Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (numéros de subvention 81430099 et 31500704), international Cooperation and Exchange Projects (numéro de subvention 2014DFA32950), et le programme de recherche de l’Université de médecine chinoise de Beijing ( numéros de subvention BUCM-2019-JCRC006 et 2019-JYB-TD013).

Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Beijing.
REMARQUE : Des souris C57BL/6 (7-8 semaines) ont été employées.
1. Isolement de Neutrophile
<ol><li>Acquisition de cellules exsudatrices péritonéaux<ol>
<li>Préparer la solution peptone protéose fraîche de 10% dans ddH2O. Calculez le volume nécessaire en fonction d...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Des protocoles détaillés de neutrophiles hautement purifiés provenant du sang périphérique7, de la moelle osseuse et des tissus18 sont disponibles depuis longtemps. Ici nous adoptons une méthode d’isoler des neutrophiles du fluide péritonéal19 dans lequel les neutrophiles mûrs restent inactivés pour d’autres études anti-inflammatoires et antioxydantes.
Nous avons utilisé l’expérience de poche d’air pou...

Les neutrophiles sont les globules blancs les plus abondants et représentent 50 à 70 % de l’ensemble de la population de globules blancs chez l’homme1. Les neutrophiles sont l’un des principaux intervenants pendant l’inflammation aigue. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de la direction des cytokines et des chimiokines libérées par les cellules de tissu-résident2,3,4, qui est médiée par les interactions entre les molécules d’adhérence cellulaire à la surface des neutrophiles et des cellules endothéliumvasculaires 5. Les neutrophiles sont fondamentaux pour accueillir la défense et jouent un rôle dans les réactions inflammatoires pathologiques en raison de leur capacité puissante à endommager les tissus par la libération d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et d’autres molécules tissulairesnuisibles 3,6.
Des études antérieures ont décrit plusieurs protocoles d’isolement des neutrophiles de souris ou d’humains. Oh et coll. ont démontré une méthode de séparation de gradient de densité pour isoler les neutrophiles humains du sang humain entier7. Cependant, l’isolement des neutrophiles suffisants du sang de souris est difficile en raison du petit volume sanguin. Alternativement, un grand nombre de neutrophiles purs et viables de souris peuvent être obtenus du fluide péritonéal de souris, et ces neutrophiles purifiés peuvent être employés ex vivo pour examiner plusieurs aspects des fonctions cellulaires ex vivo, y compris l’infiltration de neutrophile, migration, chemotaxis, burstoxydative, cytokine et neutrophil extracellulaire de production (NET)8. Transwell analyse9 ou Zigmond essais de chambre10,11 peut être utilisé pour évaluer la migration neutrophile in vitro. Le modèle de poche d’air est utilisé pour évaluer la migration et l’infiltration des neutrophiles in vivo. Le modèle sous-cutané de poche d’air est un modèle animal in vivo commode pour étudier la migration des cellules inflammatoires.
Traditionnellement, les neutrophiles étaient considérés comme des éliminateurs pathogènes dans les phases aigues de l’inflammation. Cependant, les résultats récents ont prouvé que les neutrophiles sont des cellules compliquées qui exécutent une variété significative de fonctions spécialisées. Neutrophils peuvent réguler de nombreux processus tels que les blessures et la réparation aigus, tumorigenesis, réponse auto-immune, et l’inflammation chronique12,13. Les neutrophiles modulent également les réponses immunitaires adaptatives et peuvent réguler les cellules B et les lymphocytes T14,15. La pénurie substantielle de neutrophiles entraîne la mortalité ou une grave immunodéficience chez l’homme et l’épuisement des neutrophiles chez la souris entraîne une mortalité, tandis qu’une activation ou un recrutement excessif de neutrophiles dans les organes provoque plusieurs maladies immunitaires, telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’érythématatus systémique (SLE)6. Les neutrophiles sont les cellules les plus abondantes dans le liquide synovial des patients atteints de PR. Les neutrophiles produisent des quantités excessives de myeloperoxidase (MPO) et d’élastase de neutrophile (NE) par dégradation, ce qui exacerbe l’érosion du cartilage. MPO est une enzyme peroxidase principalement exprimée dans les granules de neutrophiles16. NE est associé à la destruction du cartilage articulaire17. MPO et NE pourraient être utilisés pour évaluer l’état de la migration des neutrophiles et l’infiltration dans le tissu des patients atteints de PR.
Cet article fournit trois méthodes conventionnelles pour évaluer la migration des neutrophiles normaux induits in vivo et in vitro, aussi bien que l’infiltration des neutrophiles pathologiques dans un modèle d’inflammation joint-spécifique de souris.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Les neutrophiles sont un membre important du système immunitaire inné et jouent un rôle central dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes et les réactions inflammatoires pathologiques. Les neutrophiles peuvent être recrutés sur des sites d’inflammation par l’intermédiaire de cytokines et de chemokines. L’infiltration écrasante des neutrophiles peut mener aux dommages aveugles de tissu, tels que dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les neutrophiles isolés de l’exsudation péritonéale répondent à un chimioattractant défini, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro dans les essais de chambre de Transwell ou de Zigmond. L’expérience de poche d’air peut être employée pour évaluer la chimiotaxis des neutrophiles vers le lipopolysaccharide (LPS) in vivo. Le modèle de souris de l’arthrite adjuvant-induite (AA) est fréquemment employé dans la recherche de RA, et la coloration immunohistochemical des sections articulaires avec des anticorps anti-myeloperoxidase (MPO) ou anti-neutrophile d’élastase (NE) est une méthode bien établie pour mesurer neutrophile infiltration. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Des cellules d’exsudat péritonéal ont été rassemblées du fluide de lavage des souris. Les cellules ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu complet RPMI-1640, superposées sur une double étape (54,8 %/70,2 %) gradient de densité discontinu (Figure 1A), et centrifugé à 1 500 x g pendant 30 min. Les neutrophiles (95 %, 1 x 107 neutrophiles/souris) ont été récupérés à partir de l’interface infér...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Ici, nous présentons trois méthodes pour évaluer la migration et l’infiltration de neutrophiles in vivo et in vitro. Ces méthodes peuvent être utilisées pour découvrir des thérapies prometteuses ciblant la migration des neutrophiles.

Détection de la migration et de l’infiltration des neutrophiles chez les souris

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Cette méthode tente de décrire trois méthodes fréquemment utilisées pour évaluer la migration des neutrophiles normaux in vivo et in vitro ainsi que l’infiltration de neutrophiles pathologiques dans le modèle de l’arthrite de souris. Nous pensons que cette méthode pourrait être utile pour d’autres chercheurs dans ce domaine. Ce protocole contient les détails méthodologiques pour évaluer la capacité de migration des neutrophiles dans les sites d’inflammation en utilisant l’analyse de poche d’air et l’arthrite induite par l’adjuvant.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie d’arthrite en comparant le groupe modèle avec le groupe de traitement. Cette méthode pourrait fournir un aperçu de la maladie inflammatoire et peut être appliquée aux maladies inflammatoires de l’intestin. Qingyi Lu et Haixu Jiang, étudiants de troisième cycle de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Après anesthésie des souris le jour zéro, utilisez un filtre de 0,22 micron attaché à une seringue de cinq millilitres pour obtenir un volume de trois millilitres d’air stérilisé. Soulevez la peau arrière de la souris anesthésiée avec des pinces à épiler et utilisez sous-cutanéement une aiguille de calibre 26 par 3/8 pouces pour injecter trois millilitres de l’air stérilisé. Après le traitement, retirez les souris de l’unité respiratoire et placez-les dans une cage bien fixée.Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles sont vivantes jusqu’à ce qu’elles commencent à se déplacer. Le troisième jour, injectez trois millilitres supplémentaires d’air stérilisé dans la poche d’air précédemment établie pour soutenir la poche d’air. Le sixième jour, injectez différents traitements dans la poche d’air.Injectez un millilitre de PBS comme un contrôle négatif et injectez un millilitre d’un microgramme par millilitre de LPS comme le contrôle positif pour induire l’inflammation locale. Après six heures, sacrifiez les souris. Pour chaque poche d’air, injectez un millilitre de tampon de lavage pour laver la poche d’air et recueillir l’exsudate inflammatoire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.Lavez ensuite la poche d’air avec deux millilitres de tampon de lavage deux fois et recueillez l’exsudate inflammatoire dans le même tube de centrifugeuse. Centrifugeuse à 100 fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en un millilitre de tampon de lavage.Comptez les cellules pour quantifier le rapport neutrophile à l’aide de l’analyseur automatique d’hématologie. Suspendez l’adjuvant complet de Freund en vortexant au moins cinq secondes, puis dessinez 100 microlitres de suspension dans un injecteur d’insuline. Après anesthésie, marquer la patte choisie et injecter 20 microlitres de l’adjuvant complet de Freund de l’injecteur en quatre taches périarticulaires sur l’espace articulaire de la cheville.Mettez les souris traitées dans la nouvelle chambre. Surveillez les souris pour s’assurer qu’elles respirent jusqu’à ce qu’elles retrouvent la capacité de bouger. Tous les trois jours, utilisez une jauge d’épaisseur de poche pour mesurer le diamètre de l’articulation de la cheville.Évaluez également la gravité de l’arthrite par critère de notation de l’arthrite. Zéro est normal. Aucune évidence de l’érythème et de l’enflure.L’une est l’arthrite la plus légère. Érythème et gonflement léger confiné aux tarsaux ou à l’articulation de la cheville. Deux est l’arthrite modérée.Érythème et gonflement léger s’étendant de la cheville aux tarsals. Trois est l’arthrite sévère. Érythème et gonflement modéré s’étendant de la cheville aux articulations métatarsiennes.Quatre est l’arthrite la plus grave. L’érythème et l’enflure grave englobent la cheville, le pied et les chiffres, ou l’ankylose du membre. Après avoir sacrifié la souris, retirez la peau et une partie du muscle de la patte arrière avec des pinces à épiler et des ciseaux.Vaporiser l’articulation avec 70% d’éthanol et enlever le reste des muscles à l’aide d’une serviette en papier. Fixer l’articulation de la cheville en paraformaldéhyde à 4% pendant deux jours à température ambiante. Ensuite, décalcifier l’articulation en 10%EDTA pendant un mois à température ambiante et changer le milieu hebdomadaire.Après un mois, placez le tissu dans un moule marqué avec un certain volume de paraffine liquide à environ 60 degrés Celsius pour intégrer le tissu. Refroidir brièvement. Réglez l’épaisseur sur le microtome à quatre micromètres et coupez les tranches.Faites ensuite flotter les sections dans un bain d’eau de 43 degrés Celsius pendant une courte période pour agrandir les sections. Montez les sections sur des toboggans et mettez les glissières dans le four à 70 degrés Celsius pendant deux heures. Pour une utilisation future, conservez les glissières à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, placez les glissières dans une grille et effectuez des lavages au xylène et à l’éthanol selon le manuscrit pour les réhydrater à température ambiante. Enfin, laver l’eau courante du robinet pendant trois minutes. Puis tacher dans la solution verte rapide de 0,1% pendant cinq minutes.Rincer à 1% d’acide acétique pendant 10 secondes et tacher en solution de coloration Safranin O à 0,1% pendant 20 minutes. Après cela, plongez les diapositives dans les solutions de lavage au xylène et à l’éthanol selon le manuscrit. Montez les sections tissulaires sur le stade de l’objet et observez les tissus au microscope.Pour visualiser les neutrophiles, effectuer des taches immunohistochimiques en faisant cuire d’abord les sections de paraffine pendant deux heures à 78 degrés Celsius. Placez les glissières dans une grille et effectuez les lavages de xylène, d’éthanol, d’eau et de PBS selon le manuscrit pour les réhydrater à température ambiante. Ajoutez ensuite une goutte de tampon de perméabilisation pour couvrir le tissu.Incuber les sections dans un plateau contrôlé par l’humidité à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, rincer les diapositives dans PBS pendant trois minutes trois fois. Évitez de rincer le tissu directement.Ensuite, effectuez la récupération d’épitope d’antigène induite par la chaleur. Disposer les glissières dans une grille. Immerger les glissières dans la chaudière sous pression remplie de tampon de récupération.Mettez la chaudière sous pression dans le four à micro-ondes et réglez le four à micro-ondes à 600 watts et chauffez les glissières pendant 10 minutes. Après ébullition, garder les glissières dans la chaudière pour les refroidir jusqu’à 90 degrés Celsius. Sortez les toboggans et rincez-les dans PBS pendant trois minutes trois fois.Pour étancher l’activité endogène de la peroxyde, plongez les glissières dans du peroxyde d’hydrogène fraîchement préparé à 3 % à température ambiante pendant 15 minutes. Rincer les diapositives dans PBS pendant trois minutes trois fois. Décrire un grand cercle autour de l’échantillon à l’intérieur d’un stylo hydrophobe.Évitez de toucher l’échantillon. Ajouter sur l’échantillon de 50 à 100 microlitres d’albumine sérique bovine à 3 % pour bloquer et placer les échantillons dans une chambre à humidité contrôlée à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Retirez ensuite la solution de blocage.Ajouter rapidement 50 microlitres d’anticorps primaires dilués PBS à chaque section. Incuber les glissières dans un plateau contrôlé par l’humidité à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le deuxième jour, sortez le plateau et laissez-le reposer à température ambiante pendant 30 minutes.Rincez ensuite les glissières dans PBS pendant trois minutes trois fois. Ajouter 50 microlitres d’anticorps secondaires dilués PBS aux tissus. Incuber glisse dans un plateau contrôlé par l’humidité à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Rincez ensuite les glissières dans PBS pendant trois minutes trois fois. Développez-vous dans la solution DAB diluée pendant cinq minutes. Évitez le développement d’une couleur foncée causée par la réaction excessive du DAB.Rincer les diapositives à l’eau distillée. Contrestain les diapositives en hématoxyline pendant 10 secondes et rincer les diapositives à l’eau du robinet pendant cinq minutes. Rincer à l’acide la solution de différenciation super rapide de l’alcool pendant trois secondes, puis rincer à l’eau du robinet pendant 10 minutes.Plongez les diapositives dans l’éthanol et le xylène se lave à température ambiante selon le manuscrit. Fixez le coverslip avec la solution de montage. Observez le tissu au microscope.Dans cette étude, des expériences de poche d’air ont été exécutées pour étudier le recrutement de neutrophile stimulé par LPS in vivo. Les sous-ensembles de leucocytes dans les exsudats de poche d’air étaient beaucoup plus élevés que dans le contrôle. Comparé au groupe témoin, le groupe arthritique adjuvant-induit a montré l’oedème significatif dans la patte.Le diamètre de l’articulation de la cheville a augmenté et le score d’arthrite a augmenté de façon constante. Les dommages de cartilage sont le syndrome représentatif de la polyarthrite rhumatoïde. Le défi de CFA a induit une grande quantité d’infiltration de leucocyte, érosion significative de cartilage, et hyperplasie synovial.Les MPO dans n’importe quels niveaux d’expression sont des marqueurs représentatifs de l’infiltration de neutrophile qui ont été sensiblement augmentés dans la section commune. Assurez-vous que l’air est injecté dans la peau, mais pas dans le muscle. Nous pouvons également étudier la formation des pièges extracellulaires de neutrophile par coloration immunohistochimique des sections communes de tissu de cheville avec l’anti-p84 ou ces méthodes peuvent être employées pour étudier d’autres maladies inflammatoires telles que la maladie intestinale inflammatoire.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactif In situ D&#39;hybridation pour détecter divers profils d&#39;expression génique dans les tissus

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Recherche

Biologie

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Détection et caractérisation de l'auto-assemblage des protéines in Vivo par la cytométrie des flux

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Détection de l’établissement de l’approvisionnement en sang partagé dans les souris parabiotiques par injection de glucose de veine caudale

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Un test de migration à gratter rentable et adaptable

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolement des neutrophiles humains du sang total et des buffys

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...