Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بتمويل من قسم ويليام ج. لوري للهندسة الكيميائية والجزيئية الحيوية ومركز السرطان الشامل في جامعة ولاية أوهايو. جاءت البيانات الواردة في هذا التقرير من الصور التي تمت معالجتها باستخدام Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) المتاحة في مرفق المجهر والتصوير في الحرم الجامعي ، جامعة ولاية أوهايو. ويدعم هذا المرفق جزئيا من قبل منحة P30 CA016058، المعهد الوطني للسرطان، Bethesda، دكتوراه في الطب.

ويعترف المؤلفون بالمتطوعين الأصحاء الذين تكرموا بالتبرع بدمائهم. تم الحصول على عينات الدم بعد موافقة المتطوعين المستنيرة وفقا لبروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) #2018H0268 استعرضت من قبل لجنة العلوم الطبية الحيوية في جامعة ولاية أوهايو.
1. microfabrication من الجسيمات الدقيقة الحيوي?...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

قمنا بتطوير منصة الختم الدقيق لتوليد صفائف موحدة من الجسيمات الحيوية لتحفيز في المختبر العدلات يحتشدون. طبيعة المختبر من منصتنا يسمح لنا للتحايل على المضاعفات التي تنشأ مع في التجارب يحتشدون في الجسم الحي، وهي ضعف القدرة على تحليل الوسطاء الصادرة عن العدلات يحتشدون5. بالإضا?...

العدلات، وخلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة في مجرى الدم1،تكتسب الاهتمام كأهداف التشخيص والعلاج المحتملة2،3 لأنها قد تشارك في مجموعة متنوعة من الحالات الطبية بما في ذلك النقرس4،تعفن الدم3،الصدمة5،6،السرطان1،7،8،ومختلف أمراض المناعة الذاتية5،9. العدلات يحتشدون هو متعدد المراحل، عملية منظمة بإحكام مع التعقيد الذي يجعلهامحور اهتمام خاص من الدراسة5،10،11. أثناء الإحتباس ، تعزل العدلات موقع الالتهاب من الأنسجة السليمة المحيطة5،10،11. التنظيم السليم للجنوماتر يحتشدون ضروري لتعزيز التئام الجروح والتهاب القرار في نهاية المطاف5،12. وقد درس في المقام الأول الاحترار العدلات في الجسم الحي في القوارض12،13،14،15 وحمار وحشي10،11،12،15 نماذج. ومع ذلك ، فإن طبيعة هذه النماذج الحيوانية في الجسم الحي تؤدي إلى قيود5. على سبيل المثال ، الوسطاء التي أفرج عنها العدلات أثناء الاحتباس ليست متاحة بسهولة للتحليل5. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من المصادر المحتملة لوسيط معين في الجسم الحي ، لذلك يجب أن تدخل تجربة الجسم الحي نقصًا وراثيًا لمنع الإنتاج الخلوي و / أو التفاعل من أجل التحقيق في دور ذلك الوسيط في عملية معينة13. تتحايل تجربة المختبر على هذه المضاعفات من خلال تمكين مراقبة العدلات دون سياق خلايا إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البحوث التي تصف الهجرة المنسقة العدلات البشرية محدودة16. على منصة في المختبر يحتشدون، يمكن تحليل العدلات البشرية مباشرة. ويمكن لمنصة في المختبر يحتشدون توسيع نطاق المعرفة المكتسبة من الدراسات في الجسم الحي من خلال توفير الفرص لسد الثغرات التي خلفتها القيود المفروضة في دراسات الجسم الحي.
ولتلبية الحاجة إلى منصة في المختبر تحاكي في الحي الحي ّدات، قمنا بتطوير منصة ختم دقيقة تمكننا من نقش الجسيمات الحيوية الدقيقة التي تحفز العدلات تحت الحشود بطريقة خاضعة للرقابة المكانية. نحن توليد microarrays الجسيمات الحيوية على الشرائح الزجاجية في عملية من خطوتين. أولا، نحن نستخدم الختم الدقيق لتوليد ميكرور من البولي كتروليليت الموجبة (CP) البقع. ثانيا، نضيف حلا من الجسيمات الحيوية التي تلتزم البقع CP عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي. من خلال أول نقش طبقة CP ، يمكننا نمط الجسيمات الحيوية المشحونة بشكل سلبي بشكل انتقائي لتوليد نمط الشد العدلات المطلوب. الطبقة المشحونة إيجابيا يحمل الجسيمات الحيوية المشحونة سلبا من خلال خطوة الغسيل القوية التي تزيل الجسيمات الحيوية من المناطق على الشريحة الزجاجية التي لا تحتوي على CP. بالإضافة إلى ذلك، CP المستخدمة هنا، copolymer من الأكريلاميد وأحادي المقط الرباعي، هو متوافق بيولوجيا، لذلك فإنه لا يحفز استجابة من العدلات. لديها شحنة سطحية عالية جدا ً تقوم بشل الجسيمات الحيوية بحجم الميكرون إلى الشريحة الزجاجية ، وبالتالي تمنع العدلات من إزالة الجسيمات من الموضع المنقوش على الشريحة الزجاجية. وهذا يؤدي إلى مجموعات الجسيمات الحيوية مرتبة في ميكروarray. عندما أضفنا العدلات إلى المايكروفير، شكلوا أسراب مستقرة حول مجموعات الجسيمات الحيوية. من خلال تتبع هجرة العدلات ، وجدنا أن العدلات المحتشدة تهاجر بنشاط نحو مجموعات الجسيمات الحيوية. وعلاوة على ذلك، استخدمنا هذه المنصة لتحليل بعض الوسطاء الذين تطلقهم العدلات أثناء الإحتلال. لقد وجدنا 16 وسيطاً يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي أثناء الحشود. وتتبع تركيزاتها ثلاثة اتجاهات عامة على مر الزمن: الزيادة أو النقصان أو الارتفاع. لدينا في المختبر العدلات منصة يحتشدون يسهل تحليل العدلات البشرية التي تسيطر عليها مكانيا يحتشدون، فضلا عن جمع وتحليل الوسطاء الصادرة عن العدلات يحتشدون. في منشور سابق ، أثبتنا أن المرضى الذين يعانون من حالات طبية معينة (الصدمة ، وأمراض المناعة الذاتية ، والإنتان) ، لديهم العدلات التي تعمل بشكل مختلف عن تلك من المتبرعين الأصحاء5. في الدراسات البحثية المستقبلية، يمكن استخدام منصتنا لتحليل وظيفة العدلات بين مجموعة متنوعة من مجموعات المرضى. يمكن لهذه المنصة تحليل كمي للتنسيق المعقد الذي ينطوي عليه التَّلَّشّي في العدلات. يمكن إجراء دراسات إضافية لتوفير نظرة ثاقبة على وظيفة العدلات لمريض معين من السكان أو استجابة العدلات لمسببات الأمراض ذات الأهمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

العدلات يحتشدون هي عملية تعاونية من خلالها العدلات ختم موقع للعدوى وتعزيز إعادة تنظيم الأنسجة. وقد درس يحتشدون تقليديا في الجسم الحي في نماذج الحيوانات التي تظهر أنماط مميزة من هجرة الخلايا. ومع ذلك، في نماذج الجسم الحي لديها العديد من القيود، بما في ذلك الوسطاء بين الخلايا التي يصعب الوصول إليها وتحليلها، فضلا عن عدم القدرة على تحليل العدلات البشرية مباشرة. وبسبب هذه القيود، هناك حاجة إلى منصة في المختبر التي تدرس يحتشدون مع العدلات البشرية ويوفر سهولة الوصول إلى الإشارات الجزيئية التي تم إنشاؤها أثناء الحشود. هنا ، يتم استخدام عملية ختم دقيق متعدد الخطوات لتوليد ميكروريسالجسيمات الحيوية التي تحفز الاحترار عن طريق محاكاة عدوى في الجسم الحي. تحفز الميكروسير اتافيليات الجسيمات الحيوية على السرب بطريقة مُتحكَّم ة ومستقرة. على الميكروarray ، العدلات زيادة في السرعة وتشكيل أسراب مستقرة حول مجموعات الجسيمات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل supernatant التي ولدتها العدلات وتم اكتشاف 16 بروتينا تم التعبير عنها بشكل تفاضلي على مدى يحتشدون. هذا في المختبر يحتشدون منصة يسهل التحليل المباشر للهجرة العدلات وإطلاق البروتين بطريقة قابلة للاستنساخ، وتسيطر عليها مكانيا.

عندما تضاف العدلات إلى الجسيمات المجهرية الحيوية ، يتم تنشيط العدلات التي تتصل بمجموعات الجسيمات الحيوية وتبدأ الاستجابة المحتشدة. تم التحقق من صحة الجسيمات المجهرية الحيوية باستخدام المجهر الفلوري الفاصل بين الوقت لتتبع الهجرة العدلات نحو مجموعات الجسيمات الحيوية(فيديو S1). ي?...

Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

يولد هذا البروتوكول ميكروصفات الجسيمات الحيوية التي توفر الحينة الخاضعة للرقابة المكانية تحت الإحتلال. فهو يوفر سهولة الوصول إلى الوسطاء الذين تطلقهم العدلات أثناء الترحيل ويسمح بتحليل التصوير الكمي.

الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتحليل في المختبر من العدلات يحتشدون ، والذي يتغلب على العديد من القيود على عدم قدرتنا الحالية على التجربة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر سهولة الوصول إلى السيتوكينات المفرزة والوسطاء الدهون التي تطلق العدلات أثناء الاحتشاد وتسمح للتحليل الكمي للتصوير. في حين أننا تطبيقنا هذه التقنية على العدلات، يمكن أن تمتد لتحليل هجرة خلايا الدم البيضاء الأخرى مثل الخلايا الأحادية والخلايا التائية.تبدأ من خلال إعداد 1.6 ملليغرام لكل ملليلتر البوليكتوليت، أو حل CP، عن طريق إضافة كمية مناسبة من مسحوق CP إلى الماء وخلطه على لوحة ضجة بين عشية وضحاها أو حتى يتم حل جميع المواد الصلبة. إذا رغبت في ذلك، يمكن إجراء الحل الفلورسنت بإضافة بولي-L-ليسين المسمى مع FITC. توليد رقاقة السيليكون الرئيسي باستخدام إجراءات التصوير الضوئي القياسية.التصميم المستخدم هنا هو أربعة في أربعة ملليلتر صفيف مستطيلة من 30 ميكرومتر قطر شغل الدوائر في، مع مركز 150 ميكرومتر إلى تباعد المركز، ولكن يمكن تعديلها حسب الرغبة لتطبيقات مختلفة. تدور معطف طبقة سميكة 40 ميكرومتر من photoresist السلبية على رقاقة السيليكون. ثم خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق يعرض رقاقة للأشعة فوق البنفسجية من خلال photomask الكروم مع 150 إلى 160 ملليجول لكل سنتيمتر مربع. خبز رقاقة مرة أخرى في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.ثم غمره في مطور ا photoresist لمدة 10 دقائق. وشطفه بالكحول الأيزوبروبيل. وينبغي أن يكون النمط الآن مرئيا على الرقاقة.المقبل, خلط شامل نسبة 10 إلى واحد من بوليديميثيلسيلوكسيان, أو PDMS, prepolymer وعامل علاج لها. وسكب الخليط غير المذبوح فوق الرقاقة الرئيسية في طبق بيتري. فراغ علاج خليط PDMS uncured حتى لا فقاعات الهواء موجودة.ثم علاجها بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم مشرط لقطع حول الجزء الخارجي من الجزء المنقوش من رقاقة. وإزالة ببطء لوح PDMS الشفاء، ووضعها على لوحة قطع نظيفة مع الجانب منقوشة تواجه ما يصل.لكمة من الطوابع الفردية من بلاطة PDMS مع لكمة خزعة ثمانية ملليمتر ووضع كل طابع الوجه إلى أسفل على الشريط اللاصق لإزالة الحطام. مع هذه الطوابع التي تواجه، رئيس كل طابع مع 100 ميكرولترات من الحل CP المعدة مسبقا، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء تشكل بين الحل وختم. ثم عكس الطوابع على طبقة من حل CP وإزالتها بعد ساعة واحدة.داب كل الرطب وجه الطابع إلى أسفل على شريحة زجاجية نظيفة من ست إلى ثماني مرات لإزالة السائل الزائد. ثم فراغ علاج الطوابع لمدة دقيقة إلى دقيقتين. الانضمام إلى ثمانية بشكل جيد، ثمانية ملليمتر قطر التصوير الفضاء على رأس شريحة زجاجية نظيفة كدليل لوضع الطوابع.ضع وجه الطابع لأسفل على الشريحة الزجاجية في وسط كل بئر من مساحة التصوير. ثم ضع وزن متوازن 5.6 غرام فوق كل طابع واسمحوا 10 دقائق لختم. قم بإزالة الأوزان والطوابع من الشريحة واسمح لطبقة CP بالجفاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة قبل إضافة الجسيمات الحيوية.إذا تم وضع علامة على CP مع FITC، تحقق من فعالية الختم باستخدام مجهر فلوري. قطع لوح PDMS فارغة إلى حجم الفضاء التصوير واستخدام لكمة خزعة ثمانية ملليمتر لإنشاء الآبار في PDMS التي تتماشى مع آبار الفضاء. ثم قم بالتصاق لوح PDMS إلى الشريحة الزجاجية.ذوبان محلول من الجسيمات الحيوية وتمييعه إلى 500 ميكروغرام لكل ملليلتر في الماء للحقن. إضافة 100 ميكرولترات من محلول جسيمات حيوية لكل PDMS جيدا على الشريحة الزجاجية والصخور الشريحة لمدة 30 دقيقة. شطف الآبار جيدا بالماء والتحقق من نمط على الشريحة مع المجهر الفلورسنت.يمكن تخزين الجسيمات الحيوية في بيئة خالية من الغبار عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. إعداد الخلايا عن طريق إعادة تعليق لهم في 7.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في IMDM مع 0.4٪ البوم المصل البشري. إضافة 100 ميكرولترات من التعليق إلى PDMS جيدا تحتوي على الجسيمات الحيوية microarray، والتأكد من أن تعليق الخلية هو محدب على الجزء العلوي من PDMS جيدا ولا يحتوي على أي فقاعات.ختم البئر مع زلة غطاء قطرها 12 ملليمتر واضغط على أسفل بلطف مع ملاقط حتى نظام التعليق الخلية الزائدة يهرب إلى حافة البئر، ثم استخدام الأنسجة لإزالة الزائدة. لتصوير الخلايا، قم بتحميل صفيف الجسيمات الدقيقة بالخلايا على محطة تصوير الخلايا الحية في مجهر مجهز بحضانة قفص ية منضبطة إلى 37 درجة مئوية، و5٪ ثاني أكسيد الكربون، ورطوبة نسبية بنسبة 90٪. استخدم الفاصل الزمني، والفلورسنت، والمجهر الميداني الساطع لتسجيل الصور بمعدل 10X كل 10 ثوانٍ عند 405 نانومتر، و594 نانومتر، ومجال مشرق.احتضان العدلات في الآبار مع الجسيمات الحيوية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات، وأخذ عينات في النقاط الزمنية المطلوبة. استخدام المجهر الميداني مشرق للتحقق من أن يتم تشكيل أسراب على microarray. جمع كامل حجم من فوق البئر من بئر واحد، وتحميله في أنبوب تصفية الطرد المركزي ميكرومتر 0.45، مع التأكد من تحليل كل نقطة زمنية في ثلاث ية.أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 190 مرة G و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وجمع حجم المصفاة. ثم تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى وقت المعالجة. عند محاولة هذا البروتوكول، العمل مع المصورين الضوئيين والمطور في غطاء محرك الدخان.أن يكون هناك بروتوكول معتمد من IRB قبل أخذ الدم من المتبرعين البشريين. تذكر أن المواد المشتقة من الدم البشري هي BSL2. عندما تضاف العدلات إلى الجزئيات الحيوية microarray، العدلات التي تتصل مجموعات جسيمات حيوية تصبح نشطة وتبدأ الاستجابة يحتشدون.تم التحقق من صغر الجسيمات الحيوية باستخدام المجهر الفلورسنت الفاصل الزمني لتتبع هجرات العدلات نحو مجموعات الجسيمات الحيوية. يتم تشكيل أسراب العدلات المستقرة حول كل مجموعة بعد 30 إلى 60 دقيقة من التعرض. وعلى النقيض من ذلك، لا تظهر العدلات هجرة جماعية في غياب مجموعات جسيمات بيولوجية.تم استخدام كثافة الفلوريس من نوى العدلات الملون لتحديد أن متوسط حجم سرب حول مجموعات الجسيمات الحيوية كان حوالي 1490 ميكرومتر مربع. وفي غياب المجموعات، ظلت حالة الفلور من منطقة معينة من مناطق الاهتمام ثابتة مع مرور الوقت. وتبين مسارات هجرة العدلات أن العدلات تتقارب في مجموعة جسيمات بيولوجية عندما كان أحدها حاضراً، ولكن لم يُلاحظ أي تقارب في نظام التحكم.تم قياس سرعة العدلات المحتشدة وغير المعطلة ، وتم العثور على اختلاف مهم إحصائيًا في توزيعات السرعة. وكان متوسط سرعة العدلات المحتشدة 20.6 ميكرومتر في الدقيقة الواحدة، في حين أن متوسط سرعة العدلات التحكمية كان اثنين من ميكرومتر في الدقيقة. تم تحليل تركيزات 16 بروتينًا تطلقها العدلات أثناء الحشد بمرور الوقت.زيادة 10 بروتينات في التركيز. اثنين انخفض. والأربعة المتبقية زادت خلال الساعة الأولى من الحشد ولكن انخفضت بعد ذلك.أثناء تنفيذ هذا الإجراء، تأكد من أن كل شيء نظيف والطوابع الخاصة بك تجفف بشكل صحيح، لأن هذه ضرورية لنجاح النقش من الجسيمات البكتيرية. تطوير هذه التقنية سوف تمكن الباحثين من استكشاف أسئلة جديدة في مجال حشد العدلات، بما في ذلك كيفية الوسطاء الحرة والحويصلات خارج الخلية وتشارك في الاتصالات بين الخلايا العدلات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

نظام الحرير ثقافة السينما ل في المختبر تحليل وتصميم مادة بيولوجية

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

تكييف عملية Electrospinning لتوفير ثلاث بيئات فريدة من نوعها لثلاثي الطبقات<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج جدار مجرى الهواء

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...