Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (הענקת מספרים 81430099 ו 31500704), שיתוף פעולה בינלאומי ופרויקטים Exchange (גרנט מספר 2014DFA32950), ואת תוכנית המחקר של אוניברסיטת בייג של הרפואה הסינית ( הענק מספרים BUCM-2019-JCRC006 ו 2019-איבב-TD013).

כל ההליכים הניסיוניים נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת בייג לטיפול בבעלי חיים ברפואה הסינית והוועדה לשימוש.
הערה: C57BL/6 עכברים (בן 7-8 שבועות) שימשו.
1. בידוד נויטרופילים
<ol><li>רכישת תאים בעלי כדוריות הצפק<ol>
<li>הכינו את התמיסה החדשה של 10% ב-ddH2O. חשב את עוצמת הקו?...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

פרוטוקולים מפורטים של מאוד מטוהרים נויטרופילים מ דם היקפי7, מח עצם ורקמות18 זמינים במשך זמן רב. כאן אנו לאמץ שיטה של בידוד נויטרופילים מתוך נוזל הצפק19 שבו נויטרופילים בוגרת להישאר מופעל עבור אנטי דלקתיות ומחקרים נוגדי חמצון נוספים.
השת...

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר בתאי דם לבנים וחשבון עבור 50 ל-70% של אוכלוסיית כולה של תא דם לבן בבני אדם1. נויטרופילים הם אחד המגיבים העיקריים במהלך דלקת חריפה. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים שוחרר על ידי תאיםתושבהרקמה 2,3,4, אשר מתווך על ידי אינטראקציות בין מולקולות הדבקה התא על פני השטח של התאים נויטרופילים וכלי הדם5. נויטרופילים הם בסיסיים לארח את ההגנה ולשחק תפקיד בתגובות דלקתיות פתולוגי בשל קיבולת רבת עוצמה שלהם כדי לפגוע ברקמות באמצעות שחרורו של מינים חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות לפגיעה ברקמות3,6.
מחקרים קודמים תיארו מספר פרוטוקולים של בידוד נויטרופילים מעכברים או בני אדם. הו ואח ' הפגינו שיטת הפרדה בצפיפות מעבר הצבע כדי לבודד נויטרופילים אנושיים מהדם האנושי השלם7. עם זאת, בידוד של נויטרופילים מספיק דם העכבר קשה בגלל נפח הדם הקטן. לחילופין, מספרים גדולים של העכבר טהור ומלא קיימא יכול להיות הכין מתוך נוזל הצפק העכבר, ואת אלה נויטרופילים מטוהרים ניתן להשתמש לשעבר vivo לבחון מספר היבטים של פונקציות הסלולר ex vivo, כולל הסתננות נויטרופילים, הגירה, כימוטווניות, פרץ חמצוני, cy, ו נויטרופילים השמנה מסחטות (NET) 10,11 יכול לשמש להערכת. הגירה של נויטרופילים במבחנה מודל כיס האוויר משמש כדי להעריך את הגירה הסתננות של נויטרופילים ב vivo. מודל כיס האוויר תת עורית הוא נוח במודל בעלי חיים vivo ללמוד הגירה של תאים דלקתיים.
באופן מסורתי, נויטרופילים נחשבו כמו הפתוגן מייבשים בשלבים אקוטי של דלקת. עם זאת, הממצאים האחרונים הראו כי נויטרופילים הם תאים מסובכים המבצעים מגוון משמעותי של פונקציות מיוחדות. נויטרופילים יכול לווסת תהליכים רבים כגון פציעה חריפה ותיקון, tuמוריגנזה, תגובה אוטואימונית, דלקת כרונית12,13. נויטרופילים גם לווסת את התגובות החיסונית אדפטיבית יכול להסדיר B תאים ו T תאים14,15. מחסור ניכר של נויטרופילים מוביל לתמותה או כשל חיסוני חמור בבני אדם ו נויטרופילים דלדול בעכברים מוביל הקטלנית, בעוד הפעלה מוגזמת או גיוס של נויטרופילים באיברים גורם למחלות החיסון מספר, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) ו זאבת מערכתית מאריתסוס (לשיון)6. נויטרופילים הם התאים השופעים ביותר בנוזל אמתחת של חולים RA. נויטרופילים לייצר כמויות מוגזמות של myeloperoxidase (MPO) ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות השפלה, אשר שחיקה הסחוס בייטס. MPO הוא אנזים peroxidase מתבטא בעיקר בגרגירים של נויטרופילים16. NE קשורה להשמדה הסחוס הבין-מולקולרית17. MPO ו-NE יכול לשמש כדי להעריך את הסטטוס של הגירה נויטרופילים הסתננות ברקמת מטופלים RA.
מאמר זה מספק שלוש שיטות קונבנציונליות כדי להעריך את הגירה של המושרה נורמלי מושרה הן ב vivo ו בחוץ גופית, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגי במודל העכבר משותף ספציפי לדלקת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

נויטרופילים הם חבר מרכזי של המערכת החיסונית מולדת ולשחק תפקידים מרכזיים הגנה מארחים מפני פתוגנים ותגובות דלקתיות פתולוגי. נויטרופילים ניתן לגייס לאתרי דלקת באמצעות הדרכה של ציטוקינים ו נוגדנים. הסתננות מוחצת של נויטרופילים יכול להוביל נזק לרקמות הבחנה, כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA). נויטרופילים מבודדים מתוך התפענות הצפק להגיב הגדרת כימוסטנט מוגדר, N-formyl-Met-מלאו-פה (fMLP), ב מבחנה ב Transwell או הלשכה הקאמרית Zigmond. את הניסוי כיס האוויר ניתן להשתמש כדי להעריך את כימוטקוניות של נויטרופילים לכיוון ליפופוליסכריד (LPS) ב vivo. מודל העכבר המושרה (AA) הנגרמת לעתים קרובות נעשה שימוש במחקר RA, ומכתים אימונוהיסטוכימיה של סעיפים משותפים עם anti-myeloperoxidase (MPO) או אנטי נויטרופילים elastase (NE) נוגדנים היא שיטה מבוססת היטב כדי למדוד הסתננות נויטרופילים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות טיפולים מבטיחים מיקוד הגירה נויטרופילים.

תאים בעלי הצפק. שנאספו מנוזל ששטיפה של עכברים תאים הושעו מחדש ב 1 מ ל של RPMI-1640 בינוני מלא, שכבתית על שני צעדים (54.8%/70.2%) מעבר הדרגתי דחיסות רציפה (איור 1א), ו centrifuged ב 1,500 x g עבור 30 דקות. נויטרופילים (≥ 95%, ~ 1 x 107 נויטרופילים/עכבר) התגלו מהממשק הת?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.

מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

שיטה זו מנסה לתאר שלוש שיטות נפוצות להערכת ההגירה של נויטרופילים נורמליים ב vivo ו במבחנה, כמו גם חדירה של נויטרופילים פתולוגיים במודל דלקת פרקים העכבר. אנו חושבים כי שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור חוקרים אחרים בתחום זה. פרוטוקול זה מכיל את הפרטים המתודולוגיים כדי להעריך את יכולת הנדידה של נויטרופילים באתרי הדלקת באמצעות מראי כיס אוויר ודלקת פרקים הנגרמת על ידי עורך דם.ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי טיפול דלקת פרקים על ידי השוואת קבוצת המודל עם קבוצת הטיפול. שיטה זו יכולה לספק תובנה למחלות דלקתיות ו ניתן ליישם אותה על מחלות מעי דלקתיות. הדגמת ההליך תהיה צ'ינגיי לו והאיקסו ג'יאנג, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלנו.לאחר הרדמה של העכברים ביום אפס, השתמש במסנן 0.22 מיקרון המחובר למזרק חמישה מיליליטר כדי להשיג נפח של שלושה מיליליטר של אוויר מעוקר. הרם את העור האחורי של העכבר הרדמה עם פינצטה ו subcutaneously להשתמש 26 מד על ידי 3/8 אינץ מחט כדי להזריק שלושה מיליליטר של האוויר מעקר. לאחר הטיפול, מוציאים את העכברים מיחידה הנשימה ומ מניחים אותם בכלוב מוגדר היטב.לפקח על העכברים כדי להבטיח שהם בחיים עד שהם מתחילים לנוע. ביום השלישי, הזרקת שלושה מיליליטר נוספים של אוויר מעוקר לכיס האוויר שהוקם בעבר כדי לקיים את כיס האוויר. ביום השישי, להזריק טיפולים שונים לתוך כיס האוויר.להזריק מיליליטר אחד של PBS כשליטה שלילית ולהזריק מיליליטר אחד של מיקרוגרם אחד לכל LPS מיליליטר כשליטה חיובית כדי לגרום לדלקת מקומית. אחרי שש שעות, להקריב את העכברים. עבור כל כיס אוויר, להזריק מיליליטר אחד של חיץ לשטוף לשטוף את כיס האוויר ולאסוף את exudate דלקתי בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.ואז לשטוף את כיס האוויר עם שני מיליליטר של חיץ לשטוף פעמיים ולאסוף את exudate דלקתי באותו צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 100 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את התאים במיליליטר אחד של חיץ שטיפה.לספור את התאים כדי לכמת את יחס נויטרופילים באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטי. להשעות את העוון של פרוינד להשלים על ידי מערבולת לפחות חמש שניות, ולאחר מכן לצייר 100 microliters של השעיה לתוך מזרק אינסולין. לאחר הרדמה, לסמן את הכף שנבחרה ולהזריק 20 microliters של תוסף שלם פרוינד מן המזרק לארבעה כתמים periarticular על שטח מפרק הקרסול.שים את העכברים המעובדים בתא החדש. לפקח על העכברים כדי להבטיח שהם נושמים עד שהם להחזיר את היכולת לנוע. כל שלושה ימים, השתמש במד עובי כיס כדי למדוד את קוטר מפרק הקרסול.כמו כן, להעריך את חומרת דלקת פרקים על ידי דלקת פרקים קריטריון ניקוד. אפס זה נורמלי. אין עדות לאריתמה ונפיחות.אחת מהן היא דלקת פרקים קלה ביותר. אריתמה ונפיחות קלה מוגבלים לטארזלים או למפרק הקרסול. שתיים היא דלקת פרקים מתונה.אריתמה ונפיחות קלה המשתרעת מהקרסול אל הזפתים. שלוש היא דלקת פרקים חמורה. אריתמה ונפיחות מתונה המשתרעת מהקרסול למפרקים מטא-מטרסלים.ארבע היא דלקת פרקים החמורה ביותר. אריתמה ונפיחות חמורה מקיפות את הקרסול, כף הרגל והספרות, או אקילוזיס של האיבר. לאחר הקרבת העכבר, להסיר את העור וחלק השריר מהרגל האחורית עם פינצטה ומספריים.מרססים את המפרק ב-70% אתנול ומסירים את שאר השרירים באמצעות מגבת נייר. תקן את מפרק הקרסול בפרפורמלדהיד 4% במשך יומיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מדקים את המפרק ב-10%EDTA למשך חודש בטמפרטורת החדר ומנים את המדיום מדי שבוע.לאחר חודש אחד, מניחים את הרקמה בתבנית מסומנת עם נפח מסוים של פרפין נוזלי בערך 60 מעלות צלזיוס כדי להטמיע את הרקמה. מגניב בקצרה. מניחים את העובי על המיקרוטום על ארבעה מיקרומטר וחותכים פרוסות.ואז לצוף את החלקים באמבט מים 43 מעלות צלזיוס לזמן קצר כדי להרחיב את החלקים. הר את החלקים על מגלשות והכניס את המגלשות לתנור בטמפרטורה של 70 מעלות במשך שעתיים. לשימוש עתידי, לחסוך את השקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מניחים את המגלשות במדף ומבצעים שטיפות בקסילן ואתנול על פי כתב היד כדי להתייבש בטמפרטורת החדר. לבסוף, לשטוף במי ברז זורמים במשך שלוש דקות. לאחר מכן הכתימו בתסרון ירוק מהיר של 0.1% למשך חמש דקות.יש לשטוף 1% חומצה אצטית למשך 10 שניות ולהכתים ב-0.1%Safranin O במשך 20 דקות. לאחר מכן, לטבול את השקופיות קסילן ואתנול שטיפת פתרונות על פי כתב היד. הר את חלקי הרקמה על שלב האובייקט והתבונן ברקמות תחת מיקרוסקופ.כדי לדמיין נויטרופילים, לבצע כתמים אימונוהיסטוכימיים על ידי אפיית הראשון את חלקי הפרפין במשך שעתיים ב 78 מעלות צלזיוס. מניחים את המגלשות במדף ומבצעים את הקסילן, האתנול, המים וה- PBS נשטפים בהתאם לכתב היד כדי להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להוסיף טיפה אחת של חיץ permeabilization כדי לכסות את הרקמה.הדגירה את החלקים במגש מבוקר לחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. הימנע שטיפת הרקמה ישירות.לאחר מכן, לבצע אחזור אפיטופ אנטיגן הנגרמת על ידי חום. סדר את השקופיות בארון תקשורת. לטבול את השקופיות דוד הלחץ מלא מאגר אחזור.מכניסים את דוד הלחץ למיקרוגל ומניחים את המיקרוגל על 600 וואט ומחממים את המגלשות במשך 10 דקות. לאחר הרתיחה, לשמור את השקופיות הדוד להתקרר עד 90 מעלות צלזיוס. מוציאים את השקופיות ושטיפתן ב-PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים.כדי להתרווה פעילות פרוקסידזה אנדוגנית, לטבול את השקופיות ב 3% מי חמצן טרי מוכן בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. שטפו שקופיות ב-PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. מתאר עיגול גדול סביב המדגם עם עט הידרופובי.הימנע מנגיעה בדגימה. הוסיפו לדגימה 50 עד 100 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 3%bovine כדי לחסום ולמקם את הדגימות בתא מבוקר לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן הסר את פתרון החסימה.הוסף 50 microliters של PBS מדולל נוגדן ראשוני לכל סעיף במהירות. הדגירה את המגלשות במגש מבוקר לחות בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום השני, להוציא את המגש ולתת לו לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. הוסף 50 microliters של PBS מדולל נוגדנים משניים לרקמות. הדגירה מחליקה במגש מבוקר לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS במשך שלוש דקות שלוש פעמים. לפתח פתרון DAB מדולל במשך חמש דקות. הימנע מהתפתחות של צבע כהה שנגרם על ידי תומרת יתר של DAB.שוטפים את המגלשות במים מזוקקים. יש לנטרל את השקופיות בהמטוקסילין למשך 10 שניות ולשטוף את השקופיות במי ברז למשך חמש דקות. יש לשטוף באלכוהול חומצי בתתברואה מהירה במיוחד למשך שלוש שניות, ולאחר מכן לשטוף במי ברז למשך 10 דקות.לטבול את המגלשות באתנול וקצילן שוטף בטמפרטורת החדר על פי כתב היד. תקן את המכסה עם פתרון הרכבה. שימו לב לרקמה מתחת למיקרוסקופ.במחקר זה, ניסויים שקית אוויר בוצעו כדי לחקור את גיוס נויטרופילים מגורה על ידי LPS ב vivo. קבוצות המשנה של לויוצ'יט בכריות האוויר היו גבוהות בהרבה מאשר בשליטה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, קבוצת דלקת פרקים הנגרמת על ידי edjuvant הראתה בצקת משמעותית בכפות הרגליים.קוטר מפרק הקרסול עלה וציון דלקת פרקים עלה באופן עקבי. נזק לסחוס הוא התסמונת הייצוגית של דלקת מפרקים שגרונית. אתגר CFA גרם כמות גדולה של חדירת לויקוציט, שחיקת סחוס משמעותית, היפרפלזיה סינוביאלית.MPO בכל רמות ביטוי הם סמנים מייצגים של חדירת נויטרופילים אשר היו מוסדר באופן משמעותי בסעיף המשותף. ודא כי האוויר מוזרק לתוך העור, אבל לא לתוך השריר. אנחנו יכולים גם לחקור את היווצרות של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיים של חלקי רקמת מפרק הקרסול עם אנטי p84 או שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לחקור מחלות דלקתיות אחרות כגון מחלות מעי דלקתיות.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

מזהה הקמת אספקת דם משותף בעכברים Parabiotic על ידי הזרקת הסוכר קאודל וריד

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

בידוד של נויטרופילים אנושיים מדמם שלם ומעילי באפי

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...