Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81430099 und 31500704), Internationalen Kooperations- und Austauschprojekten (Grant-Nummer 2014DFA32950) und dem Forschungsprogramm der Pekinger Universität für Chinesische Medizin ( BUCM-2019-JCRC006 und 2019-JYB-TD013).

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Es wurden C57BL/6-Mäuse (7-8 Wochen alt) verwendet.
1. Neutrophile Isolation
<ol><li>Erwerb von peritonealen Exutatzellen<ol>
<li>Bereiten Sie frische 10% Proteose Peptonlösung in ddH2O. Berechnen Sie das Volumen benötigt nach der Anzahl der Mäuse. HINWEIS: Legen Sie die Anzahl der Mäuse auf N,(2N+1) ...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Detaillierte Protokolle von hochgereinigten Neutrophilen aus peripherem Blut7,Knochenmark und Gewebe18 sind seit langem verfügbar. Hier nehmen wir eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Peritonealflüssigkeit19 an, bei der reife Neutrophile für weitere entzündungshemmende und antioxidative Studien inaktiviert bleiben.
Wir nutzten das Luftbeutelexperiment, um die LPS-induzierte Infiltration von Neutrophilen in ...

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden weißen Blutkörperchen und machen 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen population beim Menschen1. Neutrophile sind einer der primären Responder bei akuter Entzündung. Neutrophile können an Entzündungsstellen über die Führung von Zytokinen und Chemokinen rekrutiert werden, die von geweberesidenten Zellen2,3,4freigesetzt werden, die durch die Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Neutrophilen und vaskulären Endothelzellen vermittelt wird5. Neutrophile sind von grundlegender Bedeutung für die Wirtsabwehr und spielen eine Rolle bei pathologischen Entzündungsreaktionen aufgrund ihrer starken Fähigkeit, Gewebe durch die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und anderen gewebeschädigenden Molekülen3,6zu schädigen.
Frühere Studien haben mehrere neutrophile Isolationsprotokolle von Mäusen oder Menschen beschrieben. Oh et al. demonstrierte eine Methode zur Trennung des Dichtegradienten, um menschliche Neutrophile aus ganzem menschlichen Blut zu isolieren7. Allerdings ist die Isolierung ausreichender Neutrophilen aus Mausblut aufgrund des geringen Blutvolumens schwierig. Alternativ kann eine große Anzahl von reinen und lebensfähigen Mausneutrophilen aus Mausperitonealflüssigkeit entlockt werden, und diese gereinigten Neutrophilen können ex vivo verwendet werden, um mehrere Aspekte der zellulären Funktionen ex vivo zu untersuchen, einschließlich neutrophiler Infiltration, Migration, Chemotaxis, oxidativen Bursts, Zytokin und neutrophiler extrazellulärer Falle (NET)Produktion 8. Transwell-Assays9 oder Zigmond-Kammer-Assays10,11 können verwendet werden, um neutrophile Migration in vitro zu bewerten. Das Luftbeutelmodell wird verwendet, um die Migration und Infiltration von Neutrophilen in vivo zu bewerten. Das subkutane Luftbeutelmodell ist ein praktisches in vivo Tiermodell, um die Migration von Entzündungszellen zu untersuchen.
Traditionell wurden Neutrophile als Pathogeneliminatoren in akuten Entzündungsphasen betrachtet. Jüngste Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass Neutrophile komplizierte Zellen sind, die eine signifikante Vielfalt an spezialisierten Funktionen ausführen. Neutrophile können viele Prozesse regulieren, wie akute Verletzungen und Reparaturen, Tumorgenese, Autoimmunreaktion und chronische Entzündung12,13. Neutrophile modulieren auch adaptive Immunantworten und können B-Zellen und T-Zellen14,15regulieren. Erheblicher Mangel an Neutrophilen führt zu Sterblichkeit oder schwerer Immunschwäche beim Menschen und neutrophiler Erschöpfung bei Mäusen führt zum Tod, während übermäßige Aktivierung oder Rekrutierung von Neutrophilen in Organen mehrere Immunerkrankungen verursacht, wie rheumatoide Arthritis (RA) und systemische Lupus erythematodes (SLE)6. Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Zellen in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten. Neutrophile produzieren übermäßige Mengen an Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) durch Abbau, was die Knorpelerosion verschärft. MPO ist ein Peroxidase-Enzym, das hauptsächlich in den Granulaten von Neutrophilen16exprimiert wird. NE ist mit Gelenkknorpelzerstörungassoziiert 17. MPO und NE könnten verwendet werden, um den Status der Neutrophilenmigration und Infiltration im Gewebe von RA-Patienten zu bewerten.
Dieser Artikel enthält drei konventionelle Methoden zur Bewertung der Migration normaler Neutrophilen, die sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden, sowie die Infiltration pathologischer Neutrophile in einem Mausgelenk-spezifischen Entzündungsmodell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Neutrophile sind ein wichtiges Mitglied des angeborenen Immunsystems und spielen eine zentrale Rolle bei der Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger und pathologische Entzündungsreaktionen. Neutrophile können über die Anleitung von Zytokinen und Chemokinen an Entzündungsstellen rekrutiert werden. Überwältigende Infiltration von Neutrophilen kann zu wahllosen Gewebeschäden führen, wie bei rheumatoider Arthritis (RA). Neutrophile, die aus peritonealem Exutat isoliert sind, reagieren auf ein definiertes Chemolockan, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell- oder Zigmond-Kammertests. Das Luftbeutelexperiment kann verwendet werden, um die Chemotaxis von Neutrophilen in vivo zu Lipopolysaccharid (LPS) zu bewerten. Das adjuvantinduzierte Arthritis-Mausmodell (AA) wird häufig in der RA-Forschung verwendet, und die immunhistochemische Färbung von Gelenkabschnitten mit Antimyeloperoxidase (MPO) oder Anti-Neutrophilen-Elastase-Antikörpern (NE) ist eine etablierte Methode zur Messung Neutrophileninfiltration. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapien zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.

Peritoneale Exutatzellen wurden aus der Spülflüssigkeit von Mäusen gesammelt. Die Zellen wurden in 1 ml RPMI-1640-Gesamtmedium resuspendiert, auf einem zweistufigen (54,8%/70,2%) diskontinuierlicher Dichtegradient (Abbildung 1A) und zentrifugiert bei 1.500 x g für 30 min. Neutrophile (ca. 95 %, 1 x 107 Neutrophile/Maus) wurden von der unteren Schnittstelle(Abbildung 1B) wi...

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Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.

Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Diese Methode versucht, drei häufig verwendete Methoden zur Bewertung der Migration von normalen Neutrophilen in vivo und in vitro sowie die Infiltration pathologischer Neutrophile im Maus-Arthritis-Modell zu beschreiben. Wir denken, dass diese Methode für andere Forscher auf diesem Gebiet nützlich sein könnte. Dieses Protokoll enthält die methodischen Details zur Bewertung der Migrationskapazität von Neutrophilen an den Entzündungsstellen mit Hilfe von Luftbeutel-Assay und adjuvant-induzierter Arthritis.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Arthritistherapie, indem die Modellgruppe mit der Behandlungsgruppe verglichen wird. Diese Methode könnte Einblick in entzündliche Erkrankungen geben und kann auf entzündliche Darmerkrankungen angewendet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Qingyi Lu und Haixu Jiang, Postgraduierten aus unserem Labor.Nach der Anästhesisierung der Mäuse am Tag Null verwenden Sie einen 0,22-Mikron-Filter, der an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, um ein Volumen von drei Millilitern sterilisierter Luft zu erhalten. Heben Sie die Rückenhaut der anästhesierten Maus mit einer Pinzette an und verwenden Sie subkutan eine 26-Spur mit einer 3/8-Zoll-Nadel, um drei Milliliter der sterilisierten Luft zu injizieren. Entfernen Sie die Mäuse nach der Behandlung von der Atemeinheit und legen Sie sie in einen gut eingestellten Käfig.Überwachen Sie die Mäuse, um sicherzustellen, dass sie am Leben sind, bis sie anfangen, sich zu bewegen. Am dritten Tag spritzen Sie weitere drei Milliliter sterilisierte Luft in die zuvor etablierte Lufttasche, um den Luftbeutel zu erhalten. Am sechsten Tag verschiedene Behandlungen in den Luftbeutel injizieren.Injizieren Sie einen Milliliter PBS als Negativkontrolle und injizieren Sie ein Milliliter eines Mikrogramms pro Milliliter LPS als positive Kontrolle, um lokale Entzündungen zu induzieren. Nach sechs Stunden, opfern Sie die Mäuse. Injizieren Sie für jeden Luftbeutel einen Milliliter Waschpuffer, um den Luftbeutel zu waschen und das entzündliche Exudate in einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr zu sammeln.Dann waschen Sie den Luftbeutel mit zwei Milliliter Waschpuffer zweimal und sammeln Sie das entzündliche Exudate im selben Zentrifugenrohr. Zentrifuge bei 100 mal g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer wieder aus.Zählen Sie die Zellen, um das Neutrophilenverhältnis mit dem automatischen Hämatologieanalysator zu quantifizieren. Setzen Sie Freunds Adjuvans durch Wirbeln von mindestens fünf Sekunden aus und ziehen Sie dann 100 Mikroliter Suspension in einen Insulininjektor. Nach der Anästhesisierung die gewählte Pfote markieren und 20 Mikroliter komplettes Freund-Adjuvans aus dem Injektor in vier periartikuläre Flecken auf dem Sprunggelenksraum injizieren.Legen Sie die verarbeiteten Mäuse in die neue Kammer. Überwachen Sie die Mäuse, um sicherzustellen, dass sie atmen, bis sie wieder die Fähigkeit, sich zu bewegen. Verwenden Sie alle drei Tage ein Taschendickenmessgerät, um den Durchmesser des Sprunggelenks zu messen.Bewerten Sie auch die Schwere der Arthritis anhand des Bewertungskriteriums für Arthritis. Null ist normal. Keine Hinweise auf Erythem und Schwellung.Eine davon ist die mildeste Arthritis. Erythem und leichte Schwellung enden auf die Tarsals oder das Sprunggelenk. Zwei ist die moderate Arthritis.Erythem und leichte Schwellungen, die sich vom Knöchel bis zu den Tarsals erstrecken. Drei ist die schwere Arthritis. Erythem und moderate Schwellung, die sich vom Knöchel bis zu den Metatarsalgelenken erstreckt.Vier ist die schwerste Arthritis. Erythem und starke Schwellungen umfassen den Knöchel, Fuß und Ziffern, oder Ankylose der Gliedmaße. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, entfernen Sie die Haut und einen Teil des Muskels mit einer Pinzette und einer Schere aus dem Hinterbein.Sprühen Sie das Gelenk mit 70% Ethanol und entfernen Sie den Rest der Muskeln mit einem Papiertuch. Fixieren Sie das Sprunggelenk in 4%Paraformaldehyd für zwei Tage bei Raumtemperatur. Dann entkalken Sie das Gelenk in 10%EDTA für einen Monat bei Raumtemperatur und ändern Sie das Medium wöchentlich.Legen Sie das Gewebe nach einem Monat in eine markierte Form mit einem bestimmten Volumen an flüssigem Paraffin bei etwa 60 Grad Celsius, um das Gewebe einzubetten. Kurz abkühlen. Stellen Sie die Dicke des Mikrotomes auf vier Mikrometer ein und schneiden Sie Scheiben.Dann schweben die Abschnitte in einem 43 Grad Celsius Wasserbad für eine kurze Zeit, um die Abschnitte zu erweitern. Montieren Sie die Abschnitte auf Rutschen und legen Sie die Rutschen in den Ofen bei 70 Grad Celsius für zwei Stunden. Für die zukünftige Verwendung, konservieren Sie die Rutschen bei minus 20 Grad Celsius.Als nächstes legen Sie die Dias in ein Regal und führen Sie Waschungen in Xylol und Ethanol nach dem Manuskript durch, um bei Raumtemperatur zu rehydrieren. Schließlich drei Minuten lang in fließendem Leitungswasser waschen. Dann färben Sie in 0.1%schnelle grüne Lösung für fünf Minuten.10 Sekunden lang 1%Essigsäure abspülen und in 0,1%Safranin O Färbelösung 20 Minuten färben. Danach tauchen Sie die Dias in die Xylol- und Ethanol-Waschlösungen nach dem Manuskript ein. Montieren Sie die Gewebeabschnitte auf die Objektstufe und beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.Um Neutrophile zu visualisieren, führen Sie immunhistochemische Färbung durch, indem Sie zuerst die Paraffinabschnitte für zwei Stunden bei 78 Grad Celsius backen. Legen Sie die Dias in ein Rack und führen Sie die Xylol-, Ethanol-, Wasser- und PBS-Waschungen entsprechend dem Manuskript durch, um bei Raumtemperatur zu rehydrieren. Fügen Sie dann einen Tropfen Permeabilisierungspuffer hinzu, um das Gewebe zu bedecken.Inkubieren Sie die Abschnitte in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach spülen Sie die Dias in PBS dreimal dreimal für drei Minuten. Vermeiden Sie das direkte Spülen des Gewebes.Als nächstes führen Sie wärmeinduzierte Antigen-Epitop-Retrieval. Ordnen Sie die Dias in einem Rack an. Tauchen Sie die Dias in den mit Abrufpuffer gefüllten Druckkessel ein.Setzen Sie den Druckkessel in den Mikrowellenherd und stellen Sie den Mikrowellenherd auf 600 Watt und erhitzen Sie die Dias für 10 Minuten. Nach dem Kochen die Rutschen im Kessel auf 90 Grad Celsius abkühlen lassen. Nehmen Sie die Dias heraus und spülen Sie sie dreimal dreimal in PBS.Um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen, tauchen Sie die Dias 15 Minuten lang in frisch zubereitetes 3%Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur ein. Spülen Sie Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Umreißen Sie einen großen Kreis um die Probe mit einem hydrophoben Stift.Vermeiden Sie es, die Probe zu berühren. Fügen Sie auf die Probe 50 bis 100 Mikroliter 3%Rinder-Serumalbumin zu blockieren und legen Sie die Proben in einer feuchtigkeitskontrollierten Kammer bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Entfernen Sie dann die Blockierungslösung.Fügen Sie schnell 50 Mikroliter PBS verdünnten Primärantikörper zu jedem Abschnitt hinzu. Inkubieren Sie die Dias in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei vier Grad Celsius über Nacht. Nehmen Sie am zweiten Tag das Tablett heraus und lassen Sie es 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.Dann spülen Sie die Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Fügen Sie 50 Mikroliter PBS verdünnte Sekundärantikörper in das Gewebe. Inkubieren Sie diagleitet in einem feuchtigkeitskontrollierten Tablett bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.Dann spülen Sie die Dias in PBS für drei Minuten dreimal. Entwickeln Sie in verdünnter DAB-Lösung für fünf Minuten. Vermeiden Sie die Entwicklung einer dunklen Farbe, die durch Überreaktion des DAB verursacht wird.Spülen Sie die Dias in destilliertem Wasser. Die Dias in Hämatoxylin 10 Sekunden lang gegenbedecken und fünf Minuten lang im Leitungswasser spülen. In säurehaltigen Superschnellen Differenzierungslösung für drei Sekunden abspülen, dann in Leitungswasser für 10 Minuten abspülen.Tauchen Sie die Dias in die Ethanol- und Xylolwaschungen bei Raumtemperatur gemäß dem Manuskript ein. Befestigen Sie den Coverslip mit Montagelösung. Beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop.In dieser Studie wurden Luftbeutelexperimente durchgeführt, um die durch LPS in vivo stimulierte Neutrophilenrekrutierung zu untersuchen. Die Leukozyten-Teilmengen in den Luftbeutel-Exsudaten waren viel höher als bei der Kontrolle. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die adjuvantinduzierte Arthritisgruppe signifikante Ödeme in der Pfote.Der Sprunggelenksdurchmesser wurde erhöht und die Arthritis-Score stieg konstant. Knorpelschäden sind das repräsentative Syndrom der rheumatoiden Arthritis. Die CFA-Herausforderung führte zu einer großen Menge an Leukozyteninfiltration, signifikanter Knorpelerosion und Synovialhyperplasie.MPO in allen Expressionsebenen sind repräsentative Marker der neutrophilen Infiltration, die im Gelenkabschnitt deutlich hochreguliert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Luft in die Haut injiziert wird, aber nicht in den Muskel. Wir können auch die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen durch immunhistochemische Färbung der Knöchelgelenkgewebeabschnitte mit Anti-p84 untersuchen oder Diese Methoden können verwendet werden, um andere entzündliche Erkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Forschung

Biologie

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

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