Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81430099 및 31500704), 국제 협력 및 교환 프로젝트 (교부수 번호 2014DFA32950), 그리고 중국 의학 대학의 연구 프로그램에 의해 지원되었다 ( 부여 번호 BUCM-2019-JCRC006 및 2019-JYB-TD013).

모든 실험 절차는 중국 의학 동물 관리 및 사용 위원회의 베이징 대학에 의해 검토 되고 승인되었습니다.
참고: C57BL/6 마우스 (7-8 주 령)를 사용 하였다.
1. 호중구 격리
<ol><li>후막 삼출 세포의 취득<ol>
<li>ddH2O. 마우스 수에 따라 필요한 부피를 계산하여 신선한 10% 프로테오오스 펩톤 용액을 준비한다. 참고: 용액의 mL(2N+1)을 미리 용해및 여과해?...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

말초 혈액7,골수 및 조직18에서 고도로 정제 된 호중구의 상세한 프로토콜은 오랫동안 사용할 수 있었습니다. 여기에서 우리는 성숙한 호중구가 추가 항염증제 및 항산화 방지 연구를 위해 불활성화남아 있는 복막 액체19에서 호중구를 분리하는 방법을 채택합니다.
우리는 공기 파우치 실험을 사용하여 생체 내에서 호중구...

호중구는 가장 풍부한 백혈구이며 인간 에서 전체 백혈구 인구의 50-70 %를차지합니다 1. 호중구는 급성 염증 중 주요 응답자 중 하나입니다. 호중구는 조직 상주세포에의해 방출된 사이토카인 및 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집될 수 있다2,3,4,이는 호중구 및 혈관 내피 세포의 표면에 세포 부착 분자 사이의 상호작용에 의해 매개되는5. 호중구는 반응성 산소 종(ROS) 및 기타 조직 손상분자3,6의방출을 통해 조직을 손상시키는 강력한 능력으로 인해 병원성 염증 반응에 대한 역할을 하는 근본적인 방어및 역할을 한다.
이전 연구는 마우스 또는 인간에게서 몇몇 호중구 격리 프로토콜을 기술했습니다. Oh et al. 인간호중구를 전혈로부터 분리시키는 밀도 구배 분리 방법을 7. 그러나, 마우스 혈액에서 충분한 호중구의 분리는 작은 혈액 양 때문에 어렵습니다. 대안적으로, 많은 수의 순수하고 생존 가능한 마우스 호중구는 마우스 복막 유체로부터 유도될 수 있으며, 이들 정제된 호중구는 호중구 침투, 이동, 화학택시, 산화 파열, 사이토카인 및 호중구 외세포(NET)생산8을포함하는 세포 기능의 여러 측면을 검사하기 위해 생체내 생체내 기능을 검사하는데 사용될 수 있다. Transwell공고9 또는 지그몬드 챔버 어세10,11은 시험관내에서 호중구 이동을 평가하는데 사용될 수 있다. 공기 파우치 모델은 생체 내 호중구의 이동 및 침투를 평가하는 데 사용됩니다. 피하 공기 파우치 모델은 염증 세포의 이동을 연구하는 편리한 생체 내 동물 모델이다.
전통적으로 호중구는 급성 염증 단계에서 병원균 제거제로 간주되었습니다. 그러나, 최근 사실 인정은 호중구가 전문화한 기능의 중요한 다양성을 능력을 발휘하는 복잡한 세포이다는 것을 보여주었습니다. 호중구는 급성 손상 및 수리, 종양 발생, 자가 면역 반응 및 만성 염증 과 같은 많은 과정을 조절할 수있습니다 12,13. 호중구는 또한 적응성 면역 반응을 조절하고 B 세포 및 T 세포14,15를조절할 수 있다. 호중구의 실질적인 부족은 인간에서 사망 또는 중증 면역 결핍으로 이어지며 마우스에서 호중구 고갈은 사망으로 이어지며, 장기에서 호중구의 과도한 활성화 또는 모집은 류마티스 관절염(RA) 및전신 성 홍반성 루푸스(SLE)와 같은 여러 면역 질환을 유발한다. 호중구는 RA 환자의 활액에서 가장 풍부한 세포이다. 호중구는 연골 침식을 악화시키는 분해를 통해 과도한 양의 골수페록시다아제(MPO)와 호중구 엘라타아제(NE)를 생성합니다. MPO는 주로호중구(16)의과립에 발현되는 과산화효소이다. NE는 관절 연골파괴와 연관되어 17. MPO 및 NE는 RA 환자의 조직에서 호중구 이동 및 침윤의 상태를 평가하는데 사용될 수 있었다.
본 문서는 생체 내 및 시험관 내에서 유도된 정상 호중구의 이동뿐만 아니라 마우스 관절 특이적 염증 모델에서 병리학적 호중구의 침투를 평가하는 세 가지 통상적인 방법을 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

호중구는 선천적인 면역 계통의 중요한 일원이고 병원체 및 병리학적인 선동적인 반응에 대하여 호스트 방어에 있는 중추적인 역할을 합니다. 호중구는 사이토 카인과 케모카인의 지도를 통해 염증 부위에 모집 될 수 있습니다. 호중구의 압도적 인 침투는 류마티스 관절염 (RA)과 같은 무차별 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 후막 삼출액으로부터 분리된 호중구는 정의된 화학유고력제, N-포밀-메트-레-페(fMLP), 트랜스웰 또는 지그몬드 챔버 어세에서 시험관내 반응한다. 공기 파우치 실험은 생체 내에서 리포폴리사카라이드(LPS)를 향하여 호중구의 화학요법을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 보조제 유도 관절염(AA) 마우스 모델은 RA 연구에서 자주 사용되며, 항-골수페록시다아제(MPO) 또는 항호중구 엘라스타제(NE) 항체를 이용한 관절 절편의 면역조직화학적 염색은 잘 확립된 측정 방법이다. 호중구 침투. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료를 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

후막 삼출 세포는 마우스의 세척액으로부터 수집하였다. 세포는 RPMI-1640 완전한 배지의 1 mL에서 재중단되었고, 2단계(54.8%/70.2%)에 층상하였다. 불연속 밀도 구배(도1A)및 30분 동안 1,500 x g에서 원심분리(≥95%, ~1 x 107 호중구/마우스)를 하부 계면으로부터 회수하였다(도1B).
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Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

여기에서, 우리는 생체외 및 시험관내 둘 다 호중구 이동 및 침투를 평가하는 3개의 방법을 제시합니다. 이 방법은 호중구 이동을 표적으로 하는 유망한 치료법을 발견하기 위하여 이용될 수 있습니다.

마우스에서 호중구의 이동 및 침투 감지

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

이 방법은 생체 내 및 시험관에서 정상적인 호중구의 이동뿐만 아니라 마우스 관절염 모델에서 병리학 호중구의 침투를 평가하기위한 세 가지 자주 사용되는 방법을 설명하려고합니다. 우리는이 방법이이 분야의 다른 연구자를 위해 유용 할 수 있다고 생각합니다. 이 프로토콜은 공기 파우치 분석및 보조 유발 관절염을 사용하여 염증 부위의 호중구의 이동 능력을 평가하는 방법론적 세부 사항을 포함합니다.이 기술의 의미는 치료 그룹과 모델 그룹을 비교하여 관절염 치료쪽으로 확장됩니다. 이 방법은 염증성 질환에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 염증성 장 질환에 적용 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구소의 대학원 생인 칭이 루와 하이수 장(Haixu Jiang)이 될 것입니다.0일째에 마우스의 마취 후, 5밀리리터 주사기에 부착된 0.22 미크론 필터를 사용하여 멸균 된 공기의 3 밀리리터 부피를 얻습니다. 핀셋으로 마취 된 마우스의 뒤쪽 피부를 들어 올리고 피하 3/8 인치 바늘로 26 게이지를 사용하여 멸균 된 공기의 3 밀리리터를 주입하십시오. 치료 후, 호흡 단위에서 마우스를 제거하고 잘 설정 된 케이지에 배치합니다.마우스가 움직이기 시작할 때까지 살아 있는지 확인하기 위해 마우스를 모니터링합니다. 셋째 날에는 이전에 확립된 에어 포켓에 멸균 공기 3밀리리터를 추가로 주입하여 공기 파우치를 유지합니다. 6일째에는 공기 파우치에 다른 치료법을 주입합니다.부정적인 대조군으로 PBS의 1 밀리 리터를 주입 하 고 로컬 염증을 유도 하는 긍정적인 제어로 밀리 리터 LPS 당 하나의 마이크로 그램의 1 밀리 리터를 주입. 6 시간 후, 마우스를 희생. 각 공기 파우치에 대해, 공기 파우치를 세척하고 15 밀리리터 원심분리기 튜브에서 염증 제비물을 수집하기 위해 세척 버퍼 1 밀리리터를 주입하십시오.그런 다음 공기 파우치를 세척 버퍼 2밀리리터로 두 번 세척하고 동일한 원심분리기 튜브에서 염증 성 외출물을 수집합니다. 원심분리기는 실온에서 10분 동안 100배 g의 원심분리기. 상체를 버리고 세척 버퍼의 1 밀리리터로 셀을 다시 중단합니다.자동 혈액학 분석기를 사용하여 호중구 비율을 정량화하기 위해 세포를 계산합니다. 적어도 5초 이상 소용돌이를 통해 완전한 Freund의 보조를 일시 중단한 다음 100마이크로리터의 서스펜션을 인슐린 인젝터로 그립니다. 마취 후, 선택한 발을 표시하고 발목 관절 공간에 네 개의 periarticular 반점에 인젝터에서 완전한 Freund의 보조제 20 마이크로 리터를 주입.처리된 마우스를 새로운 챔버에 넣습니다. 마우스가 움직일 수 있는 능력을 회복할 때까지 호흡하고 있는지 확인하기 위해 마우스를 모니터링합니다. 3일마다 포켓 두께 게이지를 사용하여 발목 관절 직경을 측정합니다.또한, 관절염 점수 기준에 의해 관절염 심각도 평가. 0은 정상입니다. 홍반과 붓기의 증거가 없습니다.하나는 가장 가벼운 관절염입니다. 홍반과 온화한 붓기는 타르살 또는 발목 관절에 국한됩니다. 2개는 적당한 관절염입니다.홍반과 가벼운 붓기는 발목에서 타르살로 확장됩니다. 세 가지는 심한 관절염입니다. 홍반과 중간 부종은 발목에서 중족골 관절까지 연장됩니다.4개는 가장 가혹한 관절염입니다. 홍반과 심한 붓기는 발목, 발 및 숫자, 또는 사지의 앵킬로증을 포함합니다. 마우스를 희생한 후 핀셋과 가위로 뒷다리에서 피부와 근육의 일부를 제거합니다.70%에탄올로 관절을 뿌리고 종이 타월을 사용하여 나머지 근육을 제거합니다. 실온에서 2일 동안 발목 관절을 4%의 파라포름알데히드로 고정합니다. 그런 다음 실온에서 1개월 동안 10%EDTA로 조인트를 탈칼시화하고 중간 주간을 변경합니다.한 달 후, 조직을 약 60섭에 액체 파라핀의 특정 부피가 있는 표시된 금형에 배치하여 조직을 포함시십시오. 잠시 식히세요. 마이크로톤의 두께를 4마이크로미터로 설정하고 슬라이스를 잘라냅니다.그런 다음 섹션을 확장하기 위해 짧은 시간 동안 섭씨 43도 수조에 섹션을 플로트합니다. 섹션을 슬라이드에 마운트하고 슬라이드를 2 시간 동안 섭씨 70도에서 오븐에 넣습니다. 향후 사용을 위해 슬라이드를 영하 20도에서 보존하십시오.다음으로, 슬라이드를 랙에 놓고 원고에 따라 자일렌과 에탄올에 세척하여 실온에서 수분을 보충합니다. 마지막으로, 흐르는 수돗물로 3분간 씻으시다. 그런 다음 0.1 % 빠른 녹색 용액으로 5 분 동안 얼룩지게합니다.1%아세트산으로 10초 간 헹구고 0.1%의 사프란 오 스테닝 용액을 20분 동안 염색합니다. 그 후, 원고에 따라 자일렌과 에탄올 세척 솔루션에 슬라이드를 담그십시오. 조직 섹션을 개체 단계에 마운트하고 현미경으로 조직을 관찰합니다.호중구를 시각화하려면 먼저 78°C에서 2시간 동안 파라핀 섹션을 굽아 면역히스토케미컬 염색을 수행합니다. 슬라이드를 랙에 놓고 원고에 따라 자일렌, 에탄올, 물 및 PBS 세척을 수행하여 실온에서 수분을 보충합니다. 그런 다음 조직을 커버하기 위해 투과화 버퍼 한 방울을 추가합니다.습도 조절 트레이에서 10분 동안 섭씨 37도의 구역을 배양합니다. 그 후, 3 분 동안 PBS에서 슬라이드를 헹구십시오. 조직을 직접 헹지 마십시오.다음으로, 열 유도항원 에피토프 검색을 수행한다. 슬라이드를 랙에 정렬합니다. 검색 버퍼로 채워진 압력 보일러에 슬라이드를 담그십시오.압력 보일러를 전자레인지에 넣고 전자레인지를 600와트로 설정하고 슬라이드를 10분 동안 가열합니다. 끓인 후, 보일러에 슬라이드를 유지하여 섭씨 90도까지 식힙니다. 슬라이드를 꺼내 PBS에서 3분 동안 3분간 헹구세요.내인성 과산화효소 활동을 담금질하려면 15분 동안 실온에서 3%의 과산화수소에 미끄럼을 담그십시오. PBS에서 슬라이드를 3분 3회 헹구십시오. 소수성 펜으로 샘플 주위에 큰 원을 윤곽을 설명합니다.샘플을 만지지 마십시오. 3%소 세럼 알부민의 50~100마이크로리터를 샘플에 추가하여 60분 동안 습도 조절 챔버에 샘플을 차단하고 배치합니다. 그런 다음 차단 솔루션을 제거합니다.PBS 희석 1 차 항체의 50 마이크로 리터를 각 섹션에 신속하게 추가합니다. 밤새 섭씨 4도에서 습도 제어 트레이에 슬라이드를 배양. 둘째 날에는 트레이를 꺼내 실온에서 30분 동안 방치하십시오.그런 다음 PBS에서 슬라이드를 3분 동안 3분간 헹구십시오. 조직에 PBS 희석 이차 항체의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 30분 동안 습도 조절 트레이에서 30분간 인큐베이션을 합니다.그런 다음 PBS에서 슬라이드를 3분 동안 3분간 헹구십시오. 희석DAB 용액을 5분간 개발합니다. DAB의 과잉 반응으로 인한 어두운 색상의 개발을 피하십시오.슬라이드를 증류수로 헹구십시오. 헤마톡슬린의 슬라이드를 10초 동안 카운터스테인하고 슬라이드를 수돗물로 5분간 헹구십시오. 산성 알코올 슈퍼 빠른 분화 용액을 3 초 동안 헹구고 수돗물로 10 분 동안 헹구습니다.원고에 따라 실온에서 에탄올과 자일렌 세척에 슬라이드를 담그십시오. 장착 솔루션으로 커버슬립을 수정합니다. 현미경으로 조직을 관찰하십시오.이 연구에서는, 공기 파우치 실험은 생체 내에서 LPS에 의해 자극된 호중구 모집을 조사하기 위하여 수행되었습니다. 공기 파우치 의 백혈구 서브 세트는 제어보다 훨씬 높았다. 대조군에 비해, 보조 유도 관절염 그룹은 발에 상당한 부종을 보였다.발목 관절 직경이 증가하고 관절염 점수가 지속적으로 상승했습니다. 연골 손상은 류마티스 관절염의 대표적인 증후군입니다. CFA 챌린지는 다량의 백혈구 침투, 유의한 연골 침식 및 수축증을 유도했습니다.임의의 발현 수준에서 MPO는 조인트 섹션에서 유의히 강화된 호중구 침투의 대표적인 마커이다. 공기가 피부에 주입되어 있는지 확인하지만 근육에 주입되지 는 않습니다. 또한 항p84를 이용한 발목 관절 조직 섹션의 면역조직화학적 염색에 의한 호중구 세포외 트랩의 형성을 조사할 수 있거나 이러한 방법은 염증성 장질환과 같은 다른 염증성 질환을 연구하는 데 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

연구

생물학

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

카달 정맥 포도당 주사에 의한 파라바이오틱 마우스의 공유 혈액 공급 확립 감지

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...