Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 81430099 и 31500704), международного сотрудничества и обмена проектов (грант номер 2014DFA32950), а также научно-исследовательская программа Пекинского университета китайской медицины ( номера гранта BUCM-2019-JCRC006 и 2019-JYB-TD013).

Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Пекинским университетом китайской медицины по уходу за животными и использованием комитета.
ПРИМЕЧАНИЕ: C57BL/6 мышей (7-8 недель) были использованы.
1. Нейтрофилов изоляция
<ol><li>Приобретение перито...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Подробные протоколы высокоочищенных нейтрофилов из периферической крови7,костного мозга и тканей18 имеются в наличии в течение длительного времени. Здесь мы принимаем метод изоляции нейтрофилов из брюшной жидкости19, в котором зрелые нейтрофилы о...

Нейтрофилы являются наиболее распространенными белыми кровяных телец и составляют 50-70% всей популяции белых кровяных клеток у людей1. Нейтрофилы являются одним из основных ответчиков во время острого воспаления. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью руководства цитокинов и хемокинов, выделяемых клетками-резидентамитканей2,3,4, который опосредован взаимодействиями между молекулами клеточной адгезии на поверхности нейтрофилов и сосудистых эндотелиевых клеток5. Нейтрофилы имеют основополагающее значение для размещения обороны и играют роль в патологических воспалительных реакций из-за их мощной способности повредить ткани через выпуск реактивных видов кислорода (ROS) и других тканей повреждения молекул3,6.
Предыдущие исследования описали несколько протоколов изоляции нейтрофилов от мышей или людей. Oh et al. продемонстрировали метод разделения градиента плотности для изоляции человека нейтрофилов от всей человеческой крови7. Однако, изоляция достаточного нейтрофилов из крови мыши затруднена из-за малого объема крови. Кроме того, большое количество чистых и жизнеспособных нейтрофилов мыши могут быть получены из мыши перитонеальной жидкости, и эти очищенные нейтрофилы могут быть использованы ex vivo для изучения нескольких аспектов клеточных функций ex vivo, в том числе нейтрофилов инфильтрации, миграции, хемотаксиса, окислительного всплеска, цитокина и нейтрофила внеклеточной ловушки (NET) производства8. Трансуэлл анализирует9 или Зигмонд камеры анализы10,11 могут быть использованы для оценки миграции нейтрофилов в пробирке. Модель воздушной сумки используется для оценки миграции и инфильтрации нейтрофилов in vivo. Подкожная модель воздушного мешка является удобной моделью in vivo для изучения миграции воспалительных клеток.
Традиционно нейтрофилы считались возбудителями в острых фазах воспаления. Однако последние результаты показали, что нейтрофилы являются сложными клетками, которые выполняют значительное разнообразие специализированных функций. Нейтрофилы могут регулировать многие процессы, такие как острая травма и ремонт, опухолевое, аутоиммунные реакции, и хроническое воспаление12,13. Нейтрофилы также модулировать адаптивные иммунные реакции и может регулировать В-клеток и Т-клеток14,15. Существенная нехватка нейтрофилов приводит к смертности или тяжелой иммунодефициту у людей и истощению нейтрофилов у мышей приводит к летальному исходу, в то время как чрезмерная активация или вербовка нейтрофилов в органы вызывает несколько иммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА) и системная эритематоза волчанки (СКВ)6. Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками в синовиальной жидкости пациентов РА. Нейтрофилы производят чрезмерное количество миелопероксидаза (MPO) и нейтрофил эластаза (NE) через деградацию, которая усугубляет эрозию хряща. MPO является ферментом пероксидаза в основном выражается в гранулы нейтрофилов16. NE связан с разрушением суставного хряща17. MPO и NE могут быть использованы для оценки состояния миграции нейтрофилов и инфильтрации в ткани пациентов РА.
Данная статья содержит три традиционных метода оценки миграции нормальных нейтрофилов, индуцированных как в виво, так и in vitro, а также проникновение патологических нейтрофилов в модель воспаления сустава мыши.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Нейтрофилы являются одним из основных членов врожденной иммунной системы и играют ключевую роль в защите хозяина от патогенных микроорганизмов и патологических воспалительных реакций. Нейтрофилы могут быть завербованы в места воспаления с помощью цитокинов и хемокинов. Подавляющее проникновение нейтрофилов может привести к неизбирательному повреждению тканей, например, при ревматоидном артрите (РА). Нейтрофилы, изолированные от перитонеального эксцудата, реагируют на определенный химиоатант, N-формо-Мет-Леу-Пхе (fMLP), in vitro в Трансуэлле или Цигмонде камеры анализов. Эксперимент воздушной сумки может быть использован для оценки химиотаксиса нейтрофилов по отношению к липополисахариду (LPS) in vivo. Адъювантный индуцированный артрит (АА) мышь модель часто используется в исследовании РА, и иммуногистохимическое окрашивание совместных секций с анти-миелопероксидазы (MPO) или антитела антитела антибактериальных антитела антибактериальных антитела митрофилов (NE) является устоявшимся методом для измерения нейтрофил инфильтрации. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных методов лечения, направленных на нейтрофилов миграции.

Перитонеальные эксследуетато-клетки были собраны из лаважной жидкости мышей. Клетки были переложены в 1 мл RPMI-1640 полной среде, слоистых на двухступенчатой (54,8%/70,2%) градиент плотности(рисунок 1А),и центрифуг на 1500 х г в течение 30 мин. Нейтроф?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Здесь мы представляем три метода оценки миграции нейтрофилов и инфильтрации как in vivo, так и in vitro. Эти методы могут быть использованы для обнаружения перспективных терапевтических препаратов, направленных на нейтрофилов миграции.

Обнаружение миграции и проникновения нейтрофилов в мышах

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Этот метод пытается описать три часто используемых метода оценки миграции нормальных нейтрофилов in vivo и in vitro, а также инфильтрации патологических нейтрофилов в модели мышиного артрита. Мы считаем, что этот метод может быть полезен для других исследователей в этой области. Этот протокол содержит методологические детали для оценки миграционной способности нейтрофилов в местах воспаления с помощью анализа воздушного мешка и адъювантного артрита.Последствия этого метода распространяются на артрит терапии, сравнивая модель группы с группой лечения. Этот метод может дать представление о воспалительных заболеваниях и может быть применен к воспалительным заболеваниям кишечника. Демонстрацией процедуры будут Циньи Лу и Хайсю Цзян, аспиранты из нашей лаборатории.После обезболировки мышей на нулевом дне используйте фильтр 0,22 микрона, прикрепленный к пятими миллилитровому шприцу, чтобы получить трехми миллилитрный объем стерилизованного воздуха. Поднимите заднюю кожу обезболивающей мыши пинцетом и подкожно используйте 26 калибровочных 3/8 дюймовых игл для введения трех миллилитров стерилизованного воздуха. После лечения удалите мышей из дыхательного блока и поместите их в хорошо установленную клетку.Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они живы, пока они не начинают двигаться вокруг. На третий день ввимит еще три миллилитров стерилизованного воздуха в ранее установленный воздушный карман для поддержания воздушного мешка. На шестой день ввимим различные процедуры в воздушный мешок.Введать один миллилитр PBS в качестве отрицательного контроля и ввести один миллилитр одного микрограмма на миллилитр LPS в качестве положительного контроля, чтобы вызвать местное воспаление. Через шесть часов пожертвуй мышами. Для каждого воздушного мешка, ввимите один миллилитр буфера мытья для того чтобы помыть мешок воздуха и собрать воспалительный экссудат в пробке центрифуги 15 миллилитров.Затем мыть воздушный мешок с двумя миллилитров мыть буфера в два раза и собирать воспалительные экссудата в той же центрифуге трубки. Центрифуга при 100 раз г в течение 10 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в один миллилитр буфера стирки.Подсчитайте клетки для количественной оценки соотношения нейтрофилов с помощью автоматического гематологического анализатора. Приостановить полный адъювант Фрейнд путем вихревого по крайней мере пять секунд, а затем привлечь 100 микролитров подвески в инжектор инсулина. После анестезии, отметь выбранную лапу и ввись 20 микролитров адъюванта полного Фрейнд от инжектора в четыре периартикулярных пятна на пространстве голеностопного сустава.Поместите обработанных мышей в новую камеру. Мониторинг мышей, чтобы убедиться, что они дышат, пока они не восстановить способность двигаться. Каждые три дня используйте датчик толщины кармана для измерения диаметра голеностопного сустава.Кроме того, оценить тяжесть артрита по критерию оценки артрита. Ноль - это нормально. Никаких признаков эритемы и отеков.Один из них является самым мягким артритом. Эритема и легкий отек ограничивается tarsals или голеностопного сустава. Два - это умеренный артрит.Эритема и легкий отек простирается от лодыжки до tarsals. Три - это тяжелый артрит. Эритема и умеренный отек, простирающийся от лодыжки до плюсневых суставов.Четыре из них является самым тяжелым артритом. Эритема и сильный отек охватывают лодыжки, ноги и цифры, или анкилез конечности. Пожертвовав мышью, удалите кожу и часть мышцы с задней ноги с помощью пинцета и ножниц.Спрей сустава с 70% этанола и удалить остальные мышцы с помощью бумажного полотенца. Исправить голеностопного сустава в 4%paraformaldehyde в течение двух дней при комнатной температуре. Затем decalcify сустава в 10%EDTA в течение одного месяца при комнатной температуре и изменить средний еженедельно.Через месяц поместите ткань в маркированную форму с определенным объемом жидкого парафина при примерно 60 градусах по Цельсию, чтобы встроить ткань. Прохладный кратко. Установите толщину на микротоме на четыре микрометра и нарежьте ломтики.Затем плавать разделы в 43 градусов по Цельсию водяной бане в течение короткого времени, чтобы расширить разделы. Нагрейте секции на слайдах и поставь горки в духовку при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух часов. Для дальнейшего использования, сохранить слайды при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Затем поместите горки в стойку и выполняем стирку в ксилене и этаноле в соответствии с рукописью для регидратации при комнатной температуре. Наконец, мыть в проточной водопроводной воде в течение трех минут. Затем пятно в 0,1%быстрый зеленый раствор в течение пяти минут.Промыть 1%acetic кислоты в течение 10 секунд и пятно в 0,1%Safranin O окрашивания раствор в течение 20 минут. После этого погрузите горки в растворы для мытья ксилена и этанола в соответствии с рукописью. Намонтировать секции тканей на стадии объекта и наблюдать ткани под микроскопом.Чтобы визуализировать нейтрофилов, выполните иммуногистохимическое окрашивание, сначала выпекая парафиновые секции в течение двух часов при 78 градусах по Цельсию. Поместите горки в стойку и выполните ксилен, этанол, воду и PBS моет в соответствии с рукописью для регидратации при комнатной температуре. Затем добавьте одну каплю буфера пермяки, чтобы покрыть ткань.Инкубировать секции в подносе, контролируемом влажностью, при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. После этого, промыть слайды в PBS в течение трех минут три раза. Избегайте полоскания ткани напрямую.Далее выполните поиск антигенного эпитопа, вызванного теплом. Упорядочить слайды в стойке. Погрузите слайды в котел давления, наполненный буфером поиска.Положите котел давления в микроволновую печь и установите микроволновую печь на 600 Вт и нагревать горки в течение 10 минут. После кипячения держите горки в котле, чтобы остыть до 90 градусов по Цельсию. Вынуть горки и промыть их в PBS в течение трех минут три раза.Чтобы утолить эндогенную активность пероксидазы, погрузите горки в свежеприготовленные 3%перекиси водорода при комнатной температуре в течение 15 минут. Промыть слайды в PBS в течение трех минут три раза. Очертить большой круг вокруг образца с гидрофобной ручкой.Избегайте прикосновения к образцу. Добавить в образец от 50 до 100 микролитров 3%бычьего альбумин сыворотки, чтобы заблокировать и поместить образцы в камеру, контролируемую влажностью при 37 градусах по Цельсию в течение 60 минут. Затем удалите блокирующий раствор.Добавить 50 микролитров PBS разбавленных первичных антител к каждому разделу быстро. Инкубировать слайды в влажности контролируемых лоток при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На второй день вынул лоток и дайте ему стоять при комнатной температуре в течение 30 минут.Затем промыть горки в PBS в течение трех минут три раза. Добавьте 50 микролитров PBS разбавленных вторичных антител к тканям. Инкубировать слайды в подносе, контролируемом влажностью, при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.Затем промыть горки в PBS в течение трех минут три раза. Разработать в разбавленном растворе DAB в течение пяти минут. Избегайте развития темного цвета, вызванного чрезмерной реакцией DAB.Промыть горки в дистиллированной воде. Counterstain слайды в гематоксилин в течение 10 секунд и промыть горки в водопроводной воде в течение пяти минут. Промыть кислотным спиртом супер быстрый раствор дифференциации в течение трех секунд, затем промыть в водопроводной воде в течение 10 минут.Погрузите горки в этанол и ксилен моет при комнатной температуре в соответствии с рукописью. Исправить крышку с монтажом раствора. Наблюдайте за тканью под микроскопом.В этом исследовании были проведены эксперименты с воздушными мешками для исследования набора нейтрофилов, стимулируемого LPS in vivo. Подмножества лейкоцитов в экссудах воздушного мешка были намного выше, чем в контроле. По сравнению с контрольной группой, адъювант-индуцированной группы артрита показали значительный отек в лапе.Диаметр голеностопного сустава увеличился, и оценка артрита постоянно поднималась. Повреждение хряща является репрезентативным синдромом ревматоидного артрита. CFA задача индуцированных большое количество инфильтрации лейкоцитов, значительные эрозии хряща, и синовиальной гиперплазии.MPO в любых уровнях выражения являются репрезентативными маркерами проникновения нейтрофилов, которые были значительно upregulated в совместном разделе. Убедитесь, что воздух вводится в кожу, но не в мышцу. Мы также можем исследовать формирование нейтрофилов внеклеточных ловушек путем иммуногистохимического окрашивания секций тканей голеностопного сустава с анти-p84 или Эти методы могут быть использованы для изучения других воспалительных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Обнаружение соматических генетических изменений в опухолевых образцов экзоном улавливания и Massively Parallel Секвенирование

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Пептид40 MUB для использования в обнаружении нейтрофилов опосредованной воспаление события

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Обнаружение и характеристика белка самосборки в Vivo по потоку цитометрии

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Обнаружение создания общего кровоснабжения у парабиотических мышей путем инъекции глюкозы Caudal Vein

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Экономически эффективный и адаптируемый анализ миграции царапин

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Выделение нейтрофилов человека из цельной крови и пальто Баффи

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...