Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering og Comprehensive Cancer Center ved The Ohio State University. Data som presenteres i denne rapporten kom fra bilder behandlet ved hjelp av Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) tilgjengelig på Campus Microscopy and Imaging Facility, The Ohio State University. Dette anlegget støttes delvis av stipendP30 CA016058, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Forfatterne erkjenner de friske frivillige som vennlig donerte sitt blod. Blodprøver ble innhentet etter informert frivillig samtykke i henhold til institusjonell gjennomgang styret (IRB) protokollen #2018H0268 gjennomgått av Biomedical Sciences Committee ved The Ohio State University.
1. Mikrofabrikasjon av biopartikkel mikroarray
<ol><li>Bruk standard fotlitografiprosedyrer, generer hovedsilisiumwaferen.<ol>
<li>Generer et bevis på ønsket design ved hjelp av en dataassistert design (CA...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Vi utviklet en mikrostemplingsplattform for å generere ensartede arrayer av biopartikler for å stimulere in vitro nøytrofil sverm. Den in vitro natur vår plattform tillater oss å omgå komplikasjoner som oppstår med in vivo svermende eksperimenter, nemlig den dårlige evnen til å analysere meklere utgitt av svermende nøytrofiler5. I tillegg utføres in vivo-modeller vanligvis i gnagere11,12,13<sup...

Nøytrofiler, den mest rikelig hvite blodlegemer i blodet1, får oppmerksomhet som potensielle diagnostiske og terapeutiske mål2,3 fordi de kan være involvert i en rekke medisinske tilstander inkludert gikt4, sepsis3, traumer5,6, kreft1,7,8, og ulike autoimmune sykdommer5,9. Nøytrofil svermer er en flertrinns, tett regulert prosess med en kompleksitet som gjør det til et spesielt interessant fokus på studie5,10,11. Under svermende isolerer nøytrofiler et sted for betennelse fra det omkringliggende friske vevet5,10,11. Riktig regulering av nøytrofil swarming er avgjørende for å fremme sårheling og til slutt betennelse oppløsning5,12. Nøytrofil svermer har primært blitt studert in vivo i gnager12,13,14,15 og sebrafisk10,11,12,15 modeller. Men arten av disse in vivo dyremodeller gir opphav til begrensninger5. For eksempel er meklerne utgitt av nøytrofiler under svermer ikke lett tilgjengelig for analyse5. I tillegg er det mange potensielle kilder for en gitt mekler in vivo, så et in vivo-eksperiment må introdusere en genetisk mangel for å hemme cellulær produksjon og / eller interaksjon for å undersøke rollen til den mekleren i en gitt prosess13. Et in vitro eksperiment omgår denne komplikasjonen ved å aktivere nøytrofil observasjon uten sammenheng med flere celler. I tillegg er forskning som beskriver menneskelig nøytrofil koordinert migrasjon begrenset16. På en in vitro-svermende plattform kan menneskelige nøytrofiler analyseres direkte. En in vitro swarming plattform kan utvide på kunnskapen fra in vivo studier ved å gi muligheter til å fylle hullene igjen av begrensningene i in vivo studier.
For å løse behovet for en in vitro-plattform som etterligner in vivo nøytrofil sverm, utviklet vi en mikrostemplingsplattform som gjør oss i stand til å mønstre biopartikkelmikroarrayer som stimulerer nøytrofil svermpå en romlig kontrollert måte. Vi genererer biopartikkelmikroarrayer på glasssklier i en totrinnsprosess. For det første bruker vi mikrostempling for å generere en mikroarray av kationiske polyelektrolyttflekker (CP). For det andre legger vi til en løsning av biopartikler som holder seg til CP-flekkene via elektrostatisk interaksjon. Ved først å mønstre CP-laget, kan vi selektivt mønstre negativt ladede biopartikler for å generere ønsket nøytrofil svermende mønster. Det positivt ladede laget holder de negativt ladede biopartiklene gjennom det kraftige vasketrinnet som fjerner biopartiklene fra områdene på glasssklien som ikke har CP. I tillegg er CP som brukes her, en kopolymer av akrylamid og kvartærisert kationisk monomer, biokompatibel, så det induserer ikke et svar fra nøytrofiler. Den har en svært høy overflateladning som immobiliserer mikron-størrelse biopartikler til glasslysbildet, og dermed hemmer nøytrofiler fra å fjerne partiklene fra mønstret posisjon på glasslysbildet. Dette resulterer i biopartikkelklynger arrangert i en mikroarray. Da vi la nøytrofiler til mikroarrayet, dannet de stabile svermer rundt biopartikkelklyngene. Gjennom sporing nøytrofil migrasjon, fant vi at svermende nøytrofiler aktivt migrere mot biopartikkelklynger. Videre brukte vi denne plattformen til å analysere visse meklere som nøytrofiler slipper under sverm. Vi fant 16 meklere som er differensialt uttrykt under sverm. Deres konsentrasjoner følger tre generelle trender over tid: økning, reduksjon eller pigg. Vår in vitro nøytrofil svermende plattform forenkler analysen av romlig kontrollert menneskelig nøytrofil sverm, samt innsamling og analyse av meklere utgitt av nøytrofil sverm. I en tidligere publikasjon viste vi at pasienter med visse medisinske tilstander (traumer, autoimmun sykdom og sepsis), hadde nøytrofiler som fungerte annerledes enn de fra friske donorer5. I fremtidige forskningsstudier kan plattformen vår brukes til å analysere nøytrofilfunksjon blant en rekke pasientpopulasjoner. Denne plattformen kan kvantitativt analysere den komplekse koordineringen som er involvert i nøytrofil oppvarming. Ytterligere studier kan gjøres for å gi innsikt i nøytrofilfunksjonen til en bestemt pasientpopulasjon eller nøytrofil respons på et patogen av interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

Nøytrofil svermer er en samarbeidsprosess der nøytrofiler forsegler et infeksjonssted og fremmer vevsomorganisering. Svermer har klassisk blitt studert in vivo i dyremodeller som viser karakteristiske mønstre for cellemigrasjon. In vivo-modellene har imidlertid flere begrensninger, inkludert intercellulære meklere som er vanskelige å få tilgang til og analysere, samt manglende evne til å analysere menneskelige nøytrofiler direkte. På grunn av disse begrensningene er det behov for en in vitro-plattform som studerer svermer med menneskelige nøytrofiler og gir enkel tilgang til molekylære signaler som genereres under sverming. Her brukes en mikrostemplingsprosess med flere trinn til å generere en biopartikkelmikroarray som stimulerer svermen ved å etterligne en in vivo-infeksjon. Biopartikkelmikroarrayet induserer nøytrofiler for å sverme på en kontrollert og stabil måte. På mikroarray øker nøytrofiler i hastighet og danner stabile svermer rundt biopartikkelklynger. I tillegg ble supernatant generert av nøytrofiler analysert og 16 proteiner ble oppdaget å ha blitt differensialt uttrykt i løpet av svermer. Denne in vitro svermende plattformen forenkler direkte analyse av nøytrofil migrasjon og proteinfrigjøring på en reproduserbar, romlig kontrollert måte.

Når nøytrofiler legges til biopartikkelmikroarrayet, blir nøytrofiler som kontakter biopartikkelklyngene aktivert og starter den svermende responsen. Biopartikkelmikroarrayet ble validert ved hjelp av time-lapse fluorescerende mikroskopi for å spore nøytrofil migrasjon mot biopartikkelklyngene (Video S1). Migreringen av individuelle nøytrofiler kjerner spores når de migrerer mot biopartikkelklyngen. Når nøytrofiler når biopartikkelklyngen, overlapper kjernene med andre kjerner i klyngen. Dermed...

Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Denne protokollen genererer biopartikkelmikroarrayer som gir romlig kontrollert nøytrofil oppvarming. Det gir enkel tilgang til meklerne som nøytrofiler slipper under migrasjon og gir mulighet for kvantitativ bildeanalyse.

Biopartikkel Mikroarrayer for kjemotaktisk og molekylær analyse av human nøytrofil svermer in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Denne protokollen er viktig fordi den tillater en in vitro analyse av nøytrofilsverming, noe som overvinner mange begrensninger av vår nåværende manglende evne til å eksperimentere. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir enkel tilgang til de utskillede cytokinene og lipidmeklerne som nøytrofiler frigjør under sverm og gir mulighet for kvantitativ bildeanalyse. Mens vi brukte denne teknikken til nøytrofiler, kan den utvides til å analysere migreringen av andre hvite blodlegemer som monocytter og T-celler.Begynn med å forberede en 1,6 mg per milliliter kationisk polyelektrimitt, eller CP-løsning, ved å legge riktig mengde CP pulver til vann og blande det på røreplaten over natten eller til alle faste stoffer er oppløst. Om ønskelig kan løsningen gjøres fluorescerende ved å tilsette poly-L-lysin merket med FITC. Generer master silisium wafer ved hjelp av standard fotolitografi prosedyrer.Designet som brukes her er en fire og fire milliliter rektangulære rekke på 30 mikrometer diameter fylt inn sirkler, med en 150 mikrometer senter for å sentrere avstand, men det kan endres som ønsket for ulike applikasjoner. Spin-coat et 40 mikrometer tykt lag med negativ fotoresist på en silisiumwafer. Stek deretter wafer på 65 grader Celsius i fem minutter.Og 95 grader Celsius i 10 minutter. Utsett wafer til UV-lys gjennom en krom fotomaske med 150 til 160 millijoules per centimeter kvadrert. Stek wafer igjen på 65 grader Celsius i fem minutter og 95 grader Celsius i 10 minutter.Deretter senker du den ned i fotoresistutvikler i 10 minutter. Og skyll den med isopropylalkohol. Mønsteret skal nå være synlig på wafer.Bland deretter et 10 til ett forhold mellom polydimetylsiloxane, eller PDMS, prepolymer og dets herdemiddel. Og hell den usikrede blandingen over master wafer i en petriskål. Vakuum behandle den usikrede PDMS blandingen til ingen luftbobler er til stede.Deretter kurere det over natten på 65 grader Celsius. På neste dag, bruk en skalpell for å kutte rundt utsiden av den mønstrede delen av wafer. Og fjern sakte den herdede PDMS-skiven, og legg den på et rent skjærebrett med den mønstrede siden vendt opp.Punch ut individuelle frimerker fra PDMS skive med en åtte millimeter biopsi punch og plassere hvert stempel med forsiden ned på teipen for å fjerne rusk. Med disse frimerkene vendt opp, prime hvert stempel med 100 mikroliter av pre-forberedt CP løsning, slik at ingen luftbobler dannes mellom løsningen og stempelet. Deretter inverterer du frimerkene på et lag med CP-løsning og fjerner dem etter en time.Dab hvert vått stempel med forsiden ned på et rent glass lysbilde seks til åtte ganger for å fjerne overflødig væske. Deretter vakuum behandle frimerker i ett til to minutter. Hold en åtte brønn, åtte millimeter diameter bilderomsr på toppen av et rent glass lysbilde som en guide for stempel plassering.Plasser et stempel med forsiden ned på glasssklien i midten av hver brønn av bilderommet. Plasser deretter en 5,6 gram balansert vekt på toppen av hvert stempel og la 10 minutter for stempling. Fjern vektene og frimerkene fra lysbildet og la CP-laget tørke ved romtemperatur i 24 timer før du legger til biopartikler.Hvis CP er merket med FITC, må du kontrollere effektiviteten av stemplingen med et fluorescerende mikroskop. Klipp en tom PDMS skive til størrelsen på bilderomsr og bruke åtte millimeter biopsi punch for å skape brønner i PDMS som samsvarer med brønnene av avstandss avstandss avstandssedlene. Fest deretter PDMS-platen til glasslysbildet.Tin en oppløsning av biopartikler og fortynne den til 500 mikrogram per milliliter i vann til injeksjon. Tilsett 100 mikroliter biopartikkelløsning til hver PDMS godt på glasssklie og rock lysbildet i 30 minutter. Skyll brønnene grundig med vann og kontroller mønsteret på lysbildet med et fluorescerende mikroskop.Biopartikkelmikroarrayet kan lagres i et støvfritt miljø ved fire grader Celsius i opptil tre måneder. Forbered cellene ved å bruke dem på nytt på 7,5 ganger 10 til de femte cellene per milliliter i IMDM med 0,4% humant serumalbumen. Legg til 100 mikroliter av suspensjonen til en PDMS-brønn som inneholder biopartikkelmikroarrayet, og pass på at cellefjæringen er konveks over toppen av PDMS-brønnen og ikke inneholder noen bobler.Forsegle brønnen med en 12 millimeter diameter deksel slip og trykk ned forsiktig med pinsett slik at overflødig celle suspensjon rømmer til kanten av brønnen, og deretter bruke et vev for å fjerne overflødig. For å se for deg cellene, last mikropartikkelmatrisen med celler på den levende cellebildestasjonen til et mikroskop utstyrt med en burinkubator satt til 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 90% relativ fuktighet. Bruk tidsforløp, fluorescerende og lysfeltmikroskopi til å ta opp bilder ved 10X forstørrelse hvert 10.Inkuber nøytrofile i brønnene med biopartikler ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i tre timer, og ta prøver på ønskede tidspunkter. Bruk et lyst feltmikroskop for å bekrefte at svermer dannes på mikroarrayet. Samle hele volumet av supernatant av en enkelt brønn, og last den inn i en 0,45 mikrometer sentrifuge filterrør, sørg for å analysere hver gang punkt i triplicate.Sentrifuger rørene ved 190 ganger G og 20 grader Celsius i fem minutter, og samle det filtrerte volumet. Oppbevar deretter prøvene ved minus 80 grader Celsius til behandlingstid. Når du prøver denne protokollen, samarbeid med fotoresisten og utvikleren i røykhetten.Ha en IRB godkjent protokoll på plass før du tar blod fra menneskelige givere. Husk at materialer avledet fra humant blod er BSL2. Når nøytrofiler legges til biopartikkelmikroarray, blir nøytrofiler som kontakter biopartikleklyngene aktivert og initierer den svermende responsen.Biopartikkelmikroarrayet ble validert ved hjelp av tidsforløp fluorescerende mikroskopi for å spore nøytrofile migrering mot biopartikleklyngene. Stabile nøytrofile svermer dannes rundt hver klynge etter 30 til 60 minutters eksponering. Derimot viser nøytrofiler ikke kollektiv migrasjon i fravær av biopartiklerklynger.Fluorescensintensiteten av fargede nøytrofile kjerner ble brukt til å fastslå at den gjennomsnittlige svermstørrelsen rundt biopartikleklyngene var ca. 1490 mikrometer kvadrert. I fravær av klynger forble fluorescens av en gitt interesseregion konstant over tid. Spor av nøytrofilmigrasjon viser at nøytrofiler konvergerte på en biopartikkelklynge når man var til stede, men ingen konvergens ble observert i kontrollsystemet.Hastigheten på svermende og ikke-aktiverte nøytrofiler ble målt, og en statistisk signifikant forskjell i hastighetsfordelingene ble funnet. Gjennomsnittshastigheten for svermende nøytrofiler var 20,6 mikrometer per minutt, mens gjennomsnittshastigheten for kontroll nøytrofiler var to mikrometer per minutt. Konsentrasjonene av 16 proteiner som nøytrofiler frigjør under sverming ble analysert over tid.10 proteiner økt i konsentrasjon. To redusert. Og de resterende fire økte i løpet av den første timen av sverm, men deretter redusert.Mens du utfører denne prosedyren, sørg for at alt er rent og at frimerkene dine tørkes riktig, da disse er avgjørende for vellykket mønster av bakterielle partikler. Utviklingen av denne teknikken vil gjøre det mulig for forskere å utforske nye spørsmål innen nøytrofilsverming, inkludert hvordan frie meklere og ekstracellulære vesikler er involvert i nøytrofil intercellulær kommunikasjon.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Montering av Semi-kunstig Molecular Machine og dens bruk for påvisning av DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Kultur System for In vitro Analyse og biomateriale Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tilpasning av electro prosess for å gi tre unike miljøer for en Tri-lag<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Utarbeidelse og analyse av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensjonal brystkreft Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Produksjon av autologt blodplaterikt plasma for å øke ekspansjon av human fibroblast in vitro

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

I Vitro Modell av Human Kutan Hypertrofisk Arrdannelse ved hjelp av makromolekylær trengsel

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...