutrofiler16. NE er forbundet med artikulær brusk ødelæggelse17. MPO og NE kunne anvendes til at vurdere status for neutrofil migration og infiltration i væv af RA patienter.
Denne artikel indeholder tre konventionelle metoder til at evaluere migration af normale neutrofiler induceret både in vivo og in vitro, samt infiltration af patologiske neutrofiler i en mus fælles-specifik inflammation model.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Neutrofiler er et vigtigt medlem af det medfødte immunsystem og spiller afgørende roller i værtsforsvaret mod patogener og patologiske inflammatoriske reaktioner. Neutrofiler kan rekrutteres til inflammation websteder via vejledning af cytokiner og chemokiner. Overvældende infiltration af neutrofiler kan føre til vilkårlige vævsskader, såsom i leddegigt (RA). Neutrofiler isoleret fra peritoneal ekssudat reagere på en defineret kemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammer analyser. Den luft pose eksperiment kan bruges til at evaluere kemotaxis af neutrofiler mod lipopolysaccharid (LPS) in vivo. Den adjuvanske-induceret arthritis (AA) musemodel anvendes ofte i RA-forskning, og immunhistokemisk farvning af fælles sektioner med anti-myeloperoxidase (MPO) eller anti-neutrofile elastase (NE) antistoffer er en veletableret metode til at måle neutrofil infiltration. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende behandlinger rettet mod neutrofile migration.

Peritoneale ekssudatceller blev indsamlet fra lavage væske af mus. Cellerne blev ophængt igen i 1 ml RPMI-1640 komplet medium, lagdelt på en to-trins (54,8% /70.2%) diskontinuerlig densitetsgradient (figur 1A) og centrifugeret ved 1.500 x g i 30 min. Neutrophils (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) blev inddrevet fra den nederste grænseflade (figur 1B).
<p class="jove_co...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Her præsenterer vi tre metoder til at vurdere neutrofil migration og infiltration både in vivo og in vitro. Disse metoder kan bruges til at opdage lovende terapeutiske målretning neutrofile migration.

Afsløring af migration og infiltration af neutrofiler i mus

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Denne metode forsøger at beskrive tre hyppigt anvendte metoder til evaluering af migration af normale neutrofiler in vivo og in vitro samt infiltration af patologiske neutrofiler i muse arthritis model. Vi mener, at denne metode kan være nyttig for andre forskere på dette område. Denne protokol indeholder de metodologiske detaljer til at vurdere migration kapacitet neutrofiler i inflammation steder ved hjælp af luft pose assay og adjuvans-induceret arthritis.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod gigtbehandling ved at sammenligne modelgruppen med behandlingsgruppen. Denne metode kan give indsigt i inflammatorisk sygdom og kan anvendes til inflammatorisk tarmsygdom. Demonstration af proceduren vil være Qingyi Lu og Haixu Jiang, post-graduate studerende fra vores laboratorium.Efter bedøvelse af musene på dag nul, skal du bruge en 0,22 mikron filter fastgjort til en fem milliliter sprøjte for at opnå en tre milliliter volumen af steriliseret luft. Løft ryghuden på den bedøvede mus med pincet og subkutant bruge en 26 gauge ved 3/8 tommer nål til at injicere tre milliliter af den steriliserede luft. Efter behandling skal musene fjernes fra åndedrætsenheden og placere dem i et bur med godt sæt.Overvåg musene for at sikre, at de er i live, indtil de begynder at bevæge sig rundt. På dag tre injiceres yderligere tre milliliter steriliseret luft i den tidligere etablerede luftlomme for at opretholde luftposen. På dag seks, injicere forskellige behandlinger i luftposen.Der injiceres en milliliter PBS som en negativ kontrol, og der injiceres en milliliter et mikrogram pr. milliliter LPS som den positive kontrol for at fremkalde lokal inflammation. Efter seks timer, ofre musene. For hver luftpose skal der injiceres en milliliter vaskebuffer for at vaske luftposen og opsamle den inflammatoriske ekssudat i et 15 millilitercentrifugerør.Derefter vaskes luftposen med to milliliter vaskepude to gange, og den inflammatoriske ekssudat opsamres i samme centrifugerør. Centrifuge ved 100 gange g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og opslæm cellerne i en milliliter vaskebuffer.Tæl cellerne for at kvantificere neutrofieforholdet ved hjælp af den automatiske hæmatologianalysator. Suspendere komplet Freund's adjuvans ved vortexing mindst fem sekunder, derefter trække 100 mikroliter af suspension i en insulininjektor. Efter bedøvelse, markere den valgte pote og injicere 20 mikroliter af komplet Freund's adjuvans fra injektoren i fire periarticular pletter på anklen fælles rum.Sæt de forarbejdede mus i det nye kammer. Overvåg musene for at sikre, at de trækker vejret, indtil de genvinder evnen til at bevæge sig. Hver tredje dag, bruge en lommetykkelse gauge til at måle ankelleddet diameter.Også, vurdere arthritis sværhedsgraden af arthritis scoring kriterium. Nul er normalt. Ingen tegn på erythema og hævelse.Den ene er den mildeste gigt. Erythema og mild hævelse begrænset til tarsals eller ankel fælles. To er den moderate gigt.Erythema og mild hævelse strækker sig fra anklen til tarsals. Tre er den alvorlige gigt. Erythema og moderat hævelse strækker sig fra anklen til metatarsal leddene.Fire er den mest alvorlige gigt. Erythema og svær hævelse omfatter ankel, fod, og cifre, eller ankylose i lemmerne. Efter at have ofret musen, fjerne huden og en del af musklen fra bagbenet med pincet og saks.Spray leddet med 70% ethanol og fjern resten af musklerne ved hjælp af en køkkenrulle. Fix ankelleddet i 4% paraformaldehyd i to dage ved stuetemperatur. Derefter afkalke fælles i 10% EDTA i en måned ved stuetemperatur og ændre mediet ugentligt.Efter en måned, placere vævet i en markant form med visse mængder af flydende paraffin på ca 60 grader Celsius at integrere vævet. Cool kort. Indstil tykkelsen på mikrotomen på fire mikrometer og skær skiver.Derefter flyde sektionerne i en 43 grader Celsius vandbad i en kort tid for at udvide sektionerne. Monter sektionerne på dias og sæt dias i ovnen ved 70 grader Celsius i to timer. Til fremtidig brug skal du bevare diasene ved minus 20 grader Celsius.Dernæst placere dias i en rack og udføre vasker i xylen og ethanol i henhold til manuskriptet til at rehydrere ved stuetemperatur. Endelig vaskes i rindende vand fra hanen i tre minutter. Derefter pletten i 0,1% hurtig grøn opløsning i fem minutter.Skyl i 1%eddikesyre i 10 sekunder og plet i 0,1% Safranin O farvning opløsning i 20 minutter. Derefter nedsænkes rutsjebanerne i xylen- og ethanolvaskeopløsningerne i henhold til manuskriptet. Monter vævssektionerne på objektstadiet, og overhold vævene under et mikroskop.At visualisere neutrofiler, udføre immunhistokemiske farvning ved først at bage paraffin sektioner i to timer ved 78 grader Celsius. Placer dias i en rack og udføre xylen, ethanol, vand og PBS vasker i henhold til manuskriptet til at rehydrere ved stuetemperatur. Derefter tilsættes en dråbe permeabilization buffer til at dække vævet.Inkuber sektionerne i en fugtighedskontrolleret bakke ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Derefter skylles objektglassene i PBS i tre minutter tre gange. Undgå at skylle vævet direkte.Dernæst udføre varme-induceret antigen epitope hentning. Arranger diasene i et rack. Nedsænk objektglassene i trykkedlen fyldt med hentningsbuffer.Sæt trykkedelen i mikrobølgeovnen og sæt mikrobølgeovnen til 600 watt og varm objektglassene i 10 minutter. Efter kogning, holde dias i kedlen til at køle til 90 grader Celsius. Tag rutsjebanerne ud og skyl dem i PBS i tre minutter tre gange.For at slukke endogene peroxidase aktivitet, nedsænkes dias i frisklavet 3% hydrogenperoxid ved stuetemperatur i 15 minutter. Skyl lysbilleder i PBS i tre minutter tre gange. Kontur en stor cirkel omkring prøven med en hydrofob pen.Undgå at røre ved prøven. Læg 50 til 100 mikroliter af 3% kvæg serumalbumin på prøven for at blokere og anbringe prøverne i et fugtighedsstyret kammer ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Fjern derefter blokeringsløsningen.Tilsæt hurtigt 50 mikroliter PBS fortyndet primært antistof til hver sektion. Inkuber diasene i en fugtighedskontrolleret bakke ved fire grader Celsius natten over. På den anden dag skal du tage bakken ud og lade den stå ved stuetemperatur i 30 minutter.Skyl derefter objektglassene i PBS i tre minutter tre gange. Der tilsættes 50 mikroliter PBS fortyndede sekundære antistoffer til vævene. Inkuber dias i en fugtighedsstyret bakke ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Skyl derefter objektglassene i PBS i tre minutter tre gange. Udvikles i fortyndet DAB opløsning i fem minutter. Undgå udvikling af en mørk farve forårsaget af overreaktion af DAB.Skyl rutsjebanerne i destilleret vand. Counterstain dias i hæmatomxylin i 10 sekunder og skyl dias i vand fra hanen i fem minutter. Skyl i syre alkohol super hurtig differentiering løsning i tre sekunder, derefter skylles i postevand i 10 minutter.Nedsænk rutsjebanerne i ethanol og xylen vasker ved stuetemperatur i henhold til manuskriptet. Fastgør dækslæbet med monteringsopløsning. Overhold vævet under et mikroskop.I denne undersøgelse blev der udført luftposeforsøg for at undersøge den neutrofil rekruttering stimuleret af LPS in vivo. Leukocyt delmængder i luftposen ekssudater var meget højere end i kontrollen. Sammenlignet med kontrolgruppen viste den adjuverende inducerede arthritisgruppe signifikant ødem i poten.Ankelleddet diameter steg og arthritis score steg konsekvent. Brusk skader er det repræsentative syndrom af leddegigt. CFA udfordring induceret en stor mængde leukocyt infiltration, betydelig brusk erosion, og synovial hyperplasi.MPO i ethvert udtryk niveauer er repræsentative markører for neutrofil infiltration, som blev væsentligt upregulated i den fælles sektion. Sørg for, at luften sprøjtes ind i huden, men ikke ind i musklen. Vi kan også undersøge dannelsen af neutrofil ekstracellulære fælder ved immunhistokemisk farvning af ankelleddet væv sektioner med anti-p84 eller Disse metoder kan bruges til at studere andre inflammatoriske sygdomme såsom inflammatorisk tarmsygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering til påvisning af Forskellige genekspressionsmønstre i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Afsløring somatiske genetiske ændringer i tumor Prøver af Exon Capture og Massively Parallel sekventering

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration og invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

MUB40 peptid til brug i forbindelse med afsløring neutrofile-medieret betændelse begivenheder

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Påvisning og karakterisering af protein selvsamling in vivo ved flow cytometri

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Afsløring Etablering af fælles blodforsyning i parabiotiske mus ved Caudal Veneglucose Injektion

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

En omkostningseffektiv og fleksibel Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolering af menneskelige neutrofiler fra fuldblod og buffy frakker

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...