Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מימון של ויליאם G. Lowrie המחלקה להנדסה כימית ביוקולקלית ואת מרכז הסרטן המקיף באוניברסיטת אוהיו. הנתונים המוצגים בדו ח זה הגיעו מתמונות שעובדו באמצעות מיכל x64 (ver. 9.3.0 Bitplane טוס) זמין במכון המיקרוסקופיה של הקמפוס והדמיה, האוניברסיטה הממלכתית של אוהיו. מתקן זה נתמך בחלקו על ידי גרנט P30 CA016058, המכון הלאומי לסרטן, בת, MD.

המחברים מכירים במתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות את דמם. דגימות דם הושגו לאחר הסכמה מתנדבת מושכלת על פי הלוח ביקורת מוסדית (IRB) פרוטוקול #2018H0268 נבדקו על ידי הוועדה למדעים ביו-רפואי באוניברסיטת אוהיו.
1. המיקרו-מיקרוקוד של ביוביומאמר
<ol><li>באמצעות נוהלי ליתוגרפיה סטנדרטיים, ליצו?...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

פיתחנו מיקרורקיעת הפלטפורמה כדי ליצור מערכים אחידים של ביויוטיפים כדי לגרות בתוך מבחנה שורצים. הטבע מתורבת של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לעקוף את הסיבוכים הנובעים עם vivo שורצים ניסויים, כלומר היכולת המסכנה לנתח מגשרים שפורסמו על ידי שורצים נויטרופילים5. בנוסף, ב vivo מודלים מבוצע...

נויטרופילים, הנפוץ ביותר של תא דם לבן במחזור הדם1, הם צוברים תשומת לב כמטרות אבחון וטיפול פוטנציאלי2,3 כי הם עשויים להיות מעורבים במגוון של מצבים רפואיים כולל שיגרון4, אלח דם3, טראומה5,6, סרטן1,7,8, מחלות אוטואימוניות שונים5,9. נויטרופילים שורצים היא מרובת השלבים, תהליך מוסדר בחוזקה עם מורכבות זה עושה את זה מוקד מעניין במיוחד של לימוד5,10,11. במהלך שורצים, נויטרופילים לבודד אתר של דלקת מתוך רקמות בריאות שמסביב5,10,11. התקנה הנכונה של נויטרופילים שורצים חיוני כדי לקדם ריפוי הפצע בסופו של דבר החלטה דלקת5,12. נויטרופילים שורצים נחקרו בעיקר בשנת vivo ב מכרסם12,13,14,15 ו דג הזברפיש10,11,12, 15 מודלים . עם זאת, הטבע של אלה בדגמי בעלי חיים vivo מעניקה מגבלות5. לדוגמה, המגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים במהלך שורצים אינם נגישים בקלות לניתוח5. בנוסף, ישנם מקורות פוטנציאליים רבים עבור מתווך נתון vivo, כך בניסוי vivo חייב להחדיר מחסור גנטי כדי לעכב את הייצור הסלולר ו/או אינטראקציה כדי לחקור את התפקיד של המגשר הזה בתהליך נתון13. על ידי הפעלת התבוננות נויטרופילים ללא ההקשר של תאים נוספים. בנוסף, מחקר המתאר נויטרופילים האדם הגירה מתואמת הוא מוגבל16. על הפלטפורמה שורצים מתורבת, נויטרופילים האדם יכול להיות מנותח ישירות. פלטפורמת שורצים מבחנה יכולה להתרחב על הידע שנרכש במחקרים vivo על ידי מתן הזדמנויות למלא את הפערים שנותרו על ידי מגבלות במחקרים vivo.
כדי לטפל בצורך בפלטפורמת מבחנה המחקה ב vivo נויטרופילים שורצים, פיתחנו פלטפורמת מיקרוהטבעה המאפשרת לנו דפוס ביופסיה מאמר מיקרו מערכים המעוררים נויטרופילים שורצים באופן מבוקר מרחב. אנו יוצרים מיקרוערכים ביוביומאמר על מגלשות זכוכית בתהליך דו-שלבים. ראשית, אנו משתמשים במיקרו-הטבעה כדי ליצור מיקרו מערך של כתמי פוליאלקטרוליט (CP). שנית, אנו מוסיפים פתרון של מאמרים הנצמדים לנקודות CP באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית. על-ידי הראשון מעורר את שכבת CP, אנחנו יכולים באופן סלקטיבי דפוס מאמרים טעונה באופן שלילי על מנת ליצור את התבנית הרצויה נויטרופילים שורצים. השכבה טעונה באופן חיובי מחזיקה את מאמרים ביוטעונים שלילית באמצעות השלב השוטף הנמרץ המסיר את מאמרי הביויולים מהאזורים בשקופית הזכוכית שאין להם את ה-cp. בנוסף, cp השתמשו כאן, סופולימר של אקרילאמיד ו-מונומר מונומר, הוא ביו תואם, אז זה לא לגרום ל יש לו טען משטח גבוה מאוד כי משתק את מאמרי ביוביומיקרון בגודל בינוני לשקופית זכוכית, ובכך מעכב נויטרופילים להסיר את החלקיקים מהמיקום בתבנית על שקופית זכוכית. התוצאה היא אשכולות ביוביומאמרים המסודרים במיקרו-מערך. כאשר הוספנו נויטרופילים למיקרו-מערך, הם יצרו נחילים יציבים סביב האשכולות של המאמרים. באמצעות מעקב הגירה נויטרופילים, מצאנו כי שורצים באופן פעיל להגר לכיוון אשכולות המאמרים ביופסיה. יתר על כן, השתמשנו בפלטפורמה זו כדי לנתח מגשרים מסוימים שחרור נויטרופילים במהלך שורצים. מצאנו 16 מגשרים שמתבטאים באופן מכריע בזמן שורצים. הריכוזים שלהם לעקוב אחר שלוש מגמות כלליות לאורך זמן: להגדיל, להקטין, או ספייק. שלנו בפלטפורמת מבחנה שורצים הפלטפורמה מקלה על ניתוח של שליטת נויטרופילים האדם מבוקרת, כמו גם את האוסף וניתוח של מגשרים שפורסמו על ידי נויטרופילים שורצים. בפרסום קודם, הדגמנו כי חולים עם מצבים רפואיים מסוימים (טראומה, מחלות אוטואימוניות, ו אלח דם), היו נויטרופילים שפעלו באופן שונה מאלה תורמים בריאים5. במחקרי מחקר עתידיים, הפלטפורמה שלנו יכול לשמש לניתוח הפונקציה נויטרופילים בקרב מגוון רחב של אוכלוסיות החולה. פלטפורמה זו יכולה לנתח את הקואורדינציה המורכבת הכרוכה בנויטרופילים שורצים. מחקרים נוספים ניתן לעשות כדי לספק תובנה על הפונקציה נויטרופילים של אוכלוסיית החולה ספציפית או תגובת נויטרופילים לפתוגן של עניין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

נויטרופילים שורצים הוא תהליך משותף שבו נויטרופילים לאטום את אתר של זיהום ולקדם התארגנות רקמות. המונים נחקרו באופן קלאסי בvivo בדגמי בעלי חיים המציגים דפוסים אופייניים של נדידת תאים. עם זאת, במודלים vivo יש מספר מגבלות, כולל מגשרים אינטרתאיים שקשה לגשת ולנתח, כמו גם חוסר יכולת לנתח במישרין את הנויטרופילים האנושיים. בגלל מגבלות אלה, יש צורך בפלטפורמת מבחנה כי מחקרים שורצים עם נויטרופילים האדם ומספק גישה קלה האותות המולקולריים שנוצרו במהלך שורצים. בשלב זה, משתמשים בתהליך מיקרו-מעבדים מרובה-צעדים כדי ליצור מיקרוarray של מאמר ביוגרפי, המעוררת שורצים בvivo זיהום. ביוביומאמר microarray גורם נויטרופילים נחיל בצורה מבוקרת ויציבה. על מיקרוarray, העלייה נויטרופילים במהירות וליצור נחילים יציבים סביב אשכולות מאמר ביוגרפי. בנוסף, supernatant שנוצר על ידי נויטרופילים נותחו ו 16 חלבונים התגלו להתבטא באופן מהותי במהלך שורצים. זה בפלטפורמת מתורבת שורצים מקלה ניתוח ישיר של הגירה נויטרופילים ושחרור חלבון באופן שאינו מפוקח, בצורה מבוקרת מרחב.

כאשר נויטרופילים נוספים למיקרו מאמר ביוביומערך, נויטרופילים ליצור קשר עם אשכולות המאמרים להיות מופעל וליזום את התגובה שורצים. המיקרומערך הביויואלי אומת באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט בזמן הקפיצה כדי לעקוב אחר הגירה נויטרופילים לקראת האשכולות מאמר ביופסיה (וידאו S1). הגירה של גרעיני ...

Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

פרוטוקול זה יוצר מיקרו-מערכים ביוביופית המספקים שורצים בעלי מליטה באמצעות הספפיל. הוא מספק גישה קלה למגשרים כי נויטרופילים שחרור במהלך הגירה ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית.

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר ניתוח במבחנה של נחיל נויטרופילים, אשר מתגבר על מגבלות רבות של חוסר היכולת הנוכחי שלנו להתנסות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת גישה קלה ציטוקיני מופרש ומתווכים השומנים כי נויטרופילים לשחרר במהלך נחיל ומאפשר ניתוח הדמיה כמותית. בעוד יישמו טכניקה זו על נויטרופילים, זה יכול להיות מורחב כדי לנתח את הנדידה של תאי דם לבנים אחרים כמו מונוציטים ותאי T.התחל על ידי הכנת 1.6 מיליגרם למיליליטר פוליאלקטרוליט cationic, או פתרון CP, על ידי הוספת הכמות הנכונה של אבקת CP למים ערבוב אותו על צלחת מערבבים לילה או עד כל מוצקים מומסים. אם תרצה, הפתרון יכול להתבצע פלואורסצנטי על ידי הוספת פולי-L-ליסטין שכותרתו עם FITC. צור את רקיק הסיליקון הראשי באמצעות הליכי פוטוליטוגרפיה סטנדרטיים.העיצוב המשמש כאן הוא מערך מלבני של ארבעה על ארבעה מיליליטר של עיגולים מלאים בקוטר 30 מיקרומטר, עם מרכז מיקרומטר 150 למרווח מרכזי, אך ניתן לשנות אותו כרצונו עבור יישומים שונים. ספין-ציפוי שכבה בעובי 40 מיקרומטר של פוטורסיסט שלילי על רקיק סיליקון. ואז לאפות את הוופל ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.ו-95 מעלות צלזיוס ל-10 דקות. חשוף את הוופל לאור UV דרך photomask כרום עם 150 עד 160 מיליליטר סנטימטר בריבוע. אופים את הוופל שוב ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.ואז להטביע אותו מפתח photoresist במשך 10 דקות. ולשטוף אותו עם אלכוהול isopropyl. התבנית אמורה להיות גלויה כעת על הוופל.לאחר מכן, ביסודיות לערבב יחס של 10 לאחד של polydimethylsiloxane, או PDMS, prepolymer וסוכן הריפוי שלה. ויוצקים את התערובת הלא מבושלת על הוופל הראשי בצלחת פטרי. ואקום לטפל בתערובת PDMS uncured עד לא בועות אוויר נמצאים.ואז לרפא אותו לילה ב 65 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרות, השתמש באזמל כדי לחתוך סביב החלק החיצוני של החלק בדוגמת של הוופל. ולהסיר לאט את לוח PDMS נרפא, הצבת אותו על קרש חיתוך נקי עם הצד בדוגמת פונה כלפי מעלה.אגרוף החוצה בולים בודדים מלוח PDMS עם אגרוף ביופסיה שמונה מילימטר ולמקם כל חותמת עם הפנים כלפי מטה על סרט דבק כדי להסיר פסולת. עם בולים אלה פונים כלפי מעלה, ראש כל חותמת עם 100 microliters של פתרון CP מוכן מראש, להבטיח כי אין בועות אוויר להיווצר בין הפתרון ואת החותמת. ואז להפוך את הבולים על שכבה של פתרון CP ולהסיר אותם לאחר שעה אחת.לטבול כל חותמת רטובה עם הפנים כלפי מטה על מגלשת זכוכית נקייה שש עד שמונה פעמים כדי להסיר נוזל עודף. ואז ואקום לטפל בולים במשך 1 עד 2 דקות. לדבוק 8 באר, שמונה מילימטר קוטר הדמיה מרחב על גבי שקופית זכוכית נקייה כמדריך למיקום בול.מניחים חותמת עם הפנים כלפי מטה על מגלשת הזכוכית במרכז כל באר של מרחב ההדמיה. לאחר מכן מניחים משקל מאוזן של 5.6 גרם על גבי כל בול ומאפשרים 10 דקות להטבעה. הסר את המשקולות ואת הבולים מהמגלשה ואפשר לשכבת ה- CP להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות לפני הוספת חלקיקים ביולוגיים.אם ה- CP מתויג עם FITC, בדוק את יעילות ההטבעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חותכים לוח PDMS ריק לגודל של מרחב ההדמיה ולהשתמש ניקוב ביופסיה שמונה מילימטר כדי ליצור בארות PDMS ליישר עם בארות של רווח. לאחר מכן הצמד את לוח ה- PDMS לשקופית הזכוכית.להפשיר פתרון של ביו-חלקיקים ולדלל אותו ל 500 מיקרוגרם למיליליטר במים להזרקה. הוסף 100 microliters של פתרון bioparticle לכל PDMS גם על מגלשת הזכוכית ולטלטל את השקופית במשך 30 דקות. שוטפים את בארות ביסודיות עם מים ולבדוק את התבנית על המגלשה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.ניתן לאחסן את המיקרו-ריי הביו-חלקיקי בסביבה נטולת אבק בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים. הכן את התאים על-ידי שימוש חוזר ב- 7.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב- IMDM עם אלבומן סרום אנושי של 0.4%. הוסף 100 microliters של ההשעיה לבאר PDMS המכילה את microarray bioparticle, לוודא כי ההשעיה התא הוא קמור מעל החלק העליון של היטב PDMS אינו מכיל בועות.לאטום את הבאר עם 12 מילימטר קוטר לכסות להחליק ולחץ למטה בעדינות עם פינצטה כך ההשעיה תא עודף בורח לקצה הבאר, ולאחר מכן להשתמש ברקמה כדי להסיר את עודף. כדי לדמיין את התאים, טען את מערך המיקרו-חלקיקים בתאים בתחנת ההדמיה של התא החי של מיקרוסקופ המצויד באינקובטור כלובים המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ולחות יחסית של 90%. השתמש במיקרוסקופיה של זמן, פלואורסצנטיות ושדה בהיר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 10 כל 10 שניות ב- 405 ננומטר, 594 ננומטרים ושדה בהיר.דגירה נויטרופילים בארות עם bioparticles ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות, לוקח דגימות בנקודות הזמן הרצויות. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לוודא כי נחילי נוצרים על microarray. לאסוף את כל הנפח של supernatant של באר אחת, טען אותו לתוך צינור מסנן צנטריפוגה 0.45 מיקרומטר, הקפד לנתח כל נקודת זמן ב- triplicate.צנטריפוגה הצינורות ב 190 פעמים G ו 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאסוף את הנפח מסונן. לאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד זמן עיבוד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, לעבוד עם פוטורסיסט ומפתח במכסה המנוע אדים.יש פרוטוקול מאושר IRB במקום לפני לקיחת דם מתורמים אנושיים. זכור כי חומרים שמקורם בדם אנושי הם BSL2. כאשר נויטרופילים מתווספים microarray bioparticle, נויטרופילים כי מגע אשכולות bioparticle להיות מופעל וליזום את התגובה שורצת.המיקרו-ריי הביו-חלקיקי אומת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לשגות זמן כדי לעקוב אחר נדידת נויטרופילים לכיוון אשכולות הביו-חלקיקים. נחילי נויטרופילים יציבים נוצרים סביב כל אשכול לאחר 30 עד 60 דקות של חשיפה. לעומת זאת, נויטרופילים אינם מראים הגירה קולקטיבית בהיעדר אשכולות ביו-חלקיקים.עוצמת פלואורסצנטיות של גרעיני נויטרופילים מוכתמים שימשה כדי לקבוע כי גודל הנחיל הממוצע סביב אשכולות הביו-חלקיקים היה כ 1490 מיקרומטר בריבוע. בהיעדר אשכולות, הפלואורסצנטיות של אזור עניין נתון נותרה קבועה לאורך זמן. עקבות של נדידת נויטרופילים מראות כי נויטרופילים התכנסו על אשכול ביו-חלקיקים כאשר אחד היה נוכח, אבל לא נצפתה התכנסות במערכת הבקרה.מהירותם של נויטרופילים נוהרים ולא אקטיביים נמדדה, ומצא הבדל מובהק סטטיסטית בחלוקות המהירות. המהירות הממוצעת של נויטרופילים שורצים הייתה 20.6 מיקרומטר לדקה, בעוד שהמהירות הממוצעת לשליטה בניטרופילים הייתה שני מיקרומטרים לדקה. הריכוזים של 16 חלבונים שנויטרופילים משחררים במהלך הנחילות נותחו לאורך זמן.10 חלבונים גדלו בריכוז. שניים ירדו. וארבעת הנותרים גדלו בשעה הראשונה של נהרות אך ירדו לאחר מכן.בעת ביצוע הליך זה, ודא כי הכל נקי ואת הבולים שלך מיובשים כראוי, כמו אלה חיוניים עבור דפוס מוצלח של חלקיקי חיידקים. הפיתוח של טכניקה זו יאפשר לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום נויטרופילים שורצים, כולל כיצד מתווכים חופשיים ו vesicles חוץ תאיים מעורבים בתקשורת בין תאית נויטרופילים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

סרט משי תרבות מערכת במבחנה ניתוח ביולוגי עיצוב

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

במודל חוץ גופית של עורית האדם יפרטרופית צלקות באמצעות הצפיפות Macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...