Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le financement du Département William G. Lowrie de génie chimique et biomoléculaire et du Comprehensive Cancer Center de l’Ohio State University. Les données présentées dans ce rapport proviennent d’images traitées à l’aide d’Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles à l’installation de microscopie et d’imagerie du campus de l’Université d’État de l’Ohio. Cette installation est soutenue en partie par la subvention P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Les auteurs reconnaissent les volontaires en bonne santé qui ont gentiment donné leur sang. Des échantillons de sang ont été obtenus après le consentement éclairé du volontaire selon le protocole de la commission d’examen institutionnel (CISR) #2018H0268 examiné par le Comité des sciences biomédicales de l’Université d’État de l’Ohio.
1. Microfabrication de microréseau de bioparticules
<ol><li>À l’aide de procédures photolithographie standard, générer la plaquette...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Nous avons développé une plate-forme de micro-ampillage pour générer des réseaux uniformes de bioparticules pour stimuler l’essaimage in vitro de neutrophiles. La nature in vitro de notre plate-forme nous permet de contourner les complications qui surgissent avec les expériences d’essaimage in vivo, à savoir la faible capacité d’analyser les médiateurs libérés par les neutrophiles grouillant s’agitent5. En outre, les modèles in vivo sont généralement effectués chez les ronge...

Neutrophiles, le globule blanc le plus abondant dans la circulation sanguine1, attirent l’attention en tant que cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles2,3 parce qu’ils peuvent être impliqués dans une variété de conditions médicales, y compris la goutte4, sepsis3, traumatisme5,6, cancer1,7,8, et diverses maladies auto-immunes5,9. Neutrophil essaimage est un processus en plusieurs étapes, étroitement réglementé avec une complexité qui en fait un centre particulièrement intéressant de l’étude5,10,11. Pendant l’essaimage, les neutrophiles isolent un site d’inflammation du tissu sain environnant5,10,11. Une réglementation appropriée de l’essaimage neutrophile est essentielle pour promouvoir la cicatrisation des plaies et, finalement, la résolution de l’inflammation5,12. Neutrophil essaimage a principalement été étudié in vivo chez les rongeurs12,13,14,15 et le poisson zèbre10,11,12,15 modèles. Cependant, la nature de ces modèles animaux in vivo donne lieu à des limitations5. Par exemple, les médiateurs libérés par les neutrophiles pendant l’essaimage ne sont pas facilement accessibles pour l’analyse5. En outre, il existe de nombreuses sources potentielles pour un médiateur donné in vivo, de sorte qu’une expérience in vivo doit introduire une déficience génétique pour inhiber la production cellulaire et / ou l’interaction afin d’étudier le rôle de ce médiateur dans un processus donné13. Une expérience in vitro contourne cette complication en permettant l’observation des neutrophiles sans le contexte de cellules supplémentaires. En outre, la recherche décrivant la migration coordonnée des neutrophiles humains est limitée16. Sur une plate-forme d’essaimage in vitro, les neutrophiles humains peuvent être analysés directement. Une plate-forme d’essaimage in vitro pourrait élargir les connaissances acquises à partir d’études in vivo en offrant des possibilités de combler les lacunes laissées par les limites des études in vivo.
Pour répondre à la nécessité d’une plate-forme in vitro qui imite l’essaimage in vivo neutrophile, nous avons développé une plate-forme de micro-estampillage qui nous permet de modeler des microréseaux de bioparticules qui stimulent l’essaimage de neutrophiles d’une manière contrôlée spatialement. Nous produisons des microréseaux de bioparticules sur des lames de verre en deux étapes. Tout d’abord, nous utilisons le micro-estampage pour générer un microarray de taches de polyélectrolyte cationique (CP). Deuxièmement, nous ajoutons une solution de bioparticules qui adhèrent aux taches de CP par l’interaction électrostatique. En modelant d’abord la couche de CP, nous pouvons modeler sélectivement les bioparticules chargées négativement pour produire le modèle d’essaimage désiré de neutrophile. La couche chargée positivement retient les bioparticules chargées négativement par l’étape de lavage vigoureuse qui enlève les bioparticules des secteurs sur la glissière de verre qui n’ont pas le CP. En outre, le CP utilisé ici, un copolymère d’acrylamide et de monomère cationique quatertisée, est biocompatible, de sorte qu’il n’induit pas une réponse des neutrophiles. Il a une charge de surface très élevée qui immobilise les bioparticules de la taille d’un micron à la glissière de verre, empêchant ainsi les neutrophiles d’enlever les particules de la position modelée sur la glissière de verre. Il en résulte des grappes de bioparticules disposées en microarray. Lorsque nous avons ajouté des neutrophiles au microréseau, ils ont formé des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En suivant la migration des neutrophiles, nous avons constaté que les neutrophiles grouillants migrent activement vers les grappes de bioparticules. En outre, nous avons utilisé cette plate-forme pour analyser certains médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant l’essaimage. Nous avons trouvé 16 médiateurs qui sont exprimés différemment pendant l’essaimage. Leurs concentrations suivent trois tendances générales au fil du temps : augmentation, diminution ou pic. Notre plate-forme d’essaimage in vitro neutrophile facilite l’analyse de l’essaimage de neutrophiles humains contrôlés spatialement, ainsi que la collecte et l’analyse des médiateurs libérés par l’essaimage neutrophile. Dans une publication précédente, nous avons démontré que les patients présentant certaines conditions médicales (traumatisme, maladie auto-immune, et sepsis), ont eu des neutrophiles qui ont fonctionné différemment de ceux des donateurs en bonne santé5. Dans de futures études de recherche, notre plate-forme pourrait être utilisée pour analyser la fonction neutrophile parmi une variété de populations de patients. Cette plate-forme peut analyser quantitativement la coordination complexe impliquée dans l’essaimage de neutrophiles. D’autres études peuvent être faites pour fournir un aperçu sur la fonction neutrophile d’une population spécifique de patients ou la réponse de neutrophile à un agent pathogène d’intérêt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

L’essaimage de neutrophile est un processus coopératif par lequel les neutrophiles scellent un site d’infection et favorisent la réorganisation des tissus. L’essaimage a été classiquement étudiée in vivo dans des modèles animaux montrant des modèles caractéristiques de migration cellulaire. Cependant, les modèles in vivo ont plusieurs limites, y compris les médiateurs intercellulaires qui sont difficiles d’accès et d’analyse, ainsi que l’incapacité d’analyser directement les neutrophiles humains. En raison de ces limitations, il est nécessaire d’avoir une plate-forme in vitro qui étudie le grouillage de neutrophiles humains et facilite l’accès aux signaux moléculaires générés pendant l’essaimage. Ici, un processus de micro-amactinage en plusieurs étapes est utilisé pour générer un microréseau de bioparticules qui stimule l’essaimage en imitant une infection in vivo. Le microarray de bioparticules induit des neutrophiles à essaimer d’une manière contrôlée et stable. Sur le microarray, les neutrophiles augmentent en vitesse et forment des essaims stables autour des grappes de bioparticules. En outre, le supernatant généré par les neutrophiles a été analysé et 16 protéines ont été découvertes pour avoir été exprimées différemment au cours de l’essaimage. Cette plate-forme d’essaimage in vitro facilite l’analyse directe de la migration des neutrophiles et de la libération de protéines d’une manière reproductible et contrôlée spatialement.

Lorsque des neutrophiles sont ajoutés au microréseau de bioparticules, les neutrophiles qui contactent les grappes de bioparticules s’activent et déclenchent la réponse de l’essaimage. Le microréseau de bioparticules a été validé à l’aide d’une microscopie fluorescente en accéléré pour suivre la migration des neutrophiles vers les grappes de bioparticules (Vidéo S1). La migration des noyaux neutrophiles individuels est suivie lorsqu’ils migrent vers le groupe de bioparticules. Lors...

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Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Ce protocole génère des microréseaux de bioparticules qui fournissent un essaim de neutrophile contrôlé spatialement. Il permet un accès facile aux médiateurs qui neutrophiles libèrent pendant la migration et permet une analyse d’imagerie quantitative.

Microarrays de bioparticules pour l’analyse chimiotaxique et moléculaire de l’ésaimage humaine de neutrophile in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet une analyse in vitro de l’essaim de neutrophiles, qui surmonte de nombreuses limitations de notre incapacité actuelle à expérimenter. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un accès facile aux cytokines sécrètes et aux médiateurs lipidiques que les neutrophiles libèrent pendant l’essaimage et permet une analyse quantitative de l’imagerie. Alors que nous avons appliqué cette technique aux neutrophiles, elle pourrait être étendue pour analyser la migration d’autres globules blancs comme les monocytes et les lymphocytes T.Commencez par préparer une polyélectrolite cationique de 1,6 milligramme par millilitre, ou solution CP, en ajoutant la quantité appropriée de poudre de CP à l’eau et en la mélangeant sur la plaque de remue-mêle pendant la nuit ou jusqu’à ce que tous les solides soient dissous. Si vous le souhaitez, la solution peut être rendue fluorescente en ajoutant de la poly-L-lysine étiquetée avec fitc. Générez la plaquette de silicium principale à l’aide de procédures de photolithographie standard.La conception utilisée ici est un tableau rectangulaire de quatre par quatre millilitres de 30 cercles remplis de diamètre micromètre, avec un centre de 150 micromètres à l’espacement central, mais il peut être modifié comme souhaité pour différentes applications. Spin-coat une couche de 40 micromètres d’épaisseur de photorésist négatif sur une gaufrette de silicium. Cuire ensuite la gaufrette à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.Et 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Exposez la gaufrette à la lumière UV à travers un photomask chromé de 150 à 160 millijoules par centimètre carré. Cuire la gaufrette à nouveau à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes et 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.Puis submergez-le dans le développeur photorésiste pendant 10 minutes. Et rincez-le avec de l’alcool isopropyle. Le motif doit maintenant être visible sur la gaufrette.Ensuite, bien mélanger un rapport de 10 pour un de polydimethylsiloxane, ou PDMS, prépolymer et son agent curatif. Et verser le mélange non séché sur la gaufrette principale dans une boîte de Pétri. Traiter sous vide le mélange PDMS non durci jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.Puis curez-le pendant la nuit à 65 degrés Celsius. Le lendemain, utilisez un scalpel pour couper autour de l’extérieur de la section à motifs de la gaufrette. Et retirez lentement la dalle PDMS durcie, en la plaçant sur une planche à découper propre avec le côté modelé orienté vers le haut.Perforez les timbres individuels de la dalle PDMS avec un poinçon de biopsie de huit millimètres et placez chaque timbre face vers le bas sur le ruban adhésif pour enlever les débris. Avec ces timbres orientés vers le haut, amorcez chaque timbre avec 100 microlitres de la solution CP pré-préparée, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme entre la solution et le timbre. Ensuite, inversez les timbres sur une couche de solution CP et retirez-les au bout d’une heure.Tamponnez chaque tampon humide face vers le bas sur une glissière en verre propre six à huit fois pour enlever l’excès de liquide. Ensuite, passer l’aspirateur traiter les timbres pendant une à deux minutes. Adhérez à un espaceur d’imagerie de huit puits de huit millimètres de diamètre au-dessus d’une glissière en verre propre comme guide pour le placement des timbres.Placez un timbre face contre terre sur la glissière de verre au centre de chaque puits de l’espaceur d’imagerie. Placez ensuite un poids équilibré de 5,6 grammes sur chaque timbre et prévoyez 10 minutes pour l’estampage. Retirez les poids et les timbres de la lame et laissez sécher la couche CP à température ambiante pendant 24 heures avant d’ajouter des bioparticules.Si le CP est étiqueté avec le FITC, vérifiez l’efficacité de l’estampage à l’aide d’un microscope fluorescent. Coupez une dalle PDMS vierge de la taille de l’espaceur d’imagerie et utilisez le poinçon de biopsie de huit millimètres pour créer des puits dans le PDMS qui s’alignent avec les puits de l’espaceur. Ensuite, adhérez à la dalle PDMS à la glissière en verre.Décongeler une solution de bioparticules et la diluer à 500 microgrammes par millilitre dans l’eau pour injection. Ajouter 100 microlitres de solution de bioparticules à chaque puits PDMS sur la glissière de verre et faire basculer la glissière pendant 30 minutes. Rincez soigneusement les puits à l’eau et vérifiez le motif sur la lame à l’aide d’un microscope fluorescent.Le microrése de bioparticules peut être stocké dans un environnement exempt de poussière à quatre degrés Celsius pendant une période d’une période d’au moins trois mois. Préparez les cellules en les réutilisant à 7,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans IMDM avec 0,4% albumen sérique humain. Ajouter 100 microlitres de la suspension à un puits PDMS contenant le microrésexe bioparticule, en s’assurant que la suspension cellulaire est convexe sur le dessus du puits PDMS et ne contient pas de bulles.Sceller le puits avec un glissement de couvercle de 12 millimètres de diamètre et appuyer doucement avec des pinces à épiler afin que l’excès de suspension cellulaire s’échappe au bord du puits, puis utiliser un tissu pour enlever l’excès. Pour imager les cellules, chargez le réseau de microparticules avec des cellules sur la station d’imagerie cellulaire vivante d’un microscope équipé d’un incubateur de cage réglé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 90% d’humidité relative. Utilisez la microscopie en accéléré, fluorescente et lumineuse pour enregistrer des images à 10 X grossissement toutes les 10 secondes à 405 nanomètres, 594 nanomètres et champ lumineux.Incuber les neutrophiles dans les puits avec des bioparticules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois heures, en prélevant des échantillons aux points de temps désirés. Utilisez un microscope à champ lumineux pour vérifier que des essaims se forment sur le microrése. Recueillir l’ensemble du volume de supernatant d’un seul puits, et le charger dans un tube de filtre centrifugeuse de 0,45 micromètre, en s’assurant d’analyser chaque point de temps en triplicate.Centrifugez les tubes à 190 fois G et 20 degrés Celsius pendant cinq minutes, et recueillez le volume filtré. Rangez ensuite les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment du traitement. Lorsque vous essayez ce protocole, travailler avec photorésiste et développeur dans le capot de fumée.Mettre en place un protocole approuvé par la CISR avant de préséorber le sang des donneurs humains. Rappelez-vous que les matériaux dérivés du sang humain sont BSL2. Lorsque des neutrophiles sont ajoutés au microréseau bioparticule, les neutrophiles qui contactent les grappes de bioparticules s’activent et déclenchent la réponse grouillante.Le microréseau de bioparticules a été validé à l’aide d’une microscopie fluorescente en accéléré pour suivre les migrations de neutrophiles vers les grappes de bioparticules. Des essaims stables de neutrophiles se forment autour de chaque amas après 30 à 60 minutes d’exposition. En revanche, les neutrophiles ne montrent pas de migration collective en l’absence de grappes de bioparticules.L’intensité de fluorescence des noyaux de neutrophile souillés a été utilisée pour déterminer que la taille moyenne de l’essaim autour des grappes de bioparticules était d’environ 1490 micromètres au carré. En l’absence de grappes, la fluorescence d’une région d’intérêt donnée est demeurée constante au fil du temps. Les traces de la migration des neutrophiles montrent que les neutrophiles convergeaient vers un groupe de bioparticules lorsqu’on était présent, mais aucune convergence n’a été observée dans le système de contrôle.La vitesse des neutrophiles grouillants et non activés a été mesurée, et une différence statistiquement significative dans les distributions de vitesse a été trouvée. La vitesse moyenne des neutrophiles grouillants était de 20,6 micromètres par minute, tandis que la vitesse moyenne pour le contrôle des neutrophiles était de deux micromètres par minute. Les concentrations de 16 protéines que les neutrophiles libèrent pendant l’essaim ont été analysées au fil du temps.10 protéines ont augmenté en concentration. Deux ont diminué. Et les quatre autres ont augmenté au cours de la première heure d’essaimage, mais ont diminué par la suite.Tout en effectuant cette procédure, assurez-vous que tout est propre et vos timbres sont séchés correctement, car ceux-ci sont essentiels pour le bon modelage des particules bactériennes. Le développement de cette technique permettra aux chercheurs d’explorer de nouvelles questions dans le domaine de l’essaim de neutrophiles, y compris la façon dont les médiateurs libres et les vésicules extracellulaires sont impliqués dans la communication intercellulaire neutrophile.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Recherche

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