Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 81430099 og 31500704), International Cooperation and Exchange Projects (stipendnummer 2014DFA32950), og forskningsprogrammet til Beijing University of Chinese Medicine ( gi tall BUCM-2019-JCRC006 og 2019-JYB-TD013).

Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
MERK: C57BL/6 mus (7-8 uker gammel) ble brukt.
1. Nøytrofil isolasjon
<ol><li>Oppkjøp av peritoneale ekssudatceller<ol>
<li>Forbered fersk 10% proteose peptoneløsning i ddH2O. Beregn volumet som trengs i henhold til antall mus. MERK: Angi antall mus som N, (2N+1) ml oppløsning må oppløses og filtreres på forhån...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Detaljerte protokoller av svært rensede nøytrofiler fra perifert blod7,benmarg og vev18 har vært tilgjengelig i lang tid. Her vedtar vi en metode for å isolere nøytrofiler fra peritonealvæske19 hvor modne nøytrofiler forblir inaktiverte for ytterligere antiinflammatoriske og antioksidantstudier.
Vi brukte luftposeeksperimentet til å utforske LPS-indusert infiltrasjon av nøytrofiler in vivo. Denne metoden er foresl...

Nøytrofiler er den mest rikelig hvite blodlegemer og står for 50-70% av hele hvite blodlegemer befolkningen hos mennesker1. Nøytrofiler er en av de primære responderne under akutt betennelse. Nøytrofiler kan rekrutteres til betennelsessteder via veiledning av cytokiner og chemokiner utgitt av vev-resident celler2,3,4, som er mediert av interaksjoner mellom celle vedhesjon molekyler på overflaten av nøytrofiler og vaskulære endotelceller5. Nøytrofiler er grunnleggende for å være vert for forsvar og spille en rolle i patologiske inflammatoriske reaksjoner på grunn av deres kraftige evne til å skade vev via frigjøring av reaktive oksygenarter (ROS) og andre vevsskadelige molekyler3,6.
Tidligere studier har beskrevet flere nøytrofile isolasjonsprotokoller fra mus eller mennesker. Oh et al. demonstrerte en tetthet gradient separasjonmetode for å isolere menneskelige nøytrofiler fra hele humant blod7. Imidlertid er isolasjonen av tilstrekkelignøytrofiler fra museblod vanskelig på grunn av det lille blodvolumet. Alternativt kan et stort antall rene og levedyktige musnøytrofiler fremkalles fra museperitonealvæske, og disse rensede nøytrofiler kan brukes ex vivo til å undersøke flere aspekter av cellulære funksjoner ex vivo, inkludert nøytrofil infiltrasjon, migrasjon, chemotaxis, oksidativ trøkk, cytokin og nøytrofil ekstracellulær felle (NET) produksjon8. Transwell assays9 eller Zigmond kammer analyserer 10,11 kan brukes til å evaluere nøytrofil migrasjon in vitro. Luftposemodellen brukes til å evaluere migrering og infiltrasjon av nøytrofiler in vivo. Den subkutane luftposemodellen er en praktisk in vivo-dyremodell for å studere migrering av inflammatoriske celler.
Tradisjonelt ble nøytrofiler ansett som patogene eliminatorer i akutte faser av betennelse. Imidlertid har nyere funn vist at nøytrofiler er kompliserte celler som utfører en betydelig rekke spesialiserte funksjoner. Nøytrofiler kan regulere mange prosesser som akutt skade og reparasjon, tumorigenese, autoimmun respons og kronisk betennelse12,13. Nøytrofiler modulerer også adaptive immunresponser og kan regulere B-celler og T-celler14,15. Betydelig mangel på nøytrofiler fører til dødelighet eller alvorlig immunsvikt hos mennesker og nøytrofil uttømming hos mus fører til dødsfall, mens overdreven aktivering eller rekruttering av nøytrofiler i organer forårsaker flere immunsykdommer, som revmatoid artritt (RA) og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Nøytrofiler er de mest tallrike cellene i synovialvæsken til RA-pasienter. Nøytrofiler produserer store mengder myeloperoxidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) via nedbrytning, noe som forverrer bruskerosjon. MPO er et peroksidaseenzym som hovedsakelig uttrykkes i granulatet av nøytrofiler16. NE er forbundet med leddbrusk ødeleggelse17. MPO og NE kan brukes til å evaluere statusen for nøytrofil migrasjon og infiltrasjon i vevet til RA-pasienter.
Denne artikkelen gir tre konvensjonelle metoder for å evaluere migrering av normale nøytrofiler indusert både in vivo og in vitro, samt infiltrasjon av patologiske nøytrofiler i en mus felles-spesifikk betennelse modell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Nøytrofiler er et stort medlem av det medfødte immunsystemet og spiller sentrale roller i vertsforsvar mot patogener og patologiske inflammatoriske reaksjoner. Nøytrofiler kan rekrutteres til betennelsessteder via veiledning av cytokiner og chemokiner. Overveldende infiltrasjon av nøytrofiler kan føre til ukritisk vevsskade, for eksempel ved revmatoid artritt (RA). Nøytrofiler isolert fra peritoneal ekssudat reagerer på en definert kjemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammeranalyser. Luftposeeksperimentet kan brukes til å evaluere chemotaxis av nøytrofiler mot lipopolysakkarid (LPS) in vivo. Den adjuvant-induserte leddgikt (AA) musemodellen brukes ofte i RA-forskning, og immunohistokjemisk farging av fellesseksjoner med anti-myelopeproksil (MPO) eller antinøytrofile elastase (NE) antistoffer er en veletablert metode for å måle nøytrofil infiltrasjon. Disse metodene kan brukes til å oppdage lovende terapier rettet mot nøytrofil migrasjon.

Peritoneale ekssudatceller ble samlet inn fra lavagevæske av mus. Celler ble suspendert på nytt i 1 ml RPMI-1640 komplett medium, lagdelt på en to-trinns (54,8% / 70,2%) seponert tetthet gradient (figur 1A),og sentrifugert på 1500 x g for 30 min. Nøytrofiler (≥95%, ~ 1 x 107 nøytrofiler / mus) ble gjenopprettet fra det nedre grensesnittet (Figur 1B).
<p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Her presenterer vi tre metoder for å vurdere nøytrofil migrasjon og infiltrasjon både in vivo og in vitro. Disse metodene kan brukes til å oppdage lovende terapeutiske midler rettet mot nøytrofil migrasjon.

Oppdage migrering og infiltrasjon av nøytrofiler hos mus

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Denne metoden prøver å beskrive tre ofte brukte metoder for å evaluere migrering av normale nøytrofiler in vivo og in vitro, samt infiltrasjon av patologiske nøytrofiler i musartrittmodell. Vi tror denne metoden kan være nyttig for andre forskere på dette feltet. Denne protokollen inneholder metodiske detaljer for å evaluere migrasjonskapasiteten til nøytrofiler i betennelsesstedene ved hjelp av luftposeanalyse og adjuvant-indusert leddgikt.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot leddgikt terapi ved å sammenligne modellgruppen med behandlingsgruppen. Denne metoden kan gi innsikt i inflammatorisk sykdom og kan brukes på inflammatorisk tarmsykdom. Demonstrere prosedyren vil være Qingyi Lu og Haixu Jiang, post-graduate studenter fra vår lab.Etter bedøvelse av musene på dag null, bruk et 0,22 mikronfilter festet til en fem milliliter sprøyte for å oppnå et tre milliliter volum sterilisert luft. Løft baksiden av den bedøvede musen med pinsett og subkutant bruke en 26 gauge med 3/8 tommers nål for å injisere tre milliliter av sterilisert luft. Etter behandling fjerner du musene fra pusteenheten og plasserer dem i et godt sett bur.Overvåk musene for å sikre at de er i live til de begynner å bevege seg rundt. På dag tre injiserer du ytterligere tre milliliter sterilisert luft i den tidligere etablerte luftlommen for å opprettholde luftposen. På dag seks injiserer du forskjellige behandlinger i luftposen.Injiser en milliliter PBS som en negativ kontroll og injiser en milliliter av ett mikrogram per milliliter LPS som den positive kontrollen for å indusere lokal betennelse. Etter seks timer, ofre musene. For hver luftpose, injiser en milliliter vaskebuffer for å vaske luftposen og samle den inflammatoriske ekssudaten i et 15 milliliter sentrifugerør.Vask deretter luftposen med to milliliter vaskebuffer to ganger og samle den inflammatoriske ekssudat i samme sentrifugerør. Sentrifuge ved 100 ganger g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast de overnaturante og gjenoppusse cellene i en milliliter vaskebuffer.Telle cellene for å kvantifisere nøytrofil forholdet ved hjelp av automatisk hematologi analysator. Suspender fullstendig Freunds adjuvans ved å virvle minst fem sekunder, og trekk deretter 100 mikroliter suspensjon i en insulininjektor. Etter bedøvelse markerer du den valgte poten og injiserer 20 mikroliter komplett Freunds adjuvans fra injektoren til fire periartikulære flekker på ankelleddet.Sett de bearbeidede musene i det nye kammeret. Overvåk musene for å sikre at de puster til de gjenvinner evnen til å bevege seg. Hver tredje dag, bruk en lommetykkelsesmåler for å måle ankelledddiameteren.Også vurdere leddgikt alvorlighetsgrad ved leddgikt scoring kriterium. Null er normalt. Ingen tegn på erytem og hevelse.Den ene er den mildeste leddgikten. Erytem og mild hevelse begrenset til tarsaler eller ankelledd. To er moderat leddgikt.Erytem og mild hevelse som strekker seg fra ankelen til tarsalene. Tre er alvorlig leddgikt. Erytem og moderat hevelse som strekker seg fra ankelen til metatarsale ledd.Fire er den mest alvorlige leddgikt. Erytem og alvorlig hevelse omfatter ankel, fot og sifre, eller ankylose i lemmen. Etter å ha ofret musen, fjern huden og en del av muskelen fra bakbenet med pinsett og saks.Spray leddet med 70% etanol og fjern resten av musklene ved hjelp av et papirhåndkle. Fest ankelleddet i 4% paraformaldehyd i to dager ved romtemperatur. Deretter avkalk skjøten i 10% EDTA i en måned ved romtemperatur og endre mediet ukentlig.Etter en måned, legg vevet i en markert mugg med visst volum flytende parafin ved ca. 60 grader Celsius for å bygge inn vevet. Avkjøl en kort stund. Sett tykkelsen på mikrotomen på fire mikrometer og kutt skiver.Deretter flyter seksjonene i et 43 graders Celsius vannbad i kort tid for å utvide seksjonene. Monter seksjonene på lysbildene og legg lysbildene i ovnen på 70 grader Celsius i to timer. For fremtidig bruk, bevare lysbildene på minus 20 grader Celsius.Deretter plasserer du lysbildene i et stativ og utfører vasker i xylen og etanol i henhold til manuskriptet for å rehydrere ved romtemperatur. Til slutt, vask i rennende vann fra springen i tre minutter. Deretter flekker i 0,1% rask grønn løsning i fem minutter.Skyll i 1% eddiksyre i 10 sekunder og beis i 0,1% Safranin O farging løsning i 20 minutter. Deretter fordyper du lysbildene i xylen- og etanolvaskeløsningene i henhold til manuskriptet. Monter vevsseksjonene på objektstadiet og observer vevet under et mikroskop.For å visualisere nøytrofiler, utfør immunohistokjemisk farging ved først å bake parafinseksjonene i to timer ved 78 grader Celsius. Plasser lysbildene i et stativ og utfør xylen-, etanol-, vann- og PBS-vaskene i henhold til manuskriptet for å rehydrere ved romtemperatur. Legg deretter til en dråpe permeabiliseringsbuffer for å dekke vevet.Inkuber seksjonene i et fuktighetsstyrt brett ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Deretter skyller du lysbildene i PBS i tre minutter tre ganger. Unngå å skylle vevet direkte.Deretter utfører du varmeindusert antigen epitophenting. Ordne lysbildene i et stativ. Senk lysbildene ned i trykkkjelen fylt med gjenfinningsbuffer.Sett trykkkjelen i mikrobølgeovnen og sett mikrobølgeovnen på 600 watt og varm lysbildene i 10 minutter. Etter koking, hold lysbildene i kjelen for å avkjøles til 90 grader Celsius. Ta ut lysbildene og skyll dem i PBS i tre minutter tre ganger.For å slukke endogene peroksidaseaktivitet, senk lysbildene i nylaget 3% hydrogenperoksid ved romtemperatur i 15 minutter. Skyll lysbildene i PBS i tre minutter tre ganger. Skisser en stor sirkel rundt prøven med en hydrofob penn.Unngå å berøre prøven. Legg til prøven 50 til 100 mikroliter på 3% storfe serum albumin for å blokkere og plassere prøvene i et fuktighetskontrollert kammer ved 37 grader Celsius i 60 minutter. Fjern deretter blokkeringsløsningen.Tilsett 50 mikroliter PBS fortynnet primært antistoff til hver seksjon raskt. Inkuber lysbildene i et fuktighetsstyrt brett ved fire grader Celsius over natten. På den andre dagen, ta ut brettet og la den stå ved romtemperatur i 30 minutter.Skyll deretter lysbildene i PBS i tre minutter tre ganger. Tilsett 50 mikroliter PBS fortynnede sekundære antistoffer til vevet. Inkuber glir i et fuktighetsstyrt brett ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Skyll deretter lysbildene i PBS i tre minutter tre ganger. Utvikle i fortynnet DAB-løsning i fem minutter. Unngå utviklingen av en mørk farge forårsaket av overreaksjon av DAB.Skyll lysbildene i destillert vann. Motvirke lysbildene i hematoksylin i 10 sekunder og skyll lysbildene i vann fra springen i fem minutter. Skyll i sur alkohol super rask differensieringsløsning i tre sekunder, skyll deretter i vann fra springen i 10 minutter.Dypp lysbildene i etanol og xylen vasker ved romtemperatur i henhold til manuskriptet. Fest dekkslippen med monteringsoppløsning. Vær oppmerksom på vevet under et mikroskop.I denne studien ble det utført luftposeeksperimenter for å undersøke nøytrofilrekruttering stimulert av LPS in vivo. Leukocytt undergruppene i luftposen ekssudatene var mye høyere enn i kontrollen. Sammenlignet med kontrollgruppen viste den adjuvant-induserte leddgiktgruppen betydelig ødem i poten.Ankelledddiameteren økte og leddgikt score steg konsekvent. Bruskskade er det representative syndromet av revmatoid artritt. CFA-utfordringen induserte en stor mengde leukocytterinfiltrasjon, betydelig bruskerosjon og synovial hyperplasi.MPO i ethvert uttrykksnivå er representative markører for nøytrofilinfiltrasjon som ble betydelig oppregulert i ledddelen. Pass på at luften injiseres i huden, men ikke inn i muskelen. Vi kan også undersøke dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller ved immunohistokjemisk farging av ankelleddvevsseksjonene med anti-p84 eller Disse metodene kan brukes til å studere andre inflammatoriske sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering for å oppdage Diverse Gene Expression Mønstre i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Oppdager Somatiske genetiske forandringer i vevsprøver av Exon Capture og massivt parallelle Sekvense

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro celle migrasjon og invasjon Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Tenkelig intermediære filamenter og piskehale som henger med 2-dimensjonal direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

MUB40 peptid for bruk i å oppdage nøytrofile-mediert betennelse hendelser

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Oppdage og karakteriserer protein selv montering in vivo av Flow flowcytometri

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Oppdage etablering av delt blodtilførsel hos parabiotiske mus ved Caudal Vene glukoseinjeksjon

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

En kostnadseffektiv og tilpasningsdyktig scratch migrasjon analyse

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolering av humane nøytrofiler fra fullblod og buffyfrakker

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...