Name: detecting migration and infiltration of neutrophils in mice
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 81430099 och 31500704), International Cooperation and Exchange Projects (bidragsnummer 2014DFA32950) och forskningsprogrammet för Beijing University of Chinese Medicine ( bidragBUCM-2019-JCRC006 och 2019-JYB-TD013).

Alla experimentella förfaranden granskades och godkändes av Beijing University of Chinese Medicine Animal Care and Use Committee.
OBS: C57BL/6 möss (7-8 veckor) användes.
1. Neutrofil isolering
<ol><li>Förvärv av peritonealexsudat celler<ol>
<li>Förbered färsk 10% proteose pepton lösning i ddH2O. Beräkna den volym som behövs enligt antalet möss. OBS: Ställ in antalet möss som N, (2N+1) mL av lösning måste lösas upp och filtreras i f?...

<ol>
	<li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia:+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes.">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Coutts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Neutrophil+Chemotaxis.">Analysis of Neutrophil Chemotaxis.</a> Adhesion Protein Protocols. , 23-35 (2007).</li><li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Recruitment:+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns.">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li><li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+balancing+act+of+neutrophils.">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host &amp; Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li><li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases.">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li><li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophils+in+auto-immunity.">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745 (2008).</li><li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+transendothelial+migration:+updates+and+new+perspectives.">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li><li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology.">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309 (2010).</li><li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay.">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330 (2012).</li><li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neutrophil's+Role+During+Health+and+Disease.">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+New+insights+and+open+questions.">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579 (2018).</li><li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses.">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li><li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen.">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li><li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase:+A+new+player+in+autoimmunity.">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li><li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis.">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li><li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li><li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Neutrophils.">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li><li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis.">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities.">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li><li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+aspects+of+leukocyte+migration.">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment.">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97 (2019).</li></ol>

Detaljerade protokoll av mycket renade neutrofiler från perifert blod7,benmärg och vävnader18 har funnits under lång tid. Här antar vi en metod för att isolera neutrofiler från peritoneal vätska19 där mogna neutrofiler förblir inaktiverade för ytterligare antiinflammatoriska och antioxidant studier.
Vi använde luftpåsen experimentet för att utforska LPS-inducerad infiltration av neutrofiler in vivo. Denna met...

Neutrofiler är de mest rikliga vita blodkropparna och står för 50−70% av hela vita blodkroppar befolkningen hos människor1. Neutrofiler är en av de primära responders under akut inflammation. Neutrofiler kan rekryteras till inflammationsplatser via vägledning av cytokiner och kemokineser som frigörs avvävnadsbosattaceller2,3,4, som förmedlas av interaktionermellan cellviddhesionsmolekyler på ytan av neutrofiler och kärlendotelceller5. Neutrofiler är grundläggande för att vara värd för försvar och spela en roll i patologiskt inflammatoriska reaktioner på grund av deras kraftfulla förmåga att skada vävnad genom utsläpp av reaktiva syrearter (ROS) och andra vävnadsskadliga molekyler3,6.
Tidigare studier har beskrivit flera neutrofilisoleringprotokoll från möss eller människor. Oh et al. visade en densitet gradient separation metod för att isolera mänskliga neutrofiler från hela mänskligt blod7. Isoleringen av tillräckligt med neutrofiler från musblod är dock svår på grund av den lilla blodvolymen. Alternativt kan ett stort antal rena och livskraftiga musneutrofiler framkallas från musperitoneal vätska, och dessa renade neutrofiler kan användas ex vivo för att undersöka flera aspekter av cellulära funktioner ex vivo, inklusive neutrofil infiltration, migration, chemotaxis, oxidativ burst, cytokin och neutrofil extracellulära fälla (NET) produktion8. Transwell assays9 eller Zigmond kammare assays10,11 kan användas för att utvärdera neutrophil migration in vitro. Luftpåsemodellen används för att utvärdera migration och infiltration av neutrofiler in vivo. Den subkutana luftpåsmodellen är en bekväm in vivo djurmodell för att studera migration av inflammatoriska celler.
Traditionellt ansågs neutrofiler som patogeneliminatorer i akuta faser av inflammation. De senaste rönen har dock visat att neutrofiler är komplicerade celler som utför en betydande mängd specialiserade funktioner. Neutrofiler kan reglera många processer såsom akut skada och reparation, tumorigenesis, autoimmun reaktion, och kronisk inflammation12,13. Neutrofiler modulerar också adaptiva immunsvar och kan reglera B-celler och T-celler14,15. Betydande brist på neutrofiler leder till dödlighet eller allvarlig immunbrist hos människor och neutrofil utarmning hos möss leder till dödsfall, medan överdriven aktivering eller rekrytering av neutrofiler i organ orsakar flera immunsjukdomar, såsom reumatoid artrit (RA) och systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Neutrofiler är de mest rikliga cellerna i RA-patienternas synovialvätska. Neutrofiler producerar stora mängder myeloperoxidas (MPO) och neutrofilelastas (NE) via nedbrytning, vilket förvärrar broskerosion. MPO är ett peroxidasenzym huvudsakligen uttryckt i granulat av neutrofiler16. NE är associerad med artikulär brosk förstörelse17. MPO och NE skulle kunna användas för att utvärdera status en neutrofil migration och infiltration i vävnaden av RA patienter.
Denna artikel ger tre konventionella metoder för att utvärdera migrationen av normala neutrofiler inducerad både in vivo och in vitro, samt infiltration av patologiska neutrofiler i en mus led-specifik inflammation modell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Fast Green Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348b</td>
			<td>Transfer 20 mg of fast grene FCF in one vial into another 100 mL beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% fast green solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Safranin O Staining Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>8348a</td>
			<td>Transfer 20 mg of safranin O stain in one vial into a 100 ml beaker. Add 20 mL of H2O into the beaker and dissolve the stain by stirring to make 0.1% safranin O staining solution, and filter it using a Nalgene PES 75mm filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324506</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Methanol</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G x 1 1/4&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 3/8&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 0.3 g BSA in 10 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL 30% H2O2 with methanol with 9 mL methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) kit</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2&#34; Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z683574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 500 mL 100% ethanol with 500 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>54.8% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70.2% Percoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&#215;PBS, stand still</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 800 mL 100% ethanol with 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 950 mL 100% ethanol with 50 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Alcohol Superfast Differentiation Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0165S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab208670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Hematology Analyzer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>XS-800i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#39;s Adjuvant, 10 mg/ml</td>
			<td>sigma</td>
			<td>1002036152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dial Thickness Gauge</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microtubes, 1.5 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (FBS) Premium</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P30-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia System</td>
			<td>ZS Dichuang</td>
			<td>ZS-MV-IV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>PPLYGEN</td>
			<td>C1309</td>
			<td>This is the secondary antibody used in the immunohistochemical staining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td>
			<td>02-016-1A</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZLI-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Safranin O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100&#215;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1514022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10245207</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 100 &#956;L Triton X-100 with 1 L dH2O to get 0.01% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 1&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% ddH2O with 10% (v/v) 10&#215;PBS, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS), 10&#215;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 16 g NaCl, 0.4 g KCl, 2.88 g Na2HPO4&#183;2H2O, 0.48 g KH2PO4 (anhydrous) in 200 mL ddH2O, adjust pH 7.4, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWDER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>1865317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 18 mL retrieval buffer A with 82 mL retrieval buffer B, add dH2O to 1000 mL, adjust pH to 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer A Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 4.2 g citric acid (C6H5O7&#183;H2O) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retrieval Buffer B Stock for IHC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 5.88 g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7&#183;2H20) in 200 mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Complete Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI-1640 medium is supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shu Rui U40 Disposable Sterile Insulin Injection Needle 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>CITOGLAS</td>
			<td>10127105P-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLUTION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock Isotonic Percoll (SIP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 90% (v/v) of percoll with 10% (v/v) 10&#215;PBS, stand still for 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer in Air Pouch Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 0.5M EDTA to 10mM with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Beijing Chemical Works</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting migration and infiltration of neutrophils in mice

Neutrofiler är en viktig medlem av det medfödda immunsystemet och spelar nyckelroller i värdförsvaret mot patogener och patologiskt inflammatoriska reaktioner. Neutrofiler kan rekryteras till inflammationsplatser via vägledning av cytokiner och kemokiner. Överväldigande infiltration av neutrofiler kan leda till urskillningslösa vävnadsskador, såsom vid reumatoid artrit (RA). Neutrofiler isolerade från peritoneal exsudat svara på en definierad chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro i Transwell eller Zigmond kammare analyser. Luftpåseexperimentet kan användas för att utvärdera neutrofilernas chemotlax mot lipopolysackarider (LPS) in vivo. Den adjuvant-inducerad artrit (AA) mus modell används ofta i RA forskning, och immunohistochemical färgning av gemensamma sektioner med anti-myeloperoxidas (MPO) eller anti-neutrofil elastas (NE) antikroppar är en väletablerad metod för att mäta neutrofil infiltration. Dessa metoder kan användas för att upptäcka lovande terapier som riktar sig till neutrofilmigration.

Peritoneal exsudat celler samlades in från lavage vätska av möss. Cellerna avbröts i 1 ml RPMI-1640 komplett medium, skiktat på ett tvåstegs (54,8%/70,2%) diskontinuerlig densitetgradient(figur 1A)och centrifugeras vid 1 500 x g i 30 min. Neutrofiler (≥95%, ~1 x 107 neutrofiler/mus) återfanns från det nedre gränssnittet(figur 1B).
<p class="jove_content" fo:keep...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice at JoVE.com

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Här presenterar vi tre metoder för att bedöma neutrofil migration och infiltration både in vivo och in vitro. Dessa metoder kan användas för att upptäcka lovande therapeutics inriktning neutrofil migration.

Upptäcka migration och infiltration av neutrofiler hos möss

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Denna metod försöker beskriva tre ofta använda metoder för att utvärdera migrationen av normala neutrofiler in vivo och in vitro samt infiltration av patologiska neutrofiler i musartrit modell. Vi tror att denna metod kan vara användbar för andra forskare inom detta område. Detta protokoll innehåller metodologiska detaljer för att utvärdera migrationskapaciteten hos neutrofiler i inflammationsställena genom att använda luftpåseanalys och adjuvant-inducerad artrit.Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot artrit terapi genom att jämföra modellgruppen med behandlingsgruppen. Denna metod kan ge insikt i inflammatorisk sjukdom och kan tillämpas på inflammatorisk tarmsjukdom. Demonstrera förfarandet kommer att Qingyi Lu och Haixu Jiang, efter examen studenter från vårt labb.Efter anesthetisering av mössen på dag noll, använd ett 0,22 mikronfilter fäst på en fem milliliter spruta för att få en tre milliliter volym steriliserad luft. Lyft ryggen huden på den sövda musen med pincett och subkutant använda en 26 gauge med 3/8 tums nål för att injicera tre milliliter av den steriliserade luften. Efter behandlingen, ta bort mössen från andningsenheten och placera dem i en väl inställd bur.Övervaka mössen för att säkerställa att de lever tills de börjar röra sig. På dag tre, injicera ytterligare tre milliliter steriliserad luft i den tidigare etablerade luftfickan för att upprätthålla luftpåsen. På dag sex injicerar du olika behandlingar i luftpåsen.Injicera en milliliter PBS som en negativ kontroll och injicera en milliliter av ett mikrogram per milliliter LPS som den positiva kontrollen för att framkalla lokal inflammation. Efter sex timmar, offra mössen. För varje luftpåse, injicera en milliliter tvättbuffert för att tvätta luftpåsen och samla upp det inflammatoriska exsudatet i ett 15 milliliter centrifugrör.Tvätta sedan luftpungen med två milliliter tvättbuffert två gånger och samla upp det inflammatoriska exsudatet i samma centrifugrör. Centrifug vid 100 gånger g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i en milliliter av tvätt buffert.Räkna cellerna för att kvantifiera neutrofil förhållandet med hjälp av den automatiska hematologianalysatorn. Suspend komplett Freund s adjuvans genom att virvelning minst fem sekunder, sedan dra 100 mikroliter suspension i en insulininjektor. Efter anesthetizing, markera den valda tassen och injicera 20 mikroliter av komplett Freunds adjuvans från injektorn i fyra periartikulära fläckar på fotleden utrymmet.Sätt de bearbetade mössen i den nya kammaren. Övervaka mössen för att säkerställa att de andas tills de återfår förmågan att röra sig. Var tredje dag, använd en tjockleksmätare för ficka för att mäta fotledens gemensamma diameter.Också, bedöma artrit svårighetsgraden av artrit poängkriterium. Noll är normalt. Inga tecken på hudtem och svullnad.En är den mildaste artrit. Erytem och mild svullnad begränsad till hasleden eller fotleden. Två är den måttliga artrit.Erytem och mild svullnad sträcker sig från fotleden till haslederna. Tre är den svåra artrit. Erytem och måttlig svullnad sträcker sig från fotleden till mellanfot lederna.Fyra är den svåraste artrit. Erytem och svår svullnad omfattar fotled, fot, och siffror, eller ankylosis av extremiteten. Efter att ha offra musen, ta bort huden och en del av muskeln från bakbenet med pincett och sax.Spraya leden med 70%etanol och ta bort resten av musklerna med hjälp av en pappershandduk. Fixera fotleden i 4%paraformaldehyd i två dagar i rumstemperatur. Sedan avkalcify fogen i 10%EDTA för en månad vid rumstemperatur och ändra medium varje vecka.Efter en månad, placera vävnaden i en markerad mögel med viss volym av flytande paraffin vid cirka 60 grader Celsius för att bädda in vävnaden. Cool kort. Ställ in tjockleken på mikrotomen vid fyra mikrometer och skär skivor.Sedan flyta sektionerna i en 43 grader Celsius vattenbad för en kort tid att expandera sektionerna. Montera sektionerna på diabilder och sätt bilderna i ugnen på 70 grader Celsius i två timmar. För framtida användning, bevara diabilderna vid minus 20 grader Celsius.Därefter placerar du objektglasen i ett rack och utför tvättar i xylen och etanol enligt manuskriptet för att rehydrera vid rumstemperatur. Slutligen, tvätta i rinnande kranvatten i tre minuter. Fläck sedan i 0,1%snabb grön lösning i fem minuter.Skölj i 1%ättiksyra i 10 sekunder och fläcka in 0,1%Safranin O färgningslösning i 20 minuter. Därefter sänk du ned objektglasen i xylen- och etanoltvättlösningarna enligt manuskriptet. Montera vävnadssektionerna på objektstadiet och observera vävnaderna under ett mikroskop.För att visualisera neutrofiler, utför immunohistochemical färgning genom att först baka paraffinsektionerna i två timmar vid 78 grader Celsius. Placera diabilderna i ett rack och utför xylen, etanol, vatten och PBS tvättar enligt manuskriptet för att rehydrera vid rumstemperatur. Lägg sedan till en droppe permeabiliseringsbuffert för att täcka vävnaden.Inkubera sektionerna i en fuktighetskontrollerad bricka vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Därefter sköljer du objektglasen i PBS i tre minuter tre gånger. Undvik att skölja vävnaden direkt.Därefter utför värme-inducerad antigen epitope hämtning. Ordna bilderna i ett rack. Sänk ner objektglasen i tryckpannan fylld med hämtningsbuffert.Sätt tryckpannan i mikrovågsugnen och ställ mikrovågsugnen på 600 watt och värm rutschkanorna i 10 minuter. Efter kokning, hålla bilderna i pannan för att svalna till 90 grader Celsius. Ta ut objektglasen och skölj dem i PBS i tre minuter tre gånger.För att släcka endogen peroxidasaktivitet, sänk ned objektglasen i nyberedd 3%väteperoxid vid rumstemperatur i 15 minuter. Skölj diabilder i PBS i tre minuter tre gånger. Skissera en stor cirkel runt provet med en hydrofoba penna.Undvik att röra provet. Lägg till provet 50 till 100 mikroliter av 3%bovint serumalbumin för att blockera och placera proverna i en fuktighetskontrollerad kammare vid 37 grader Celsius i 60 minuter. Ta sedan bort blockeringslösningen.Tillsätt 50 mikroliter pbs utspädd primär antikropp till varje sektion snabbt. Inkubera rutorna i en fuktighetskontrollerad bricka vid fyra grader Celsius över natten. På den andra dagen, ta ut facket och låt den stå i rumstemperatur i 30 minuter.Skölj sedan objektglasen i PBS i tre minuter tre gånger. Tillsätt 50 mikroliter pbs utspädda sekundära antikroppar mot vävnaderna. Inkubera glider i en luftfuktighet kontrollerad bricka vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Skölj sedan objektglasen i PBS i tre minuter tre gånger. Utveckla i utspädd DAB-lösning i fem minuter. Undvik utvecklingen av en mörk färg som orsakas av överreaktion av DAB.Skölj objektglasen i destillerat vatten. Räknar ut rutschkanorna i hematoxylin i 10 sekunder och skölj av rutschkanorna i kranvatten i fem minuter. Skölj i syra alkohol supersnabb differentieringslösning i tre sekunder, skölj sedan i kranvatten i 10 minuter.Sänk ned objektglasen i etanol- och xylentvättarna i rumstemperatur enligt manuskriptet. Fixera täcket med monteringslösning. Observera vävnaden under mikroskop.I denna studie utfördes luftpåse experiment för att undersöka neutrofil rekrytering stimuleras av LPS in vivo. Leukocyte underuppsättningar i luften pouch exsudat var mycket högre än i kontrollen. Jämfört med kontrollgruppen visade gruppen adjuvant-inducerad artrit signifikant ödem i tassen.Fotleden gemensamma diameter ökade och artrit poängen steg konsekvent. Broskskador är det representativa syndromet av reumatoid artrit. CFA utmaning framkallat en stor mängd leukocyte infiltration, betydande brosk erosion och synovial hyperplasi.MPO i något uttryck nivåer är representativa markörer för neutrofil infiltration som var betydligt upregulated i ledsektionen. Se till att luften injiceras i huden, men inte i muskeln. Vi kan också undersöka bildandet av neutrofil extracellulära fällor genom immunohistokemiska färgning av fotleden gemensamma vävnad sektioner med anti-p84 eller Dessa metoder kan användas för att studera andra inflammatoriska sjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioaktivt In situ Hybridisering för Upptäcka Diverse Mönster genuttryck i Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Upptäcka Somatiska genetiska förändringar i tumörprover från Exon Capture och Massively Parallel sekvense

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration och Invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

SNAJDARN240 peptiden för användning i att upptäcka neutrofiler-medierad Inflammation händelser

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Att detektera och karakterisera proteiners självmontering in vivo med flödescytometri

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Upptäcka etablering av delad blodtillförsel i parabiotiska möss av Caudal Vein Glukos Injektion

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

En kostnadseffektiv och anpassningsbar Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Isolering av mänskliga neutrofiler från helblod och buffyrockar

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...