Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81430099 y 31500704), Proyectos de Cooperación Internacional e Intercambio (número de subvención 2014DFA32950), y el programa de investigación de la Universidad de Medicina China de Beijing ( números de subvención BUCM-2019-JCRC006 y 2019-JYB-TD013).

Todos los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina China de Beijing.
NOTA: Se utilizaron ratones C57BL/6 (7-8 semanas de edad).
1. Aislamiento de neutrófilos
<ol><li>Adquisición de células de exudado peritoneal<ol>
<li>Preparar una solución fresca de peptona proteosa al 10% en ddH2O. Calcular el volumen necesario según el número de ratones. NOTA: Estable...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. 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J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Los protocolos detallados de neutrófilos altamente purificados de sangre periférica7, médula ósea y tejidos18 han estado disponibles durante mucho tiempo. Aquí adoptamos un método de aislar a los neutrófilos del líquido peritoneal19 en el que los neutrófilos maduros permanecen inactivados para estudios antiinflamatorios y antioxidantes adicionales.
Usamos el experimento de la bolsa de aire para explorar la infiltr...

Los neutrófilos son los glóbulos blancos más abundantes y representan entre el 50 y el 70% de toda la población de glóbulos blancos en humanos1. Los neutrófilos son uno de los principales respondedores durante la inflamación aguda. Los neutrófilos pueden ser reclutados en sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas liberadas por células residentes entejidos 2,3,4, que está mediada por las interacciones entre las moléculas de adhesión celular en la superficie de los neutrófilos y las células de endotelio vascular5. Los neutrófilos son fundamentales para albergar defensa y desempeñar un papel en las reacciones inflamatorias patológicas debido a su poderosa capacidad para dañar el tejido a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas dañinas para el tejido3,6.
Estudios anteriores han descrito varios protocolos de aislamiento de neutrófilos de ratones o humanos. Oh y otros demostraron un método de separación de gradiente de densidad para aislar a los neutrófilos humanos de toda la sangre humana7. Sin embargo, el aislamiento de suficientes neutrófilos de la sangre del ratón es difícil debido al pequeño volumen sanguíneo. Alternativamente, un gran número de neutrófilos de ratón puros y viables pueden ser obtenidos del fluido peritoneal del ratón, y estos neutrófilos purificados se pueden utilizar ex vivo para examinar varios aspectos de las funciones celulares ex vivo, incluyendo la infiltración de neutrófilos, migración, quimiotaxis, ráfaga oxidativa, citoquina y trampa extracelular de neutrófilos (NET) producción8. Ensayos Transwell9 o ensayos de cámara Zigmond10,11 se pueden utilizar para evaluar la migración de neutrófilos in vitro. El modelo de bolsa de aire se utiliza para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos in vivo. El modelo de bolsa de aire subcutánea es un modelo animal in vivo conveniente para estudiar la migración de células inflamatorias.
Tradicionalmente, los neutrófilos eran considerados como eliminadores de patógenos en fases agudas de la inflamación. Sin embargo, los hallazgos recientes han demostrado que los neutrófilos son células complicadas que realizan una variedad significativa de funciones especializadas. Los neutrófilos pueden regular muchos procesos tales como lesión aguda y reparación, tumorigenesis, respuesta autoinmune, e inflamación crónica12,13. Los neutrófilos también modulan las respuestas inmunitarias adaptativas y pueden regular las células B y las células T14,15. La escasez sustancial de neutrófilos provoca mortalidad o inmunodeficiencia grave en humanos y el agotamiento de los neutrófilos en ratones conduce a la mortalidad, mientras que la activación o el reclutamiento excesivos de neutrófilos en los órganos provoca nifa tras las enfermedades inmunitarias, como la artritis reumatoide (AR) y el lupus eritematoso sistémico (LES)6. Los neutrófilos son las células más abundantes en el líquido sinovial de los pacientes con AR. Los neutrófilos producen cantidades excesivas de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) a través de la degradación, que exacerba la erosión del cartílago. LA MPO es una enzima peroxidasa expresada principalmente en los gránulos de los neutrófilos16. NE se asocia con la destrucción del cartílago articular17. MPO y NE podrían utilizarse para evaluar el estado de la migración de neutrófilos y la infiltración en el tejido de los pacientes con AR.
Este artículo proporciona tres métodos convencionales para evaluar la migración de neutrófilos normales inducidos in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en un modelo de inflamación específica de la articulación del ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Los neutrófilos son un miembro importante del sistema inmunitario innato y desempeñan un papel fundamental en la defensa del huésped contra patógenos y reacciones inflamatorias patológicas. Los neutrófilos pueden ser reclutados a sitios de inflamación a través de la guía de citoquinas y quimioquinas. La infiltración abrumadora de neutrófilos puede provocar daño indiscriminado a los tejidos, como en la artritis reumatoide (AR). Neutrófilos aislados del exudado peritoneal responden a un quimioatraer definido, N-formilo-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro en los ensayos de cámara Transwell o Zigmond. El experimento de la bolsa de aire se puede utilizar para evaluar la quimiotaxis de los neutrófilos hacia el lipopolisacárido (LPS) in vivo. El modelo de ratón de artritis inducida por adyuvantes (AA) se utiliza con frecuencia en la investigación de RA, y la tinción inmunohistoquímica de secciones articulares con anticuerpos antimieloperoxidasa (MPO) o antineutrófilos elastasa (NE) es un método bien establecido para medir infiltración de neutrófilos. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Las células de exudado peritoneal se recogieron del líquido de lavado de ratones. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio completo RPMI-1640, en capas en dos pasos (54,8%/70,2%) gradiente de densidad discontinua(Figura 1A) y centrifugado a 1.500 x g para 30 min. Los neutrófilos (95%, 1 x 107 neutrófilos/ratón) se recuperaron de la interfaz inferior(Figura 1B)....

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Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Este método trata de describir tres métodos utilizados con frecuencia para evaluar la migración de neutrófilos normales in vivo e in vitro, así como la infiltración de neutrófilos patológicos en el modelo de artritis del ratón. Creemos que este método podría ser útil para otros investigadores en este campo. Este protocolo contiene los detalles metodológicos para evaluar la capacidad de migración de los neutrófilos en los sitios de inflamación mediante el uso de ensayo de bolsa de aire y artritis inducida por adyuvante.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de artritis comparando el grupo modelo con el grupo de tratamiento. Este método podría proporcionar información sobre la enfermedad inflamatoria y se puede aplicar a la enfermedad inflamatoria intestinal. Demostrando el procedimiento serán Qingyi Lu y Haixu Jiang, estudiantes de posgrado de nuestro laboratorio.Después de la anestesia de los ratones en el día cero, utilice un filtro de 0,22 micras unido a una jeringa de cinco mililitros para obtener un volumen de tres mililitros de aire esterilizado. Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas y utilice por vía subcutánea una aguja de calibre 26 por 3/8 pulgadas para inyectar tres mililitros del aire esterilizado. Después del tratamiento, retire los ratones de la unidad respiratoria y colóquelos en una jaula bien establecida.Monitoree a los ratones para asegurarse de que están vivos hasta que empiecen a moverse. En el tercer día, inyecte tres mililitros adicionales de aire esterilizado en la bolsa de aire previamente establecida para sostener la bolsa de aire. En el sexto día, inyecte diferentes tratamientos en la bolsa de aire.Inyectar un mililitro de PBS como control negativo e inyectar un mililitro de un microgramo por mililitro de LPS como control positivo para inducir la inflamación local. Después de seis horas, sacrifica a los ratones. Para cada bolsa de aire, inyecte un mililitro de tampón de lavado para lavar la bolsa de aire y recoger el exudado inflamatorio en un tubo centrífugo de 15 mililitros.A continuación, lave la bolsa de aire con dos mililitros de tampón de lavado dos veces y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo centrífugo. Centrifugar a 100 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en un mililitro de tampón de lavado.Cuente las células para cuantificar la relación de neutrófilos utilizando el analizador automático de hematología. Suspenda el adyuvante completo de Freund vórtice al menos cinco segundos y, a continuación, extraiga 100 microlitros de suspensión en un inyector de insulina. Después de anestesiar, marque la pata elegida e inyecte 20 microlitros del adyuvante completo de Freund desde el inyector en cuatro puntos periarticulares en el espacio de la articulación del tobillo.Ponga los ratones procesados en la nueva cámara. Monitoree a los ratones para asegurarse de que están respirando hasta que recuperen la capacidad de moverse. Cada tres días, utilice un medidor de espesor de bolsillo para medir el diámetro de la articulación del tobillo.Además, evalúe la gravedad de la artritis por criterio de puntuación de artritis. Cero es normal. No hay evidencia de eritema e hinchazón.Una es la artritis más leve. Eritema e hinchazón leve confinada a los tarsales o a la articulación del tobillo. Dos es la artritis moderada.Eritema e hinchazón leve que se extiende desde el tobillo hasta los tarsales. Tres es la artritis grave. Eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo hasta las articulaciones metatarsas.Cuatro es la artritis más grave. El eritema y la hinchazón grave abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad. Después de sacrificar el ratón, retire la piel y parte del músculo de la pata trasera con pinzas y tijeras.Rocíe la articulación con 70%etanol y retire el resto de los músculos con una toalla de papel. Fijar la articulación del tobillo en 4%paraformaldehído durante dos días a temperatura ambiente. A continuación, descalcificar la articulación en 10%EDTA durante un mes a temperatura ambiente y cambiar el medio semanalmente.Después de un mes, coloque el tejido en un molde marcado con cierto volumen de parafina líquida a aproximadamente 60 grados Celsius para incrustar el tejido. Genial brevemente. Ajuste el grosor del microtoma a cuatro micrómetros y corte las rodajas.A continuación, flotar las secciones en un baño de agua Celsius de 43 grados durante un corto tiempo para ampliar las secciones. Montar las secciones en los portaobjetos y poner los portaobjetos en el horno a 70 grados Celsius durante dos horas. Para uso futuro, conserve los portaobjetos a menos 20 grados Centígrados.A continuación, coloque los portaobjetos en un estante y realice lavados en xileno y etanol de acuerdo con el manuscrito para rehidratar a temperatura ambiente. Por último, lave en agua corriente del grifo durante tres minutos. A continuación, manche en una solución verde 0,1% rápida durante cinco minutos.Enjuagar en 1%ácido acético durante 10 segundos y manchar en 0.1%Solución de tinción de Safranin O durante 20 minutos. Después de eso, sumerja las diapositivas en las soluciones de lavado de xileno y etanol según el manuscrito. Monte las secciones de tejido en la etapa del objeto y observe los tejidos bajo un microscopio.Para visualizar los neutrófilos, realice tinciones inmunohistoquímicas horneando primero las secciones de parafina durante dos horas a 78 grados centígrados. Coloque los portaobjetos en un estante y realice los lavados de xileno, etanol, agua y PBS de acuerdo con el manuscrito para rehidratar a temperatura ambiente. Luego agregue una gota de tamplismo de permeabilización para cubrir el tejido.Incubar las secciones en una bandeja controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de eso, enjuague los portaobjetos en PBS durante tres minutos tres veces. Evite enjuagar el tejido directamente.A continuación, realice la recuperación de epítopos de antígenos inducidos por el calor. Coloque las diapositivas en un bastidor. Sumerja los portaobjetos en la caldera de presión llena de búfer de recuperación.Coloque la caldera de presión en el horno microondas y coloque el horno microondas a 600 vatios y caliente los portaobjetos durante 10 minutos. Después de hervir, mantenga los portaobjetos en la caldera para enfriar a 90 grados Celsius. Saque los portaobjetos y enjuáguelos en PBS durante tres minutos tres veces.Para apagar la actividad de peroxidasa endógena, sumerja los portaobjetos en peróxido de hidrógeno 3% recién preparado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Enjuague los portaobjetos en PBS durante tres minutos tres veces. Esboza un gran círculo alrededor de la muestra con una pluma hidrófoba.Evite tocar la muestra. Añadir en la muestra de 50 a 100 microlitros de albúmina sérica 3%bovina para bloquear y colocar las muestras en una cámara controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 60 minutos. A continuación, quite la solución de bloqueo.Añadir 50 microlitros de anticuerpo primario diluido PBS a cada sección rápidamente. Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a cuatro grados centígrados durante la noche. En el segundo día, saque la bandeja y déjela reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, enjuague los portaobjetos en PBS tres minutos tres veces. Añadir 50 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos por PBS a los tejidos. Incubar los portaobjetos en una bandeja controlada por humedad a 37 grados centígrados durante 30 minutos.A continuación, enjuague los portaobjetos en PBS tres minutos tres veces. Desarrollar en solución DAB diluida durante cinco minutos. Evitar el desarrollo de un color oscuro causado por la sobrerreacción del DAB.Enjuague los portaobjetos con agua destilada. Contrate los portaobjetos en hematoxilina durante 10 segundos y enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante cinco minutos. Enjuagar en alcohol ácido solución de diferenciación súper rápida durante tres segundos, luego enjuague en agua del grifo durante 10 minutos.Sumerja las diapositivas en los lavados de etanol y xileno a temperatura ambiente según el manuscrito. Fije el cubreobjetos con la solución de montaje. Observe el tejido bajo un microscopio.En este estudio, se realizaron experimentos de bolsas de aire para investigar el reclutamiento de neutrófilos estimulado por LPS in vivo. Los subconjuntos de leucocitos en los exudados de la bolsa de aire eran mucho más altos que en el control. En comparación con el grupo de control, el grupo de artritis inducida por adyuvante mostró un edema significativo en la pata.El diámetro de la articulación del tobillo aumentó y la puntuación de la artritis aumentó constantemente. El daño del cartílago es el síndrome representativo de la artritis reumatoide. El desafío de CFA indujo una gran cantidad de infiltración de leucocitos, erosión significativa del cartílago e hiperplasia sinovial.MPO en cualquier nivel de expresión son marcadores representativos de infiltración de neutrófilos que fueron significativamente regulados en la sección conjunta. Asegúrese de que el aire se inyecta en la piel, pero no en el músculo. También podemos investigar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos mediante tinción inmunohistoquímica de las secciones del tejido articular del tobillo con anti-p84 o Estos métodos se pueden utilizar para estudiar otras enfermedades inflamatorias como la enfermedad inflamatoria intestinal.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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