Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

이 일은 오하이오 주립 대학에 있는 화학과 생물 분자 공학의 윌리엄 G. Lowrie 부 및 포괄적인 암 센터에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 이 보고서에 제시된 데이터는 오하이오 주립 대학의 캠퍼스 현미경 및 이미징 시설에서 사용할 수 있는 Imaris x64(9.3.0 비트플레인)를 사용하여 처리된 이미지에서 나왔습니다. 이 시설은 보조금 P30 CA016058, 국립 암 연구소, 베데스다, MD에 의해 부분적으로 지원됩니다.

저자는 친절하게 자신의 혈액을 기증 건강한 자원 봉사자를 인정합니다. 혈액 표본은 오하이오 주립 대학에 있는 생물 의학 과학 위원회에 의해 검토된 기관 검토 위원회 (IRB) 프로토콜 #2018H0268 에 따라 통보된 자원봉사자 동의 후에 장악되었습니다.
1. 생체 입자 마이크로 어레이의 미세 가공
<ol><li>표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다....

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

우리는 시험관 내 호중구 무리를 자극하기 위해 균일 한 바이오 입자 배열을 생성하는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리의 플랫폼의 체외 특성은 우리가 생체 내 무리 실험으로 발생하는 합병증을 우회 할 수 있습니다, 즉 호중구를 무리에 의해 방출 중재자를 분석 할 수있는 가난한 능력5. 또한 생체 내 모델은 일반적으로 설치류11,<sup class...

혈류에서가장 풍부한 백혈구인 호중구는 1,3,2,3, 구획4,패혈증3,외상5,6,암1,7,8,각종 자가면역 질환5,9등 다양한 의료 조건에 관여할 수 있기 때문에 잠재적 진단 및 치료 표적으로 주목받고 있다. 호중구 떼는 연구5,10,11의특히 흥미로운 초점을 만드는 복잡성과다단계,엄격하게 규제 과정입니다. 무리 동안 호중구는 주변의 건강한 조직으로부터 염증 부위를분리5,10,11. 호중구 무리의 적절한 조절은 상처 치유와 궁극적으로 염증 해결을 촉진하는 데 필수적이다5,12. 호중구 떼는 주로 설치류12,13,14,15 및 제브라피시10,11,12,15 모델에서 생체 내에서 연구되었다. 그러나, 이러한 생체 내 동물 모델의 특성상 한계를 야기한다5. 예를 들어, 무리 동안 호중구에 의해 방출 된 중재자는 분석5에쉽게 접근 할 수 없습니다. 추가적으로, 생체 내에서 주어진 중재자에 대한 많은 잠재적인 공급원이 존재하므로 생체 내 실험은 주어진 프로세스에서 그 중재자의 역할을 조사하기 위해 세포 생산 및/또는 상호작용을 억제하는 유전적 결핍을 도입해야 한다13. 시험관 내 실험은 추가 세포의 맥락없이 호중구 관찰을 가능하게하여이 합병증을 우회. 추가적으로, 인간 호중구 조정한 이주를 기술하는 연구는16. 생체 외에서 무리 플랫폼에서, 인간의 호중구는 직접 분석 할 수 있습니다. 생체 외에서 떼지어 플랫폼은 생체 내 연구의 한계에 의해 남겨진 격차를 채울 수있는 기회를 제공함으로써 생체 내 연구에서 얻은 지식을 확장 할 수 있습니다.
생체 내 호중구 떼를 모방하는 체외 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해, 우리는 공간적으로 제어 된 방식으로 호중구 떼를 자극하는 바이오 입자 마이크로 어레이를 패턴화 할 수있는 마이크로 스탬핑 플랫폼을 개발했습니다. 우리는 2 단계 공정에서 유리 슬라이드에 생체 입자 마이크로 어레이를 생성합니다. 첫째, 마이크로스탬핑을 사용하여 양이온폴리전해질(CP) 반점의 마이크로어레이를 생성합니다. 둘째, 정전기 상호 작용을 통해 CP 반점에 부착되는 바이오 입자 용액을 추가합니다. 먼저 CP 층을 패터닝함으로써, 우리는 원하는 호중구 군집 패턴을 생성하기 위해 음전하 바이오 입자를 선택적으로 패턴화 할 수 있습니다. 양전하층은 CP가 없는 유리 슬라이드의 영역에서 바이오입자를 제거하는 활발한 세척 단계를 통해 음전하된 바이오입자를 보유합니다. 그것은 유리 슬라이드에 미론 크기의 바이오 입자를 고정시키는 매우 높은 표면 전하를 가지며, 따라서 유리 슬라이드의 패턴 위치에서 입자를 제거하는 호중구를 억제합니다. 이로 인해 마이크로어레이로 배열된 생체 입자 클러스터가 생성됩니다. 우리가 마이크로어레이에 호중구를 추가했을 때, 그들은 생물입자 클러스터 주위에 안정된 무리를 형성했습니다. 호중구 이동추적을 통해, 우리는 호중구떼가 생체입자 클러스터로 적극적으로 이동한다는 것을 발견했습니다. 또한, 우리는 호중구가 떼지어 다니는 동안 방출되는 특정 중재자를 분석하기 위해이 플랫폼을 사용했습니다. 우리는 무리를 지어 다니는 동안 차별화된 16개의 중재자를 발견했습니다. 그들의 농도 는 시간이 지남에 따라 세 가지 일반적인 추세를 따릅니다: 증가, 감소, 또는 스파이크. 우리의 체외 호중구 떼 플랫폼은 공간적으로 제어 된 인간 호중구 무리의 분석뿐만 아니라 호중구 무리에 의해 발표 된 중재자의 수집 및 분석을 용이하게합니다. 이전 간행물에서, 우리는 특정 건강 상태 (외상, 자기 면역 질병 및 패혈증)를 가진 환자가 건강한 기증자에서 그것과 다르게 작동하는 호중구가 있었다는 것을 보여주었습니다5. 향후 연구 연구에서, 우리의 플랫폼은 다양한 환자 집단 사이에서 호중구 기능을 분석하는 데 사용될 수 있습니다. 이 플랫폼은 호중구 무리에 관련된 복잡한 조정을 정량적으로 분석할 수 있다. 추가 연구는 관심있는 병원체에 대한 특정 환자 집단 또는 호중구 반응의 호중구 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 수행 될 수있다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

호중구 떼는 호중구가 감염 부위를 봉인하고 조직 재구성을 촉진하는 협력 과정입니다. 떼는 세포 이동의 특징적인 패턴을 보여주는 동물 모델에서 생체 내에서 고전적으로 연구되었습니다. 그러나 생체 내 모델에는 접근 및 분석이 어려운 세포간 중재자뿐만 아니라 인간 호중구를 직접 분석할 수 없는 등 여러 가지 한계가 있습니다. 이러한 제한 때문에, 인간 호중구로 떼지어 연구하고 떼지어 다니는 동안 생성되는 분자 신호에 쉽게 접근할 수 있는 시험관 내 플랫폼이 필요합니다. 여기서, 다단계 마이크로스탬핑 공정은 생체 내 감염을 모방하여 떼지어를 자극하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성하는 데 사용된다. 생체 입자 마이크로 어레이는 호중구가 제어되고 안정적인 방식으로 무리를 유도합니다. 마이크로어레이에서 호중구는 속도가 증가하고 생물입자 클러스터 주변에 안정된 무리를 형성합니다. 추가적으로, 호중구에 의해 생성된 상온제는 분석되고 16개의 단백질은 무리의 과정을 통해 분별적으로 표현된 것으로 밝혀졌습니다. 이 시험관 내 무리 플랫폼은 재생 가능한 공간 제어 방식으로 호중구 이동 및 단백질 방출에 대한 직접적인 분석을 용이하게 합니다.

호중구가 바이오 입자 마이크로 어레이에 추가되면, 생체 입자 클러스터와 접촉하는 호중구가 활성화되어 무리 반응을 시작합니다. 바이오입자 마이크로어레이는 타임랩스 형광 현미경을 사용하여 생체입자 클러스터를 향한 호중구 이동을 추적하는 것으로 검증되었습니다(비디오S1). 개별 호중구 핵의 이동은 생물입자 클러스터로 이동함에 따라 추적됩니다. 호중구가 생체 입자 클?...

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Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

이 프로토콜은 호중구 무리의 체외 분석을 허용하기 때문에 중요하며, 이는 현재 실험할 수 없는 많은 한계를 극복합니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구가 무리 중에 방출되고 정량적 이미징 분석을 허용하는 분비된 사이토카인 및 지질 중재자에 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다. 우리는 호중구에 이 기술을 적용하는 동안, 단핵구 및 T 세포 같이 그밖 백혈구의 이동을 분석하기 위하여 확장될 수 있었습니다.밀리리터 양이온 폴리일라이트 또는 CP 용액당 1.6밀리그램을 준비하여 적절한 양의 CP 분말을 물에 추가하고 밤새 또는 모든 고형물이 용해될 때까지 교반판에 혼합하여 시작합니다. 원하는 경우 FITC로 표시된 폴리 L-리신을 추가하여 용액을 형광할 수 있습니다. 표준 포토리소그래피 절차를 사용하여 마스터 실리콘 웨이퍼를 생성합니다.여기서 사용되는 디자인은 30 마이크로미터 직경의 4mm리터 직사각형 배열로, 150 마이크로미터 중심을 중심으로 간격을 두고 있지만, 다른 용도에 대해 원하는 대로 수정할 수 있다. 실리콘 웨이퍼에 네거티브 포토레지스트의 40 마이크로미터 두께층을 스핀 코트. 그런 다음 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간 굽습니다.그리고 10 분 동안 섭씨 95도. 150~160밀리미터곱미터의 크롬 포토마스크를 통해 웨이퍼를 UV 광에 노출시다. 웨이퍼를 섭씨 65도에서 5분간, 섭씨 95도에서 10분간 다시 구워줍니다.그런 다음 포토레지스트 개발자에게 10분 동안 담급됩니다. 그리고 이소 프로필 알코올로 헹지. 이제 웨이퍼에 패턴이 표시됩니다.다음으로, 폴리디메틸실록산 또는 PDMS, 프리폴리머 및 그 경화제의 10 대 1 비율을 철저히 혼합한다. 그리고 페트리 접시에 마스터 웨이퍼 위에 경화되지 않은 혼합물을 붓습니다. 진공은 기포가 없을 때까지 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 처리합니다.그런 다음 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 치료하십시오. 다음 날, 웨이퍼의 패턴 섹션의 외관 주위를 잘라 메스를 사용합니다. 그리고 경화 된 PDMS 슬래브를 천천히 제거하고 패턴 면이 위로 향하는 깨끗한 도마에 놓습니다.PDMS 슬래브의 개별 스탬프를 8mm 생검 펀치로 펀치하고 각 스탬프를 접착제 테이프에 엎드려 이물질을 제거합니다. 이러한 스탬프가 위향을 향하도록 미리 준비된 CP 솔루션의 100마이크로리터가 있는 각 스탬프를 프라임하여 솔루션과 스탬프 사이에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 그런 다음 스탬프를 CP 솔루션 레이어에 반전시키고 1시간 후에 제거합니다.젖은 각 스탬프를 깨끗한 유리 슬라이드에 6~8번 내려 놓고 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 스탬프를 1~2분 동안 진공 청소기로 처리합니다. 스탬프 배치를 위한 가이드로서 깨끗한 유리 슬라이드 위에 8밀리미터 직경의 이미징 스페이서를 부착합니다.이미징 스페이서의 각 웰 의 중앙에 유리 슬라이드에 스탬프를 아래로 놓습니다. 그런 다음 각 스탬프 위에 5.6 그램의 균형 잡힌 무게를 놓고 스탬핑을 위해 10 분을 허용하십시오. 슬라이드에서 무게와 우표를 제거하고 CP 층이 생체 입자를 추가하기 전에 실온에서 24 시간 동안 건조 할 수 있습니다.CP가 FITC로 태그된 경우 형광 현미경으로 스탬핑의 효과를 확인하십시오. 빈 PDMS 슬래브를 이미징 스페이서 크기로 자르고 8mm 생검 펀치를 사용하여 스페이서의 우물과 일치하는 PDMS의 우물을 만듭니다. 그런 다음 PDMS 슬래브를 유리 슬라이드에 부착합니다.바이오 입자의 용액을 해동하고 주입을 위해 물에서 밀리리터 당 500 마이크로 그램으로 희석하십시오. 유리 슬라이드에 각 PDMS에 100 마이크로리터의 생입자 용액을 넣고 30분 동안 슬라이드를 흔들수 있습니다. 우물을 물로 철저히 헹구고 형광 현미경으로 슬라이드의 패턴을 확인하십시오.생체 입자 마이크로어레이는 최대 3개월 동안 섭씨 4도에서 먼지가 없는 환경에 보관할 수 있습니다. IMDM에서 밀리리터당 5번째 세포에 7.5배 10회에서 0.4%의 인간 혈청 알부민으로 세포를 재연하여 세포를 준비한다. 생체 입자 마이크로 어레이를 잘 포함하는 PDMS에 서스펜션 100 마이크로리터를 추가하여 세포 현탁액이 PDMS 상단에 잘 볼록하고 거품이 포함되어 있지 않은지 확인합니다.12 밀리미터 직경의 커버 슬립으로 우물을 밀봉하고 핀셋으로 부드럽게 눌러 과도한 세포 현탁액이 우물 가장자리로 빠져 나간 다음 조직을 사용하여 과잉을 제거하십시오. 세포를 이미지화하기 위해, 현미경의 살아있는 세포 이미징 스테이션에 세포와 함께 마이크로 입자 배열을 로드하 37섭씨, 5%의 이산화탄소 및 90%의 상대 습도로 설정된 케이지 인큐베이터가 장착되어 있습니다. 시간 경과, 형광 및 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 405 나노미터, 594 나노미터 및 밝은 필드에서 10 초마다 10배배율로 이미지를 기록합니다.생체 입자와 함께 우물의 호중구를 37도, 이산화탄소 5%를 3시간 동안 배양하여 원하는 시점에서 샘플을 채취합니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 소열이 마이크로 어레이에 형성되는지 확인합니다. 단일 웰의 전체 상체체 를 수집하고 0.45 마이크로미터 원심분리기 필터 튜브에 적재하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 분석하십시오.원심 분리는 5 분 동안 190 배 G와 섭씨 20도에서 튜브를 원심 분리하고 여과 된 볼륨을 수집합니다. 그런 다음 처리 시간까지 샘플을 영하 80도에서 보관하십시오. 이 프로토콜을 시도할 때는 연기 후드에서 포토레지스트 및 개발자와 함께 작업합니다.인간 기증자에게서 혈액을 취하기 전에 장소에 IRB 승인 프로토콜이 있습니다. 인간의 혈액에서 파생 된 물질은 BSL2 것을 기억하십시오. 호중구가 생입자 마이크로어레이에 첨가되면 생체 입자 클러스터에 접촉하는 호중구가 활성화되어 서집 반응을 시작합니다.생체 입자 마이크로어레이는 시간 경과 형광 현미경 검사를 사용하여 생체 입자 클러스터로의 호중구 이동을 추적하여 검증되었습니다. 안정적인 호중구 군단은 30~60분 동안 노출된 후 각 클러스터 주위에 형성됩니다. 대조적으로, 호중구는 생물 입자 클러스터의 부재에 집단 이주를 표시하지 않습니다.스테인드 호중구 핵의 형광 강도는 생체 입자 클러스터 주위의 평균 떼 크기가 약 1490 마이크로미터 제곱된 것을 결정하기 위해 사용되었다. 클러스터가 없는 경우, 관심의 주어진 영역의 형광은 시간이 지남에 따라 일정하게 유지. 호중구 이동의 트랙은 호중구가 존재할 때 생입자 클러스터에 수렴되었음을 보여 주지만 제어 시스템에서는 수렴이 관찰되지 않았습니다.무리와 비활성화 호중구의 속도를 측정하고, 속도 분포에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다. 호중구 를 무리에 대 한 평균 속도 는 분 당 20.6 마이크로 미터, 제어 호중구에 대 한 평균 속도 분 당 2 마이크로 미터 동안. 호중구가 무리 중에 방출되는 16가지 단백질의 농도는 시간이 지남에 따라 분석되었다.10 단백질 농도 증가. 2개가 감소했습니다. 그리고 나머지 네 는 무리의 첫 번째 시간 동안 증가하지만 그 후 감소.이 절차를 수행하는 동안 세균 성 입자의 성공적인 패터닝에 필수적이기 때문에 모든 것이 깨끗하고 우표가 제대로 건조되었는지 확인하십시오. 이 기술의 발달은 유중구 성 소동의 필드에 있는 새로운 질문을 탐구하는 연구원을 가능하게 할 것입니다, 어떻게 자유로운 중재자 및 세포외 소포가 호중구 세포 간 통신에 관련되는가를 포함하여.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

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DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

연구

생체공학

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

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위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

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전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

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준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

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In Vitro 인간 섬유아세포 확장을 촉진하기 위한 자가 혈소판 풍부 혈장 생산

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...