Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare William G. Lowrie e dell'Comprehensive Cancer Center presso la Ohio State University. I dati presentati in questo rapporto provengono da immagini elaborate utilizzando Imaris x64 (vers. 9.3.0 Bitplane) disponibili presso il Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Questa struttura è supportata in parte dalla concessione P30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Gli autori riconoscono i volontari sani che hanno gentilmente donato il loro sangue. Gli esemplari di sangue sono stati ottenuti dopo il consenso volontario informato secondo il protocollo dell'IRB (Institutional Review Board) #2018H0268 esaminato dal Comitato di Scienze Biomediche della Ohio State University.
1. Microfabbricazione di microarray di microparticelle di bioparticelle
<ol><li>Utilizzando procedure di fotolitografia standard, generare il wafer di silicio master.<ol>
<li>Generare ...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Abbiamo sviluppato una piattaforma di microstampa per generare array uniformi di bioparticelle per stimolare il brulicare di neutrofoni in vitro. La natura in vitro della nostra piattaforma ci permette di aggirare le complicazioni che sorgono con esperimenti di sciame in vivo, vale a dire la scarsa capacità di analizzare i mediatori rilasciati dai neutrofili brulicanti5. Inoltre, i modelli in vivo vengono in genere eseguiti in roditori11,12</su...

Neutrofili, il più abbondante globulo bianco nel flusso sanguigno1, stanno guadagnando l'attenzione come potenziali bersagli diagnostici e terapeutici2,3 perché possono essere coinvolti in una varietà di condizioni mediche tra cui gotta4, sepsi3, trauma5,6, cancro1,7,8, e varie malattie autoimmuni5,9. Lo sciame neutrofilo è un processo multifase, strettamente regolato con una complessità che lo rende un focus particolarmente interessante di studio5,10,11. Durante lo sciame, i neutrofili isolano un sito di infiammazione dal tessuto sano circostante5,10,11. Una corretta regolazione del brulicante di neutrofoni è essenziale per promuovere la guarigione delle ferite e, in ultima analisi, la risoluzione dell'infiammazione5,12. Lo sciame neutrofilo è stato studiato principalmente in vivo nel roditore12,13,14,15 e pesce zebra10,11,12,15 modelli. Tuttavia, la natura di questi modelli animali in vivo dà luogo a limitazioni5. Ad esempio, i mediatori rilasciati dai neutrofili durante lo sciame non sono facilmente accessibili per l'analisi5. Inoltre, ci sono molte fonti potenziali per un determinato mediatore in vivo, quindi un esperimento in vivo deve introdurre una carenza genetica per inibire la produzione cellulare e/o l'interazione al fine di studiare il ruolo di quel mediatore in un dato processo13. Un esperimento in vitro aggira questa complicazione consentendo l'osservazione dei neutrofili senza il contesto di cellule aggiuntive. Inoltre, la ricerca che descrive la migrazione coordinata dei neutrofili umani è limitatadi 16. Su una piattaforma di bruliè in vitro, i neutrofili umani possono essere analizzati direttamente. Una piattaforma di brulicante in vitro potrebbe ampliare le conoscenze acquisite dagli studi in vivo fornendo opportunità per colmare le lacune lasciate dai limiti degli studi in vivo.
Per rispondere alla necessità di una piattaforma in vitro che imita il brulicare di neutroni in vivo, abbiamo sviluppato una piattaforma di microstamping che ci permette di patternare microarray di bioparticelle che stimolano il brulicare di neutroni in modo controllato spazialmente. Noi generiamo microarray di bioparticelle su vetrini di vetro in un processo in due fasi. In primo luogo, utilizziamo il microstamping per generare un microarray di macchie di polielettrolita cationico (CP). In secondo luogo, aggiungiamo una soluzione di bioparticelle che aderiscono alle macchie CP tramite interazione elettrostatica. Modellando prima lo strato CP, possiamo modellizzare selettivamente bioparticelle caricate negativamente per generare il modello di brulicante di neutrofili desiderato. Lo strato caricato positivamente contiene le bioparticelle caricate negativamente attraverso la fase di lavaggio vigoroso che rimuove le bioparticelle dalle aree sul vetrino che non hanno il CP. Inoltre, il CP utilizzato qui, un copolimero di acrilammide e monomero cationico quaternizzato, è biocompatibile, quindi non induce una risposta dai neutrofili. Ha una carica superficiale molto alta che immobilizza le bioparticelle di dimensioni micron al vetrino di vetro, impedendo così ai neutrofili di rimuovere le particelle dalla posizione modellata sul vetrino di vetro. Ciò si traduce in cluster di bioparticelle disposti in un microarray. Quando abbiamo aggiunto i neutrofili al microarray, formavano sciami stabili intorno agli ammassi di bioparticelle. Attraverso il monitoraggio della migrazione dei neutrofili, abbiamo scoperto che i neutrofili brulicanti migrano attivamente verso i cluster di bioparticelle. Inoltre, abbiamo usato questa piattaforma per analizzare alcuni mediatori che i neutrofili rilasciano durante lo sciame. Abbiamo trovato 16 mediatori che sono espressi in modo differenziale durante lo sciame. Le loro concentrazioni seguono tre tendenze generali nel tempo: aumento, diminuzione o picco. La nostra piattaforma di brulichi neutrofili in vitro facilita l'analisi del brulicare di neutrofi umani controllato spazialmente, così come la raccolta e l'analisi di mediatori rilasciati da brulicanti di neutrofoni. In una pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che i pazienti con determinate condizioni mediche (trauma, malattia autoimmune e sepsi), avevano neutrofili che funzionavano in modo diverso rispetto a quelli provenienti da donatori sani5. In studi di ricerca futuri, la nostra piattaforma potrebbe essere utilizzata per analizzare la funzione neutrofila tra una varietà di popolazioni di pazienti. Questa piattaforma può analizzare quantitativamente la complessa coordinazione coinvolta nello sciame neutrofico. Ulteriori studi possono essere fatti per fornire informazioni sulla funzione neutrofila di una specifica popolazione di pazienti o la risposta dei neutrofili a un agente patogeno di interesse.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

Lo sciame neutrofilo è un processo cooperativo attraverso il quale i neutrofili sigillano un sito di infezione e promuovono la riorganizzazione dei tessuti. Lo sciame è stato studiato in modo classico in vivo in modelli animali che mostrano modelli caratteristici della migrazione cellulare. Tuttavia, i modelli in vivo hanno diverse limitazioni, tra cui mediatori intercellulari che sono difficili da accedere e analizzare, così come l'incapacità di analizzare direttamente i neutrofili umani. A causa di queste limitazioni, c'è bisogno di una piattaforma in vitro che studia brulicante di neutrofili umani e fornisce un facile accesso ai segnali molecolari generati durante lo sciame. Qui, un processo di microstampa multifase viene utilizzato per generare un microarray di bioparticelle che stimola lo sciame imitando un'infezione in vivo. Il microarray di bioparticelle induce i neutrofili a sciamare in modo controllato e stabile. Sul microarray, i neutrofili aumentano di velocità e formano sciami stabili intorno ai cluster di bioparticelle. Inoltre, è stato analizzato il supernatante generato dai neutrofili e si è scoperto che 16 proteine sono state espresse in modo differenziale nel corso dello sciame. Questa piattaforma di brulichi in vitro facilita l'analisi diretta della migrazione dei neutrofili e del rilascio di proteine in modo riproducibile e controllato dallo spazio.

Quando i neutrofili vengono aggiunti al microarray di microparticelle di bioparticelle, i neutrofili che contattano i cluster di bioparticelle si attivano e avviano la risposta sciami. Il microarray di bioparticelle è stato convalidato utilizzando la microscopia fluorescente time-lapse per monitorare la migrazione dei neutrofi verso i cluster di bioparticelle (Video S1). La migrazione dei singoli nuclei di neutrofili viene monitorata mentre migrano verso il cluster di bioparticelle. Quando i neutrofili ...

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Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Questo protocollo genera microarray di bioparticelle che forniscono brulio di neutrofoni controllati spazialmente. Fornisce un facile accesso ai mediatori che i neutrofili rilasciano durante la migrazione e consente l'analisi quantitativa dell'imaging.

Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Questo protocollo è significativo perché consente un'analisi in vitro dello sciame neutrofilo, che supera molti limiti della nostra attuale incapacità di sperimentare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un facile accesso alle citochine secrete e ai mediatori lipidici che i neutrofili rilasciano durante lo sciame e consente l'analisi quantitativa dell'imaging. Mentre applicamo questa tecnica ai neutrofili, potrebbe essere estesa per analizzare la migrazione di altri globuli bianchi come monociti e cellule T.Inizia preparando una polielettrolite cationica da 1,6 milligrammi per millilitro, o soluzione CP, aggiungendo la giusta quantità di polvere CP all'acqua e mescolandola sulla piastra di agitazione durante la notte o fino a quando tutti i solidi non vengono sciolti. Se lo si desidera, la soluzione può essere resa fluorescente aggiungendo poli-L-lisina etichettata con FITC. Generare il wafer di silicio principale utilizzando procedure di fotolitografia standard.Il design utilizzato qui è un array rettangolare da quattro a quattro millilitri di cerchi riempiti di 30 micrometri di diametro, con una spaziatura da centro a centro di 150 micrometri, ma può essere modificato come desiderato per diverse applicazioni. Spin-coat uno strato di 40 micrometri di fotoresist negativo su un wafer di silicio. Quindi cuocere il wafer a 65 gradi Celsius per cinque minuti.E 95 gradi Celsius per 10 minuti. Esporre il wafer alla luce UV attraverso una fotomaschera cromata con 150-160 millijoule per centimetro squadrato. Cuocere di nuovo il wafer a 65 gradi Celsius per cinque minuti e 95 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi immergerlo nello sviluppatore fotoresist per 10 minuti. E sciacquarlo con alcol isopropile. Il motivo dovrebbe ora essere visibile sul wafer.Quindi, mescolare accuratamente un rapporto 10 a uno di polidimetilsiloxano, o PDMS, prepolimero e il suo agente polimerizzante. E versare il composto non curato sul wafer principale in una piastra di Petri. Trattare sottovuoto la miscela PDMS non curata fino a quando non sono presenti bolle d'aria.Quindi curarlo durante la notte a 65 gradi Celsius. Il giorno successivo, usa un bisturi per tagliare intorno all'esterno della sezione modellata del wafer. E rimuovere lentamente la lastra PDMS polimerizzata, posizionarla su un tagliere pulito con il lato modellato rivolto verso l'alto.Punzonare i singoli timbri dalla lastra PDMS con un punzone di biopsia di otto millimetri e posizionare ogni timbro a faccia in giù sul nastro adesivo per rimuovere i detriti. Con questi francobolli rivolti verso l'alto, innescare ogni timbro con 100 microlitri della soluzione CP pre-preparata, assicurando che non si formino bolle d'aria tra la soluzione e il timbro. Quindi invertire i timbri su uno strato di soluzione CP e rimuoverli dopo un'ora.Tamponare ogni timbro bagnato a faccia in giù su uno scivolo di vetro pulito da sei a otto volte per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi aspirare trattare i francobolli per uno o due minuti. Aderire a un distanziale per l'imaging di otto pozzi e otto millimetri di diametro sopra uno scivolo di vetro pulito come guida per il posizionamento del timbro.Posizionare un timbro a faccia in giù sullo scivolo di vetro al centro di ogni pozzo del distanziale per immagini. Quindi posizionare un peso bilanciato di 5,6 grammi sopra ogni timbro e lasciare 10 minuti per la timbratura. Rimuovere i pesi e i timbri dallo scivolo e lasciare asciugare lo strato CP a temperatura ambiente per 24 ore prima di aggiungere bioparticelle.Se il CP è contrassegnato con FITC, verificare l'efficacia della stampa con un microscopio fluorescente. Tagliare una lastra PDMS vuota alle dimensioni del distanziale di imaging e utilizzare il punzone di biopsia di otto millimetri per creare pozzi nel PDMS che si allineano con i pozzi del distanziale. Quindi aderire alla lastra PDMS allo scivolo di vetro.Scongelare una soluzione di bioparticelle e diluirla a 500 microgrammi per millilitro in acqua per iniezione. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di bioparticella ad ogni PDMS bene sullo scivolo di vetro e scuotere lo scivolo per 30 minuti. Risciacquare accuratamente i pozzi con acqua e controllare il motivo sullo scivolo con un microscopio fluorescente.Il microarray di bioparticelle può essere conservato in un ambiente privo di polvere a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Preparare le cellule riutilizzandole a 7,5 per 10 alla quinta colonna per millilitro in IMDM con albume di siero umano allo 0,4%. Aggiungere 100 microlitri della sospensione a un pozzo PDMS contenente il microarray della bioparticella, assicurandosi che la sospensione cellulare sia convessa sopra la parte superiore del PDMS bene e non contenga bolle.Sigillare il pozzo con un coperchio di 12 millimetri di diametro scivolare e premere delicatamente verso il basso con una pinzetta in modo che la sospensione cellulare in eccesso fuoriesca sul bordo del pozzo, quindi utilizzare un tessuto per rimuovere l'eccesso. Per immaginare le cellule, caricare l'array di microparticelle con le celle sulla stazione di imaging delle cellule vive di un microscopio dotato di un incubatore di gabbie impostato su 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità relativa del 90%. Usa la microscopia a campo luminoso, fluorescente e a vuoto per registrare immagini con ingrandimento 10 volte ogni 10 secondi a 405 nanometri, 594 nanometri e campo luminoso.Incubare i neutrofili nei pozzi con bioparticelle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore, prelevando campioni nei punti di tempo desiderati. Utilizzare un microscopio a campo luminoso per verificare che gli sciami si siano formati sul microarray. Raccogli l'intero volume di supernatante di un singolo pozzo e caricalo in un tubo filtrante di centrifuga da 0,45 micrometri, assicurandoti di analizzare ogni punto di tempo in triplice copia.Centrifugare i tubi a 190 volte G e 20 gradi Celsius per cinque minuti e raccogliere il volume filtrato. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al tempo di elaborazione. Quando si tenta questo protocollo, lavorare con fotoresist e sviluppatore nel cofano dei fumi.Avere un protocollo approvato dall'IRB prima di prendere il sangue dai donatori umani. Ricorda che i materiali derivati dal sangue umano sono BSL2. Quando i neutrofili vengono aggiunti al microarray della bioparticella, i neutrofili che contattano gli ammassi di bioparticelle si attivano e avviano la risposta brulicante.Il microarray di bioparticelle è stato convalidato utilizzando la microscopia fluorescente time lapse per tracciare le migrazioni dei neutrofili verso gli ammassi di bioparticelle. Gli sciami neutrofili stabili si formano intorno a ciascun ammasso dopo 30-60 minuti di esposizione. Al contrario, i neutrofili non mostrano una migrazione collettiva in assenza di cluster di bioparticelle.L'intensità di fluorescenza dei nuclei neutrofili macchiati è stata utilizzata per determinare che la dimensione media dello sciame intorno agli ammassi di bioparticelle era di circa 1490 micrometri al quadrato. In assenza di ammassi, la fluorescenza di una data regione di interesse è rimasta costante nel tempo. Tracce di migrazione neutrofila mostrano che i neutrofili convergevano su un ammasso di bioparticelle quando uno era presente, ma non è stata osservata alcuna convergenza nel sistema di controllo.È stata misurata la velocità dei neutrofili brulicanti e non attivi ed è stata riscontrata una differenza statisticamente significativa nelle distribuzioni di velocità. La velocità media per i neutrofili brulicanti era di 20,6 micrometri al minuto, mentre la velocità media per i neutrofili di controllo era di due micrometri al minuto. Le concentrazioni di 16 proteine che i neutrofili rilasciano durante lo sciame sono state analizzate nel tempo.10 proteine aumentate in concentrazione. Due sono diminuiti. E gli altri quattro aumentarono durante la prima ora di sciame, ma diminuirono in seguito.Durante l'esecuzione di questa procedura, assicurarsi che tutto sia pulito e che i timbri vengano asciugati correttamente, in quanto questi sono essenziali per un modello efficace delle particelle batteriche. Lo sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare nuove domande nel campo dello sciame neutrofilo, incluso il modo in cui mediatori liberi e vescicole extracellulari sono coinvolti nella comunicazione intercellulare neutrofila.

Research

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Bioengineering

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