Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering und des Comprehensive Cancer Center an der Ohio State University unterstützt. Die in diesem Bericht vorgestellten Daten stammen aus Bildern, die mit Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) verarbeitet wurden, die auf der Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University, verfügbar sind. Diese Einrichtung wird zum Teil durch das Stipendium P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD, unterstützt.

Die Autoren würdigen die gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise ihr Blut gespendet haben. Blutproben wurden nach informierter freiwilliger Zustimmung gemäß dem Protokoll des Institutional Review Board (IRB) #2018H0268 vom Biomedical Sciences Committee der Ohio State University überprüft.
1. Mikrofertigung von Biopartikel-Mikroarray
<ol><li>Erzeugen Sie mit Standard-Photolithographie-Verfahren den Master-Siliziumwafer.<ol>
<li>Generieren Sie einen Nachweis des gewünschten Designs ...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Wir entwickelten eine Mikrostamping-Plattform, um einheitliche Arrays von Biopartikeln zu erzeugen, um den in vitro neutrophilen Schwärmen zu stimulieren. Die In-vitro-Natur unserer Plattform ermöglicht es uns, die Komplikationen zu umgehen, die mit In-vivo-Schwärmeexperimenten entstehen, nämlich die schlechte Fähigkeit, Mediatoren zu analysieren, die von schwärmenden Neutrophilen freigesetzt werden5. Darüber hinaus werden In-vivo-Modelle in der Regel bei Nagetieren11</sup...

Neutrophile, die am häufigsten vorkommende weiße Blutkörperchen im Blut1, gewinnen Aufmerksamkeit als potenzielle diagnostische und therapeutische Ziele2,3, weil sie in einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt sein können, einschließlich Gicht4, Sepsis3, Trauma5,6, Krebs 1,7,8, und verschiedene Autoimmunerkrankungen5,9. Neutrophiles Schwärmen ist ein mehrstufiger, streng regulierter Prozess mit einer Komplexität, die ihn zu einem besonders interessanten Schwerpunkt der Studie5,10,11macht. Während des Schwärmens isolieren Neutrophilen eine Entzündungsstelle aus dem umgebenden gesunden Gewebe5,10,11. Richtige Regulierung der neutrophilen Schwärmeist ist wichtig, um die Wundheilung und letztlich Entzündungsauflösung5,12zu fördern. Neutrophile Schwärmen wurde in erster Linie in vivo bei Nagetier12,13,14,15 und Zebrafisch10,11,12,15 Modelle untersucht. Die Art dieser in vivo Tiermodelle führt jedoch zu Einschränkungen5. Zum Beispiel sind die Von Neutrophilen während des Schwärmens freigesetzten Mediatoren für die Analyse5nicht leicht zugänglich. Darüber hinaus gibt es viele potenzielle Quellen für einen bestimmten Mediator in vivo, so dass ein In-vivo-Experiment einen genetischen Mangel einführen muss, um die zelluläre Produktion und/oder Interaktion zu hemmen, um die Rolle dieses Mediators in einem bestimmten Prozess zu untersuchen13. Ein In-vitro-Experiment umgeht diese Komplikation, indem es eine neutrophile Beobachtung ohne den Kontext zusätzlicher Zellen ermöglicht. Zusätzlich ist die Forschung zur Beschreibung der koordinierten Migration durch menschliche neutrophile begrenzt16. Auf einer In-vitro-Schwärmeplattform können menschliche Neutrophile direkt analysiert werden. Eine In-vitro-Schwärmeplattform könnte das Wissen aus In-vivo-Studien erweitern, indem sie Möglichkeiten bietet, die Lücken zu schließen, die die Grenzen von In-vivo-Studien hinterlassen haben.
Um der Notwendigkeit einer In-vitro-Plattform gerecht zu werden, die in vivo neutrophilen Schwärmen imitiert, haben wir eine Mikrostamping-Plattform entwickelt, die es uns ermöglicht, Biopartikel-Mikroarrays zu mustern, die das Neutrophilschwärmen in einer räumlich kontrollierten Weise stimulieren. Wir erzeugen Biopartikel-Mikroarrays auf Glasrutschen in einem zweistufigen Prozess. Zunächst verwenden wir Mikrostamping, um ein Mikroarray von kationischen Polyelektrolyten (CP)-Spots zu erzeugen. Zweitens fügen wir eine Lösung von Biopartikeln hinzu, die über eine elektrostatische Interaktion an den CP-Spots haften. Durch das erste Mustern der CP-Schicht können wir negativ geladene Biopartikel selektiv mustern, um das gewünschte neutrophile Schwarmmuster zu erzeugen. Die positiv geladene Schicht hält die negativ geladenen Biopartikel durch den kräftigen Waschschritt, der die Biopartikel aus den Bereichen auf dem Glasschlitten entfernt, die nicht über den CP verfügen. Zusätzlich ist der hier verwendete CP, ein Copolymer aus Acrylamid und quaternisiertem kationischen Monomer, biokompatibel, so dass es keine Reaktion der Neutrophilen induziert. Es hat eine sehr hohe Oberflächenladung, die die mikrongroßen Biopartikel zum Glasschlitten immobilisiert und so Neutrophilen daran hindert, die Partikel aus der gemusterten Position auf dem Glasschlitten zu entfernen. Dies führt zu Biopartikel-Clustern, die in einem Mikroarray angeordnet sind. Als wir dem Mikroarray Neutrophilen hinzufügten, bildeten sie stabile Schwärme um die Biopartikelhaufen. Durch die Verfolgung der Neutrophilenmigration fanden wir heraus, dass schwärmende Neutrophilen aktiv in richtungsumhergehende Biopartikel-Cluster. Darüber hinaus nutzten wir diese Plattform, um bestimmte Mediatoren zu analysieren, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen. Wir fanden 16 Mediatoren, die während des Schwärmens unterschiedlich ausgedrückt werden. Ihre Konzentrationen folgen drei allgemeinen Trends im Laufe der Zeit: Anstieg, Abnahme oder Spitze. Unsere in vitro neutrophile Schwärmeungsplattform erleichtert die Analyse des räumlich gesteuerten menschlichen Neutrophilenschwärmens sowie die Sammlung und Analyse von Mediatoren, die durch neutrophilesches Schwärmen freigesetzt werden. In einer früheren Publikation haben wir gezeigt, dass Patienten mit bestimmten Erkrankungen (Trauma, Autoimmunerkrankung und Sepsis) Neutrophile hatten, die anders funktionierten als Patienten von gesunden Spendern5. In zukünftigen Forschungsstudien könnte unsere Plattform verwendet werden, um die Neutrophilenfunktion bei einer Vielzahl von Patientenpopulationen zu analysieren. Diese Plattform kann die komplexe Koordination des Neutrophilenschwärmens quantitativ analysieren. Zusätzliche Studien können durchgeführt werden, um Einblicke in die Neutrophilenfunktion einer bestimmten Patientenpopulation oder neutrophilen Reaktionen auf einen Krankheitserreger von Interesse zu geben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

NeutrophileSchwärme ist ein kooperatives Verfahren, durch das Neutrophile eine Infektionsstelle abdichten und die Gewebereorganisation fördern. Swarming wurde klassischerweise in vivo in Tiermodellen untersucht, die charakteristische Muster der Zellmigration zeigen. In-vivo-Modelle weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, darunter interzelluläre Mediatoren, die schwer zugänglich sind und analysiert werden können, sowie die Unfähigkeit, menschliche Neutrophile direkt zu analysieren. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine In-vitro-Plattform erforderlich, die das Schwärmen mit menschlichen Neutrophilen untersucht und einen einfachen Zugang zu den molekularen Signalen bietet, die während des Schwärmens erzeugt werden. Hier wird ein mehrstufiger Mikrostamping-Prozess verwendet, um ein Biopartikel-Mikroarray zu erzeugen, das das Schwärmen stimuliert, indem es eine In-vivo-Infektion imitiert. Das Biopartikel-Mikroarray induziert Neutrophile, um kontrolliert und stabil zu schwärmen. Auf dem Mikroarray erhöhen Neutrophile die Geschwindigkeit und bilden stabile Schwärme um Biopartikelhaufen. Zusätzlich wurde überstand, überstanden von den Neutrophilen analysiert und 16 Proteine wurden entdeckt, dass sie im Laufe des Schwärmens differenziell exprimiert wurden. Diese In-vitro-Schwärmeplattform ermöglicht die direkte Analyse der Neutrophilenmigration und Proteinfreisetzung auf reproduzierbare, räumlich kontrollierte Weise.

Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion. Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um die Neutrophilenmigration zu den Biopartikelclustern zu verfolgen (Video S1). Die Migration einzelner neutrophiler Kerne wird verfolgt, während sie in Richtung des Biopartikelclusters wandern. Wenn Neutrophile den Biopartikelhaufen erreichen, über...

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Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Dieses Protokoll erzeugt Biopartikel-Mikroarrays, die räumlich gesteuerte Neutrophilenschwärme nerieren. Es bietet einfachen Zugriff auf die Mediatoren, die Neutrophile während der Migration freisetzen, und ermöglicht quantitative Bildgebungsanalysen.

Biopartikel-Mikroarrays für chemotaktische und molekulare Analysen des menschlichen Neutrophilen-Schwärmens in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es eine In-vitro-Analyse des neutrophilen Schwärmens ermöglicht, die viele Einschränkungen unserer gegenwärtigen Unfähigkeit zu experimentieren überwindet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen einfachen Zugang zu den sezernierten Zytokinen und Lipidmediatoren bietet, die Neutrophile während des Schwarms freisetzen, und eine quantitative Bildgebungsanalyse ermöglicht. Während wir diese Technik auf Neutrophile angewendet haben, könnte sie erweitert werden, um die Migration anderer weißer Blutkörperchen wie Monozyten und T-Zellen zu analysieren.Beginnen Sie mit der Zubereitung eines 1,6 Milligramm pro Milliliter kationisches Polyelektrothit, oder CP-Lösung, indem Sie die richtige Menge an CP-Pulver zu Wasser hinzufügen und es über Nacht auf der Rührplatte mischen oder bis alle Feststoffe gelöst sind. Auf Wunsch kann die Lösung fluoreszierend gemacht werden, indem Poly-L-Lysin mit FITC beschriftet hinzugefügt wird. Generieren Sie den Master-Siliziumwafer mit Standard-Photolithographie-Verfahren.Das hier verwendete Design ist ein vier mal vier Milliliter rechteckiges Array mit 30 Mikrometer Durchmesser gefüllten Kreisen, mit einem 150 Mikrometer Zentrum zu Mitte Abstand, aber es kann wie gewünscht für verschiedene Anwendungen geändert werden. Verschichten Sie eine 40 Mikrometer dicke Schicht mit negativem Photowiderstand auf einen Siliziumwafer. Dann backen Sie den Wafer bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.Und 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Setzen Sie den Wafer durch eine Chrom-Fotomaske mit 150 bis 160 Millijoule pro Zentimeter quadratisch UV-Licht aus. Backen Sie den Wafer wieder bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und 95 Grad Celsius für 10 Minuten.Dann tauchen Sie es in photoresist Entwickler für 10 Minuten. Und spülen Sie es mit Isopropylalkohol. Das Muster sollte nun auf dem Wafer sichtbar sein.Als nächstes ein Verhältnis von Polydimethylsiloxan oder PDMS, Prepolymer und seinem Härtungsmittel, gründlich mischen. Und gießen Sie die ungehärtete Mischung über den Master-Wafer in eine Petrischale. Vakuum behandeln sie das ungehärtete PDMS-Gemisch, bis keine Luftblasen vorhanden sind.Dann heilen Sie es über Nacht bei 65 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Skalpell, um das Äußere des gemusterten Teils des Wafers zu schneiden. Und entfernen Sie langsam die ausgehärtete PDMS-Platte und legen Sie sie auf ein sauberes Schneidebrett mit der gemusterten Seite nach oben.Stempeln Sie einzelne Stempel aus der PDMS-Platte mit einem acht Millimeter großen Biopsie-Punch aus und legen Sie jeden Stempel verdeckt auf das Klebeband, um Schmutz zu entfernen. Wenn diese Stempel nach oben gerichtet sind, grundiert jeder Stempel mit 100 Mikrolitern der vorgefertigten CP-Lösung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen zwischen der Lösung und der Marke bilden. Dann die Stempel auf eine Schicht von CP-Lösung umkehren und nach einer Stunde entfernen.Dab jeder nasse Stempel nach unten auf eine saubere Glasrutsche sechs bis acht Mal, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dann Vakuum behandeln die Briefmarken für ein bis zwei Minuten. Befestigen Sie einen acht Bohrer mit einem Durchmesser von acht Millimetern auf einem sauberen Glasschlitten als Leitfaden für die Stempelplatzierung.Platzieren Sie einen Stempel mit dem Gesicht nach unten auf der Glasrutsche in der Mitte jeder Bohrung des Bildraums. Legen Sie dann ein 5,6 Gramm ausgewogenes Gewicht auf jeden Stempel und lassen Sie 10 Minuten für das Stanzen. Entfernen Sie die Gewichte und die Stempel vom Schlitten und lassen Sie die CP-Schicht bei Raumtemperatur 24 Stunden trocknen, bevor Sie Biopartikel hinzufügen.Wenn der CP mit FITC markiert ist, überprüfen Sie die Wirksamkeit der Stanzung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Schneiden Sie eine leere PDMS-Platte auf die Größe des bildgebenden Abstandsraums und verwenden Sie den acht Millimeter großen Biopsie-Punch, um Brunnen im PDMS zu erstellen, die sich an den Brunnen des Abstandsraums ausrichten. Dann die PDMS-Platte an der Glasrutsche kleben.Eine Lösung von Biopartikeln auftauen und auf 500 Mikrogramm pro Milliliter Wasser zur Injektion verdünnen. Fügen Sie 100 Mikroliter Biopartikellösung zu jedem PDMS-Brunnen auf der Glasrutsche hinzu und schaukeln Sie die Rutsche für 30 Minuten. Spülen Sie die Brunnen gründlich mit Wasser und überprüfen Sie das Muster auf dem Dia mit einem Fluoreszenzmikroskop.Das Biopartikel-Mikroarray kann bis zu drei Monate in einer staubfreien Umgebung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie die Zellen vor, indem Sie sie bei 7,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in IMDM mit 0,4% menschlichem Serumalbumen wieder aufsetzen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Suspension in einen PDMS-Brunnen, der das Biopartikel-Mikroarray enthält, und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension über der Oberseite des PDMS-Guts konvex ist und keine Blasen enthält.Versiegeln Sie den Brunnen mit einem Deckelschlupf von 12 Millimetern und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, so dass die überschüssige Zellsuspension an den Rand des Brunnens entweicht, und verwenden Sie dann ein Gewebe, um den Überschuss zu entfernen. Um die Zellen abzubilden, laden Sie das Mikropartikelarray mit Zellen auf die Live-Zell-Bildgebungsstation eines Mikroskops, das mit einem Käfig-Inkubator ausgestattet ist, der auf 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 90 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Verwenden Sie Zeitraffer-, Fluoreszenz- und Lichtfeldmikroskopie, um Bilder mit 10-facher Vergrößerung alle 10 Sekunden bei 405 Nanometern, 594 Nanometern und hellem Feld aufzuzeichnen.Die Neutrophilen in den Brunnen mit Biopartikeln bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Stunden inkubieren und Proben zu den gewünschten Zeitpunkten entnehmen. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um zu überprüfen, ob Schwärme auf dem Mikroarray gebildet werden. Sammeln Sie das gesamte Volumen des Überstandes eines einzelnen Brunnens, und laden Sie es in ein 0,45 Mikrometer Zentrifuge-Filterrohr, um sicherzustellen, dass jeder Zeitpunkt in Dreifache zu analysieren.Zentrifugieren Sie die Rohre bei 190 mal G und 20 Grad Celsius für fünf Minuten, und sammeln Sie das gefilterte Volumen. Dann lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur Bearbeitungszeit. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, arbeiten Sie mit photoresist und Entwickler in der Rauchhaube.Haben Sie ein von iRB genehmigtes Protokoll, bevor Sie Blut von menschlichen Spendern entnehmen. Denken Sie daran, dass Materialien aus menschlichem Blut stammen BSL2 sind. Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion.Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um neutrophile Migrationen zu den Biopartikelclustern zu verfolgen. Stabile Neutrophilenschwärme werden um jeden Cluster nach 30 bis 60 Minuten Exposition gebildet. Im Gegensatz dazu zeigen Neutrophilen keine kollektive Migration ohne Biopartikelcluster.Die Fluoreszenzintensität von gefärbten neutrophilen Kernen wurde verwendet, um festzustellen, dass die durchschnittliche Schwarmgröße um die Biopartikelhaufen etwa 1490 Mikrometer quadratisch betrug. In Ermangelung von Clustern blieb die Fluoreszenz einer bestimmten Interessenregion im Laufe der Zeit konstant. Spuren der Neutrophilenmigration zeigen, dass Neutrophilen auf einem Biopartikelhaufen konvergierten, wenn man vorhanden war, aber keine Konvergenz im Kontrollsystem beobachtet wurde.Die Geschwindigkeit von Schwärmen und nicht aktivierten Neutrophilen wurde gemessen, und es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in den Geschwindigkeitsverteilungen festgestellt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit für schwärmende Neutrophile betrug 20,6 Mikrometer pro Minute, während die durchschnittliche Geschwindigkeit für Kontrollneutrophile zwei Mikrometer pro Minute betrug. Die Konzentrationen von 16 Proteinen, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen, wurden im Laufe der Zeit analysiert.10 Proteine erhöhten die Konzentration. Zwei gingen zurück. Und die restlichen vier nahmen in der ersten Stunde des Schwarms zu, gingen danach aber zurück.Stellen Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens sicher, dass alles sauber ist und Ihre Briefmarken richtig getrocknet werden, da diese für eine erfolgreiche Musterung der Bakterienpartikel unerlässlich sind. Die Entwicklung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, neue Fragen auf dem Gebiet des neutrophilen Schwärmens zu erforschen, einschließlich der Frage, wie freie Mediatoren und extrazelluläre Vesikel in die neutrophile interzelluläre Kommunikation involviert sind.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Forschung

Biotechnik

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