Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81430099 en 31500704), Internationale Samenwerkings- en Uitwisselingsprojecten (subsidienummer 2014DFA32950) en het onderzoeksprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine ( subsidienummers BUCM-2019-JCRC006 en 2019-JYB-TD013).

Alle experimentele procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
LET OP: C57BL/6 muizen (7-8 weken oud) werden gebruikt.
1. Neutrofiele isolatie
<ol><li>Verwerving van peritoneale ex-ex-datecellen<ol>
<li>Bereid verse 10% proteose peptone oplossing in ddH2O. Bereken het volume dat nodig is op basis van het aantal muizen. OPMERKING: Stel het aantal muizen in als N, (2N+1) mL o...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Gedetailleerde protocollen van sterk gezuiverde neutrofielen uit perifeer bloed7,beenmerg en weefsels18 zijn beschikbaar voor een lange tijd. Hier nemen we een methode aan om neutrofielen te isoleren van peritoneale vloeistof19 waarin volwassen neutrofielen geïnactiveerd blijven voor verdere ontstekingsremmende en antioxidantstudies.
We gebruikten het luchtzakje experiment om de LPS-geïnduceerde infiltratie van neutrofie...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcellen en zijn goed voor 50−70% van de hele witte bloedcellen populatie bij de mens1. Neutrofielen zijn een van de primaire responders tijdens acute ontsteking. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines vrijgegeven door weefsel-resident cellen2,3,4, die wordt bemiddeld door de interacties tussen celhechting moleculen op het oppervlak van neutrofielen en vasculaire endothehelium cellen5. Neutrofielen zijn van fundamenteel belang voor de verdediging en spelen een rol in pathologische ontstekingsreacties vanwege hun krachtige vermogen om weefsel te beschadigen door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere weefselbeschadigende moleculen3,6.
Eerdere studies hebben verschillende neutrofiele isolatieprotocollen van muizen of mensen beschreven. Oh et al. demonstreerde een dichtheidgradiëntscheidingsmethode om menselijke neutrofielen te isoleren van heel menselijk bloed7. Echter, de isolatie van voldoende neutrofielen van muisbloed is moeilijk vanwege het kleine bloedvolume. Als alternatief kunnen grote aantallen zuivere en levensvatbare muisneutrofielen worden ontlokt uit muisperitoneale vloeistof, en deze gezuiverde neutrofielen kunnen ex vivo worden gebruikt om verschillende aspecten van cellulaire functies ex vivo te onderzoeken, waaronder neutrofiele infiltratie, migratie, chemotaxis, oxidatieve uitbarsting, cytokine en neutrofiele extracellulaire val (NET) productie8. Transwell assays9 of Zigmond kamer assays10,11 kan worden gebruikt om neutrofiele migratie in vitro te evalueren. Het luchtzakjemodel wordt gebruikt om de migratie en infiltratie van neutrofielen in vivo te evalueren. Het onderhuidse luchtzakjemodel is een handig in vivo diermodel om de migratie van ontstekingscellen te bestuderen.
Traditioneel werden neutrofielen beschouwd als pathogene eliminators in acute ontstekingsfasen. Recente bevindingen hebben echter aangetoond dat neutrofielen gecompliceerde cellen zijn die een aanzienlijke verscheidenheid aan gespecialiseerde functies uitvoeren. Neutrofielen kunnen veel processen reguleren, zoals acuut letsel en reparatie, tumorigenese, auto-immuunrespons en chronische ontsteking12,13. Neutrofielen moduleren ook adaptieve immuunreacties en kunnen B-cellen en T-cellenreguleren 14,15. Een groot tekort aan neutrofielen leidt tot sterfte of ernstige immunodeficiëntie bij mensen en neutrofiele uitputting bij muizen leidt tot dodelijk ongeval, terwijl overmatige activering of rekrutering van neutrofielen in organen verschillende immuunziekten veroorzaakt, zoals reumatoïde artritis (RA) en systemische lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofielen zijn de meest voorkomende cellen in de synoviale vloeistof van RA-patiënten. Neutrofielen produceren overmatige hoeveelheden myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastasase (NE) via afbraak, wat kraakbeenerosie verergert. MPO is een peroxidase enzym voornamelijk uitgedrukt in de korrels van neutrofielen16. NE wordt geassocieerd met gewrichtskraakbeen vernietiging17. MPO en NE kunnen worden gebruikt om de status van neutrofiele migratie en infiltratie in het weefsel van RA-patiënten te evalueren.
Dit artikel biedt drie conventionele methoden om de migratie van normale neutrofielen geïnduceerd, zowel in vivo als in vitro, te evalueren, evenals de infiltratie van pathologische neutrofielen in een muisgewrichtspecifiek ontstekingsmodel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Neutrofielen zijn een belangrijk lid van het aangeboren immuunsysteem en spelen een centrale rol in de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers en pathologische ontstekingsreacties. Neutrofielen kunnen worden aangeworven om ontstekingsites via de begeleiding van cytokines en chemokines. Overweldigende infiltratie van neutrofielen kan leiden tot willekeurige weefselschade, zoals bij reumatoïde artritis (RA). Neutrofielen geïsoleerd van peritoneale exudate reageren op een gedefinieerde chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell of Zigmond kamer testen. Het luchtzakje experiment kan worden gebruikt om de chemotaxis van neutrofielen in de richting van lipopolysaccharide (LPS) in vivo te evalueren. Het adjuvante-geïnduceerde artritis (AA) muismodel wordt vaak gebruikt in RA-onderzoek, en immunohistochemische kleuring van gewrichtssecties met anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) antilichamen is een gevestigde methode om te meten neutrofiele infiltratie. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Peritoneale ex-exudate cellen werden verzameld uit lavage vloeistof van muizen. Cellen werden opnieuw onderbroken in 1 mL RPMI-1640 volledig medium, gelaagd op een twee-staps (54,8%/70,2%) discontinu dichtheidsgradiënt(figuur 1A) en gecentrifugeerd bij 1.500 x g gedurende 30 min. Neutrofielen (≥95%, ~1 x 107 neutrofielen/muis) werden teruggewonnen uit de onderste interface (figuur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Hier presenteren we drie methoden om neutrofiele migratie en infiltratie zowel in vivo als in vitro te beoordelen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om veelbelovende therapieën te ontdekken die gericht zijn op neutrofiele migratie.

Detecteren van migratie en infiltratie van neutrofielen bij muizen

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Deze methode probeert drie veelgebruikte methoden te beschrijven voor het evalueren van de migratie van normale neutrofielen in vivo en in vitro, evenals de infiltratie van pathologische neutrofielen in het model van muisartritis. Wij denken dat deze methode nuttig kan zijn voor andere onderzoekers op dit gebied. Dit protocol bevat de methodologische details om de migratiecapaciteit van neutrofielen in de ontstekingsplaatsen te evalueren met behulp van luchtzaktest en adjuvante-geïnduceerde artritis.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de artritis therapie door het vergelijken van de modelgroep met de behandelingsgroep. Deze methode kan inzicht geven in ontstekingsziekten en kan worden toegepast op inflammatoire darmziekte. Het aantonen van de procedure zal Qingyi Lu en Haixu Jiang, post-graduate studenten van ons lab.Na verdovenderij van de muizen op dag nul, gebruik een 0,22 micron filter bevestigd aan een vijf milliliter spuit om een drie milliliter volume van gesteriliseerde lucht te verkrijgen. Til de achterhuid van de verdoofde muis met een pincet en onderhuids gebruik maken van een 26 meter door 3 / 8 inch naald om drie milliliter van de gesteriliseerde lucht injecteren. Verwijder na de behandeling de muizen uit de ademhalingseenheid en plaats ze in een goed ingestelde kooi.Controleer de muizen om ervoor te zorgen dat ze leven totdat ze beginnen te bewegen. Op dag drie, injecteer een extra drie milliliter gesteriliseerde lucht in de eerder gevestigde luchtzak om de luchtzak te ondersteunen. Injecteer op dag zes verschillende behandelingen in het luchtzakje.Injecteer een milliliter PBS als een negatieve controle en injecteer een milliliter van een microgram per milliliter LPS als de positieve controle om lokale ontsteking te induceren. Na zes uur, offer de muizen op. Voor elk luchtzakje, injecteer een milliliter wasbuffer om het luchtzakje te wassen en het inflammatoire exsudaat te verzamelen in een 15 milliliter centrifugebuis.Was vervolgens het luchtzakje twee keer met twee milliliter wasbuffer en verzamel het ontstekingsexsudaat in dezelfde centrifugebuis. Centrifuge op 100 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg en stel de cellen opnieuw op in één milliliter wasbuffer.Tel de cellen om de neutrofiele verhouding te kwantificeren met behulp van de automatische hematologie analyzer. Schors complete Freund's adjuvans door vortexing ten minste vijf seconden, dan trekken 100 microliter suspensie in een insuline-injector. Na het verdoven, markeer de gekozen poot en injecteer 20 microliter van complete Freund's adjuvans van de injector in vier periarticulaire vlekken op de enkelgewricht ruimte.Zet de verwerkte muizen in de nieuwe kamer. Controleer de muizen om ervoor te zorgen dat ze ademen totdat ze weer in staat zijn om te bewegen. Om de drie dagen, gebruik maken van een zak dikte meter om de enkelgewricht diameter te meten.Ook, beoordelen artritis ernst door artritis scoren criterium. Nul is normaal. Geen bewijs van erythema en zwelling.Een daarvan is de mildste artritis. Erythema en milde zwelling beperkt tot de tarsals of enkelgewricht. Twee is de matige artritis.Erythema en milde zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot de tarsals. Drie is de ernstige artritis. Erythema en matige zwelling die zich uitstrekt van de enkel tot middenvoetsbeentjes gewrichten.Vier is de meest ernstige artritis. Erythema en ernstige zwelling omvatten de enkel, voet en cijfers, of ankylk van de ledemaat. Na het opofferen van de muis, verwijder de huid en een deel van de spier uit het achterbeen met een pincet en schaar.Spray het gewricht met 70% ethanol en verwijder de rest van de spieren met behulp van een papieren handdoek. Bevestig het enkelgewricht in 4%paraformaldehyde gedurende twee dagen bij kamertemperatuur. Ontkalken het gewricht vervolgens in 10%EDTA gedurende een maand bij kamertemperatuur en verander het medium wekelijks.Na een maand, plaats het weefsel in een gemarkeerde mal met een bepaald volume van vloeibare paraffine op ongeveer 60 graden Celsius om het weefsel in te bedden. Koel even af. Stel de dikte op het microtome op vier micrometer en snijd plakjes.Vervolgens drijven de secties in een 43 graden Celsius waterbad voor een korte tijd om de secties uit te breiden. Monteer de secties op dia's en zet de dia's in de oven op 70 graden Celsius voor twee uur. Voor toekomstig gebruik, bewaar de dia's op min 20 graden Celsius.Plaats vervolgens de dia's in een rek en voer wasbeurten uit in xyleen en ethanol volgens het manuscript om te hydrateren bij kamertemperatuur. Tot slot, wassen in stromend leidingwater gedurende drie minuten. Dan vlek in 0,1%snel groene oplossing voor vijf minuten.Spoel 1% azijnzuur gedurende 10 seconden en vlek in 0,1%Safranin O kleuroplossing gedurende 20 minuten. Daarna u de dia's onderdompelen in de xyleen- en ethanolwasoplossingen volgens het manuscript. Monteer de weefselsecties op het objectstadium en observeer de weefsels onder een microscoop.Om neutrofielen te visualiseren, voert u immunohistochemische vlekken uit door eerst de paraffinesecties twee uur te bakken bij 78 graden Celsius. Plaats de dia's in een rek en voer de xyleen, ethanol, water en PBS wast volgens het manuscript te hydrateren bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens een druppel permeabilisatie buffer om het weefsel te dekken.Incubeer de secties in een vochtigheidsgecontroleerde lade op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Daarna drie maal drie minuten in PBS spoelen. Vermijd het spoelen van het weefsel direct.Voer vervolgens warmte-geïnduceerde antigeen epitoop retrieval uit. Schik de glijbanen in een rek. Dompel de glijbanen onder in de drukketel gevuld met ophaalbuffer.Zet de drukketel in de magnetron en zet de magnetron op 600 watt en verwarm de glijbanen gedurende 10 minuten. Na het koken, houd de dia's in de ketel om af te koelen tot 90 graden Celsius. Haal de glijbanen eruit en spoel ze drie keer drie minuten in PBS.Om de endogene peroxidaseactiviteit te doven, dompel je de glijbanen 15 minuten onder in vers bereide 3%waterstofperoxide bij kamertemperatuur. Spoel dia's in PBS drie minuten drie keer. Schets een grote cirkel rond het monster met een hydrofobe pen.Raak het monster niet aan. Voeg aan het monster 50 tot 100 microliter van 3% runderserum albumine toe om de monsters gedurende 60 minuten in een door vochtigheidsgraad gecontroleerde kamer op 37 graden Celsius te plaatsen. Verwijder vervolgens de blokkeringsoplossing.Voeg snel 50 microliter PBS verdund primair antilichaam toe aan elke sectie. Incubeer de glijbanen in een vochtigheidsgecontroleerde lade op vier graden Celsius 's nachts. Neem op de tweede dag de lade eruit en laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.Spoel vervolgens de glijbanen in PBS drie minuten drie keer. Voeg 50 microliter PBS verdunde secundaire antilichamen toe aan de weefsels. Incubeer glijdt in een vochtigheidsgecontroleerde lade op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Spoel vervolgens de glijbanen in PBS drie minuten drie keer. Ontwikkel in verdunde DAB-oplossing gedurende vijf minuten. Vermijd de ontwikkeling van een donkere kleur veroorzaakt door overreactie van de DAB.Spoel de glijbanen in gedestilleerd water. Verdring de glijbanen in hematoxylin gedurende 10 seconden en spoel de glijbanen vijf minuten in leidingwater. Spoel in zure alcohol super snelle differentiatie oplossing voor drie seconden, dan spoel in leidingwater gedurende 10 minuten.Dompel de dia's onder in de ethanol en xyleen wast bij kamertemperatuur volgens het manuscript. Bevestig de coverslip met montageoplossing. Observeer het weefsel onder een microscoop.In deze studie werden luchtzakexperimenten uitgevoerd om de door LPS in vivo gestimuleerde rekrutering van neutrofiele te onderzoeken. De leukocyten subsets in de lucht zak exselt waren veel hoger dan in de controle. Vergeleken met de controlegroep vertoonde de door adjuvant veroorzaakte artritisgroep significant oedeem in de poot.De enkelgewricht diameter verhoogd en de artritis score steeg consequent. Kraakbeenschade is het representatieve syndroom van reumatoïde artritis. CFA uitdaging veroorzaakte een grote hoeveelheid leukocyten infiltratie, aanzienlijke kraakbeen erosie, en synoviale hyperplasie.MPO in elke expressie niveaus zijn representatieve markers van neutrofiele infiltratie die aanzienlijk werden upregulated in de gezamenlijke sectie. Zorg ervoor dat de lucht wordt geïnjecteerd in de huid, maar niet in de spier. We kunnen ook de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen onderzoeken door immunohistochemische kleuring van de enkelgewrichtsweefselsecties met anti-p84 of Deze methoden kunnen worden gebruikt om andere ontstekingsziekten zoals inflammatoire darmziekte te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro cel-migratie en invasie assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Detecteren van de totstandbrenging van gedeelde bloedtoevoer in parabiotische muizen door Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...