Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell'Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).

Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dall'Università di Pechino di Medicina Cinese Animal Care and Use Committee.
NOTA: sono stati utilizzati topi C57BL/6 (7-8 settimane).
1. Isolamento neutrofilo
<ol><li>Acquisizione di cellule essudati peritoneali<ol>
<li>Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi. NOTA: Impostare il numero di mouse come N, (2N- 1) mL...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.
Abbiamo usato l'esperimento della sacca d'aria per esplorare l'infiltrazione indotta da LPS dei neut...

I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell'intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l'infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono fondamentali per la difesa dell'ospite e svolgono un ruolo nelle reazioni infiammatorie patologiche a causa della loro potente capacità di danneggiare i tessuti attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e altre molecole dannose per i tessuti3,6.
Studi precedenti hanno descritto diversi protocolli di isolamento dei neutrofili da topi o esseri umani. Oh e t. ha dimostrato un metodo di separazione del gradiente di densità per isolare i neutrofili umani dal sangue umano intero7. Tuttavia, l'isolamento di neutrofili sufficienti dal sangue di topo è difficile a causa del piccolo volume di sangue. In alternativa, un gran numero di neutrofili di topo puro e vitale può essere suscitato dal liquido peritoneale del topo, e questi neutrofili purificati possono essere utilizzati ex vivo per esaminare diversi aspetti delle funzioni cellulari ex vivo, tra cui l'infiltrazione dei neutrofili, la migrazione, il chemiotaxi, l'esplosione ossidativa, la citochina e la produzione di trapextra extrafilaretiche neutrofila (NET)8. Transwell saggi9 o saggi della camera di zigmond10,11 possono essere utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili in vitro. Il modello della sacca d'aria viene utilizzato per valutare la migrazione e l'infiltrazione di neutrofili in vivo. Il modello sottocutaneo della sacca d'aria è un comodo modello animale in vivo per studiare la migrazione delle cellule infiammatorie.
Tradizionalmente, i neutrofili erano considerati eliminatori patogeni nelle fasi acute dell'infiammazione. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che i neutrofili sono cellule complicate che svolgono una notevole varietà di funzioni specializzate. I neutrofili possono regolare molti processi come lesioni e riparazioni acute, tumorigenesi, risposta autoimmune e infiammazione cronica12,13. Neutrophils anche modulare le risposte immunitarie adattative e può regolare le cellule B e le cellule T14,15. La sostanziale carenza di neutrofili porta alla mortalità o alla grave immunodeficienza nell'uomo e l'esaurimento dei neutrofili nei topi porta alla fatalità, mentre l'attivazione o il reclutamento eccessivo di neutrofili negli organi causa diverse malattie immunitarie, come l'artrite reumatoide (RA) e lupus erythematosus (SLE)6. I neutrofili sono le cellule più abbondanti nel fluido sinoviale dei pazienti affetti da RA. Neutrophils producono quantità eccessive di mieloperossia (MPO) e elastasi neutrofili (NE) attraverso la degradazione, che esacerba l'erosione della cartilagine. MPO è un enzima perossidasi espresso principalmente nei granuli dei neutrofili16. NE è associato alla distruzione della cartilagine articolare17. MPO e NE potrebbero essere utilizzati per valutare lo stato della migrazione dei neutrofili e dell'infiltrazione nel tessuto dei pazienti affetti da RA.
Questo articolo fornisce tre metodi convenzionali per valutare la migrazione di neutrofili normali indotti sia in vivo che in vitro, così come l'infiltrazione di neutrofili patologici in un modello di infiammazione specifico dell'articolazione del topo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell'ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L'infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l'artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall'estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L'esperimento della sacca d'aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell'artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.

Le cellule di essutazione peritoneale sono state raccolte dal liquido di lavaggio dei topi. Le celle sono state risospese in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo, sovrapposte a due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua (Figura 1A) e centrifugate a 1.500 x g per 30 min. Neutrophils (-95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono state recuperate dall'interfaccia inferiore (Figura 1B</st...

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Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Questo metodo cerca di descrivere tre metodi frequentemente utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili normali in vivo e in vitro, nonché l'infiltrazione di neutrofili patologici nel modello di artrite del topo. Riteniamo che questo metodo potrebbe essere utile per altri ricercatori in questo campo. Questo protocollo contiene i dettagli metodologici per valutare la capacità migratoria dei neutrofili nei siti di infiammazione utilizzando il test della busta d'aria e l'artrite indotta da adiuvanti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'artrite confrontando il gruppo di modelli con il gruppo di trattamento. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sulle malattie infiammatorie e può essere applicato alla malattia infiammatoria intestinale. A dimostrare la procedura saranno Qingyi Lu e Haixu Jiang, studenti post-laurea del nostro laboratorio.Dopo l'anestesia dei topi il giorno zero, utilizzare un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da cinque millilitri per ottenere un volume di tre millilitri di aria sterilizzata. Sollevare la pelle posteriore del topo anestetizzato con una pinzetta e utilizzare per via sottocutanea un ago da 26 calibro per 3/8 pollici per iniettare tre millilitri dell'aria sterilizzata. Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità respiratoria e metterli in una gabbia ben impostata.Monitora i topi per assicurarti che siano vivi fino a quando non iniziano a muoversi. Il terzo giorno, iniettare altri tre millilitri di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la busta d'aria. Il sesto giorno, iniettare diversi trattamenti nella busta d'aria.Iniettare un millilitro di PBS come controllo negativo e iniettare un millilitro di un microgrammo per millilitro LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale. Dopo sei ore, sacrifica i topi. Per ogni sacchetto d'aria, iniettare un millilitro di tampone di lavaggio per lavare la busta d'aria e raccogliere l'essudato infiammatorio in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Quindi lavare la busta d'aria con due millilitri di tampone di lavaggio due volte e raccogliere l'essudato infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga. Centrifuga a 100 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio.Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore di ematologia automatica. Sospendere l'adiuvante completo di Freund vortice di almeno cinque secondi, quindi disegnare 100 microlitri di sospensione in un iniettore di insulina. Dopo l'anestetismo, contrassegnare la zampa scelta e iniettare 20 microlitri del coadiuvante completo di Freund dall'iniettore in quattro punti periarticolari sullo spazio dell'articolazione della caviglia.Metti i topi lavorati nella nuova camera. Monitora i topi per assicurarti che respirino fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi. Ogni tre giorni, utilizzare uno spessore tascabile per misurare il diametro dell'articolazione della caviglia.Inoltre, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite. Zero è normale. Nessuna prova di eritema e gonfiore.Uno è l'artrite più lieve. Eritema e lieve gonfiore confinato ai tarsali o all'articolazione della caviglia. Due è l'artrite moderata.Eritema e lieve gonfiore che si estende dalla caviglia ai tarsali. Tre è la grave artrite. Eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsali.Quattro è l'artrite più grave. L'eritema e il forte gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o anchilosi dell'arto. Dopo aver sacrificato il mouse, rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici.Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta. Fissare l'articolazione della caviglia in paraformaldeide al 4% per due giorni a temperatura ambiente. Quindi decalcificare il giunto in EDTA al 10% per un mese a temperatura ambiente e cambiare il mezzo settimanale.Dopo un mese, posizionare il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida a circa 60 gradi Celsius per incorporare il tessuto. Raffreddare brevemente. Impostare lo spessore sul microtomo a quattro micrometri e tagliare le fette.Quindi galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius per un breve periodo per espandere le sezioni. Montare le sezioni su scivoli e mettere gli scivoli nel forno a 70 gradi Celsius per due ore. Per un uso futuro, conservare le diapositive a meno 20 gradi Celsius.Quindi, posizionare le diapositive in un rack ed eseguire lavaggi in xilene ed etanolo secondo il manoscritto per reidratare a temperatura ambiente. Infine, lavare in acqua corrente del rubinetto per tre minuti. Quindi macchiare la soluzione verde veloce dello 0,1% per cinque minuti.Risciacquare in acido acetico all'1% per 10 secondi e macchiare in soluzione di colorazione 0,1%Safranin O per 20 minuti. Successivamente, immergere le diapositive nelle soluzioni di lavaggio dello xilene e dell'etanolo secondo il manoscritto. Montare le sezioni di tessuto sullo stadio dell'oggetto e osservare i tessuti al microscopio.Per visualizzare i neutrofili, eseguire la colorazione immunoistochimica cuocendo prima le sezioni di paraffina per due ore a 78 gradi Celsius. Posizionare le diapositive in un rack ed eseguire i lavaggi di xilene, etanolo, acqua e PBS secondo il manoscritto per reidratarsi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere una goccia di tampone di permeabilizzazione per coprire il tessuto.Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Evitare di risciacquare direttamente il tessuto.Successivamente, eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore. Disporre le diapositive in un rack. Immergere le diapositive nella caldaia a pressione riempita con tampone di recupero.Mettere la caldaia a pressione nel forno a microonde e impostare il forno a microonde a 600 watt e riscaldare gli scivoli per 10 minuti. Dopo l'ebollizione, mantenere le diapositive nella caldaia raffreddare a 90 gradi Celsius. Esezioni le diapositive e sciacquarle in PBS per tre minuti tre volte.Per placare l'attività endogena della perossidasi, immergere i vetrini in perossido di idrogeno appena preparato al 3% a temperatura ambiente per 15 minuti. Risciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica.Evitare di toccare il campione. Aggiungere al campione da 50 a 100 microlitri di albumina di siero bovino al 3% per bloccare e posizionare i campioni in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi rimuovere la soluzione di blocco.Aggiungere rapidamente 50 microlitri di anticorpi primari diluiti PBS a ciascuna sezione. Incubare gli scivoli in un vassoio controllato dall'umidità a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, eserti dal vassoio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Aggiungere 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti PBS ai tessuti. Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Sviluppare in soluzione DAB diluita per cinque minuti. Evitare lo sviluppo di un colore scuro causato dalla reazione eccessiva del DAB.Risciacquare gli scivoli in acqua distillata. Controsostenere le diapositive in ematossilina per 10 secondi e sciacquare gli scivoli in acqua del rubinetto per cinque minuti. Risciacquare in alcol acido soluzione di differenziazione super veloce per tre secondi, quindi risciacquare in acqua del rubinetto per 10 minuti.Immergere le diapositive nei lavaggi di etanolo e xilene a temperatura ambiente secondo il manoscritto. Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio.In questo studio, sono stati eseguiti esperimenti di sacchetto d'aria per indagare il reclutamento di neutrofili stimolato dall'LPS in vivo. I sottoinsiemi di leucociti negli essudati della busta d'aria erano molto più alti che nel controllo. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo di artrite indotta da coadiuvanti ha mostrato un edema significativo nella zampa.Il diametro dell'articolazione della caviglia è aumentato e il punteggio di artrite è aumentato costantemente. Il danno alla cartilagine è la sindrome rappresentativa dell'artrite reumatoide. La sfida CFA ha indotto una grande quantità di infiltrazione di leucociti, significativa erosione della cartilagine e iperplasia sinoviale.Mpo in qualsiasi livello di espressione sono marcatori rappresentativi di infiltrazione neutrofila che sono stati significativamente upregolati nella sezione articolare. Assicurarsi che l'aria sia iniettata nella pelle, ma non nel muscolo. Possiamo anche studiare la formazione di trappole extracellulari neutrofile mediante colorazione immunoistochimica delle sezioni del tessuto articolare della caviglia con anti-p84 o Questi metodi possono essere utilizzati per studiare altre malattie infiammatorie come la malattia infiammatoria intestinale.

Research

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Biology

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