Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансированием со стороны Уильяма Г. Лоури Департамента химической и биомолекулярной инженерии и Всеобъемлющего онкологического центра в Университете штата Огайо. Данные, представленные в этом докладе, были получены из изображений, обработанных с помощью Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane), доступных в Campus Microscopy and Imaging Facility, Университет штата Огайо. Этот объект поддерживается частично грантом P30 CA016058, Национальным институтом рака, Bethesda, MD.

Авторы признают здоровых добровольцев, которые любезно сдали свою кровь. Образцы крови были получены после информированного согласия добровольцев в соответствии с протоколом институционального совета по обзору (IRB) #2018H0268 рассмотрены Комитетом по биомедицинским наукам при Университе...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Мы разработали платформу микроштамповки для генерации однородных массивов биочастиц для стимулирования роятся в пробирке нейтрофила. In vitro характер нашей платформы позволяет нам обойти осложнения, которые возникают с in vivo роятся эксперименты, а именно плохая способность анализирова?...

Нейтрофилы, наиболее распространенные белые кровяные клетки в крови1, приобретают внимание в качестве потенциальных диагностических и терапевтических целей2,3, потому что они могут быть вовлечены в различные медицинские условия, включая подагра4, сепсис3, травма5,рак1,7,8, и различные аутоиммунные заболевания5,9. Нейтрофил роятся многоступенчатый, жестко регулируется процесс со сложностью, что делает его особенно интересным фокусом исследования5,10,11. Во время роя, нейтрофилы изолируют участок воспаления от окружающих здоровыхтканей 5,10,11. Правильная регуляция нейтрофила роя имеет важное значение для содействия заживлению ран и в конечном счете, разрешение воспаления5,12. Нейтрофил роя в первую очередь изучался в vivo у грызунов12,13,14,15 и зебрафиш10,11,12,15 моделей. Тем не менее, характер этих моделей in vivo животных приводит к ограничениям5. Например, посредники, выпущенные нейтрофиловами во время роя, не так легко доступны для анализа5. Кроме того, Есть много потенциальных источников для данного посредника in vivo, так что эксперимент in vivo должен ввести генетический дефицит, чтобы ингибировать клеточного производства и / или взаимодействия для того, чтобы исследовать роль этого посредника в данном процессе13. Эксперимент in vitro обходит это осложнение, позволяя наблюдение за нейтрофилами без контекста дополнительных клеток. Кроме того, исследования, описывающие человека нейтрофил скоординированной миграцииограничено 16. На платформе витро роятся, человека нейтрофилов может быть непосредственно проанализированы. Платформа in vitro роя может расширить знания, полученные в результате исследований in vivo, предоставив возможности для заполнения пробелов, оставленных ограничениями исследований in vivo.
Для удовлетворения потребности в платформе in vitro, которая имитирует в ививо-нейтрофил роятся, мы разработали платформу микроштампов, которая позволяет нам узор биочастицы микроаррей, которые стимулируют нейтрофил роятся в пространственно контролируемым образом. Мы генерируем биочастицы микроаррей на стеклянных слайдах в двухэтапном процессе. Во-первых, мы используем микроштамповку для создания микроарра пятенного полиэлектролита (CP). Во-вторых, мы добавляем раствор биочастиц, которые придерживаются cp пятна через электростатическое взаимодействие. При первом узоре слое CP, мы можем выборочно шаблон отрицательно заряженных биочастиц для создания желаемого нейтрофила роя картины. Положительно заряженный слой удерживает отрицательно заряженные биочастицы через энергичную шаг стирки, которая удаляет биочастицы из областей на стеклянной горке, которые не имеют CP. Кроме того, CP используется здесь, кополимер акриламид и quaternized cationic мономер, является биосовместимым, так что это не вызывает реакцию от нейтрофилов. Он имеет очень высокий поверхностный заряд, который обездвиживает биочастицы размером с микрон к стеклянной горке, тем самым препятствуя нейтрофилу нейтрофилов удалять частицы из узорчатого положения на стеклянном слайде. Это приводит к биочастий кластеров, расположенных в microarray. Когда мы добавили нейтрофилов в микроаррей, они образовали стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. С помощью отслеживания миграции нейтрофилов мы обнаружили, что роятся нейтрофилы, активно мигрирующие в кластеры биочастиц. Кроме того, мы использовали эту платформу для анализа некоторых посредников, которые нейтрофилы высвобождают во время рояния. Мы нашли 16 посредников, которые дифферепрециально выражены во время роя. Их концентрации следуют трем общим тенденциям с течением времени: увеличение, уменьшение или всплеск. Наша платформа in vitro neutrophil swarming облегчает анализ пространственно контролируемого кишат нейтрофила, а также сбор и анализ посредников, выпущенных нейтрофилами. В предыдущей публикации, мы показали, что пациенты с определенными заболеваниями (травма, аутоиммунные заболевания и сепсис), были нейтрофилы, которые функционировали иначе, чем у здоровых доноров5. В будущих исследованиях, наша платформа может быть использована для анализа функции нейтрофилов среди различных популяций пациентов. Эта платформа может количественно проанализировать сложную координацию, связанную с нейтрофил роя. Дополнительные исследования могут быть сделаны, чтобы дать представление о нейтрофильной функции конкретной популяции пациентов или нейтрофил ответ на патоген, представляющий интерес.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

Нейтрофил роятся совместно процесс, с помощью которого нейтрофилы запечатать сайт инфекции и содействовать реорганизации тканей. Рой классически изучался в vivo в животных моделях, показывающих характерные закономерности миграции клеток. Однако модели in vivo имеют ряд ограничений, в ключая межклеточные посредники, которые трудно доступны и анализируют, а также неспособность непосредственно анализировать нейтрофилы человека. Из-за этих ограничений, существует необходимость в in vitro платформы, которая изучает роятся с человеческими нейтрофилов амии и обеспечивает легкий доступ к молекулярным сигналам, генерируемым во время роя. Здесь многоступенчатый процесс микроштамповки используется для генерации микроаря биочастиц, который стимулирует рой, имитируя инфекцию in vivo. Биочастица microarray индуцирует нейтрофилов роиться в контролируемой и стабильной образом. На микроарере нейтрофилы увеличивают скорость и образуют стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. Кроме того, был проанализирован супернатант, генерируемый нейтрофиловами, и было обнаружено, что 16 белков были дифференциально выражены в течение роя. Эта платформа in vitro роя облегчает прямой анализ миграции нейтрофилов и высвобождения белка воспроизводимым, пространственно контролируемым образом.

Когда нейтрофилы добавляются в микроаррей биочастиц, нейтрофилы, которые контактируют с скоплениями биочастиц, активируются и инициируют реакцию роятся. Биочастица microarray была проверена с помощью замедленного флуоресцентной микроскопии для отслеживания миграции нейтрофилов к скопл?...

Watch this Scientific Journal Video about Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro at JoVE.com

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Этот протокол генерирует биочастицы микроаррей, которые обеспечивают пространственно контролируемых нейтрофилов роятся. Он обеспечивает легкий доступ к посредникам, которые нейтрофилы высвобождают во время миграции, и позволяет проводить количественный анализ изображений.

Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет в пробирке анализ нейтрофила роятся, что преодолевает многие ограничения нашей нынешней неспособности экспериментировать. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает легкий доступ к секретным цитокинов и липидных посредников, что нейтрофилов релиз во время роятся и позволяет количественного анализа изображений. Хотя мы применили этот метод к нейтрофилов, он может быть расширен для анализа миграции других белых кровяных клеток, как моноциты и Т-клетки.Начните с подготовки 1,6 миллиграмма на миллилитр катионные полиэлектролита, или CP раствор, добавив надлежащее количество порошка CP в воду и смешивая его на пластине перемешать на ночь или до тех пор, пока все твердые тела растворяются. При желании раствор можно сделать флуоресцентным, добавив поли-L-лизин, помеченный FITC. Создайте мастер кремниевых пластин с использованием стандартных процедур фотолитографии.Конструкция, используемая здесь четыре на четыре миллилитров прямоугольный массив диаметром 30 микрометров заполнены в кругах, с 150 микрометровый центр в центр интервала, но она может быть изменена по желанию для различных приложений. Спин-пальто 40 микрометров толщиной слой отрицательного фоторезистер на кремниевой пластины. Затем выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут.И 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Выставить пластину на ультрафиолетовый свет через хромированную фотомаску с 150 до 160 миллиджоулей на сантиметр в квадрате. Выпекать снова при температуре 65 градусов по Цельсию в течение пяти минут и 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.Затем погрузите его в разработчика фоторезистер в течение 10 минут. И промыть его изопропиловым спиртом. Шаблон теперь должен быть виден на пластине.Далее, тщательно смешать 10 к одному соотношению полидиметилсилоксана, или PDMS, преполимер и его лечебное средство. И налейте неохвекаемую смесь на мастер-вафельку в чашке Петри. Вакуумные лечения неохлестой смеси PDMS до тех пор, пока пузырьки воздуха присутствуют.Затем вылечить его на ночь при 65 градусах по Цельсию. На следующий день используйте скальпель, чтобы разрезать внешний вид узорчатой части пластины. И медленно удалите вылеченную плиту PDMS, поместив ее на чистую разделочатую доску с узорчатой стороной вверх.Punch из отдельных марок из плиты PDMS с восемью миллиметрами биопсии удар и место каждой марки лицом вниз на клейкой лентой для удаления мусора. С этими марками вверх, премьер каждой марки с 100 микролитров заранее подготовленного решения CP, гарантируя, что не воздушные пузыри образуются между раствором и печатью. Затем переверните марки на слой раствора CP и удалите их через час.Dab каждый мокрый штамп лицом вниз на чистую стеклянную горку шесть-восемь раз, чтобы удалить избыток жидкости. Затем вакуум обработать марки в течение одной-двух минут. Придерживайтесь восемь хорошо, восемь миллиметров диаметром изображения пространства на вершине чистого стекла слайд в качестве руководства для размещения штампа.Поместите штамп лицом вниз на стеклянную горку в центре каждой колодец изображения космонавта. Затем поместите 5,6 грамма сбалансированного веса на верхней части каждой марки и позволяют 10 минут для штамповки. Удалите веса и марки со слайда и дайте слою CP высохнуть при комнатной температуре в течение 24 часов перед добавлением биочастиц.Если CP помечен FITC, проверьте эффективность штамповки с флуоресцентным микроскопом. Вырежьте пустую плиту PDMS до размера промокера изображения и используйте восьмимиллиметровый пунш биопсии для создания скважин в PDMS, которые выравниваются с колодцами спейсера. Затем примими плиту PDMS к стеклянной горке.Оттепель раствор биочастиц и разбавить его до 500 микрограмм на миллилитр в воде для инъекций. Добавьте 100 микролитров раствора биочастиц к каждому PDMS хорошо на стеклянной горке и качайте горку в течение 30 минут. Тщательно промыть колодцы водой и проверить рисунок на слайде с флуоресцентным микроскопом.Микроарей биочастицы можно хранить в безпыльной среде при четырех градусах Цельсия в течение трех месяцев. Подготовьте клетки путем повторного перерасхода их в 7,5 раза от 10 до пятой клетки на миллилитр в IMDM с 0,4%человеческой сыворотки альбумена. Добавьте 100 микролитров подвески в PDMS, хорошо содержащий микроаррей биочастицы, убедившись, что подвеска клетки выпуклые поверх PDMS хорошо и не содержит пузырьков.Печать хорошо с 12 миллиметров в диаметре крышки скольжения и нажмите вниз осторожно с пинцетом, чтобы избыток подвески клетки убегает к краю хорошо, а затем использовать ткань, чтобы удалить избыток. Для изображения клеток загрузите массив микрочастиц клетками на станции визуализации живых клеток микроскопа, оснащенного инкубатором клетки, установленный на 37 градусов по Цельсию, 5%углекислым газом и 90% относительной влажностью. Используйте промежуток времени, флуоресцентную и яркую микроскопию поля для записи изображений при увеличении 10X каждые 10 секунд на 405 нанометров, 594 нанометров и ярком поле.Инкубировать нейтрофилов в скважинах с биочастицами при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение трех часов, принимая образцы в нужные моменты времени. Используйте яркий полевой микроскоп, чтобы убедиться, что стаи образуются на микроаррее. Соберите весь объем супернатанта одной колодец и загрузите его в 0,45 микрометровую сантиметровую фильтровальную трубку, убедившись, что каждый раз анализируйте каждую точку времени в тройном.Центрифуга труб при 190 раз G и 20 градусов по Цельсию в течение пяти минут, и собирать фильтрованный объем. Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до времени обработки. При попытке этого протокола, работа с photoresist и разработчиком в дым капот.Иметь IRB утвержденный протокол на месте, прежде чем принимать кровь от человеческих доноров. Помните, что материалы, полученные из человеческой крови BSL2. Когда нейтрофилов добавляются в микроаррей биочастиц, нейтрофилов, которые контактируют с кластерами биочастиц, активизируются и инициируют рой реакции.Биочастицы микроархей был проверен с помощью промежуток времени флуоресцентной микроскопии для отслеживания миграции нейтрофилов к биочастицы кластеров. Стабильные нейтрофиловые стаи образуются вокруг каждого скопления через 30-60 минут воздействия. Нейтрофилов, напротив, не показывает коллективную миграцию при отсутствии биочастиц.Интенсивность флуоресценции окрашенных нейтрофиловых ядер была использована для определения того, что средний размер роя вокруг кластеров биочастиц составляет около 1490 микрометров в квадрате. В отсутствие кластеров флуоресценция того или иного региона, представляющих интерес, оставалась неизменной с течением времени. Следы миграции нейтрофилов показывают, что нейтрофилов сходились на скоплении биочастиц, когда один присутствовал, но не было замечено сближения в системе управления.Измерялась скорость роя и неактивированных нейтрофилов, и была обнаружена статистически значимая разница в распределении скорости. Средняя скорость роятся нейтрофилов составила 20,6 микрометра в минуту, в то время как средняя скорость контроля нейтрофилов составила два микрометра в минуту. Концентрации 16 белков, которые нейтрофилов высвобождают во время роя, были проанализированы с течением времени.10 белков увеличились в концентрации. Два уменьшились. А остальные четыре увеличились в течение первого часа роятся, но уменьшилась после этого.Выполняя эту процедуру, убедитесь, что все чисто и ваши марки высушиваются должным образом, так как они необходимы для успешного узора бактериальных частиц. Разработка этого метода позволит исследователям изучить новые вопросы в области роятся нейтрофилов, в том числе, как свободные посредники и внеклеточные пузырьки участвуют в нейтрофиловой межклеточной коммуникации.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

В пробирке Ассамблеи Semi-искусственные молекулярные машины и его использование для обнаружения повреждений ДНК

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Шелковый Фильм культуры система В пробирке Анализ и Дизайн биоматериала

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Раздражение глаз тест (СПЭ) для идентификации опасности глазных Раздражает химических веществ с использованием реконструированного человеческой роговицы, как Эпителиальный (RHCE) тканей Модель

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Адаптация процесса электропрядения чтобы обеспечить три уникальных условиях для Tri-слоистые<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель дыхательных путях стены

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Получение и анализ<em&gt; In Vitro</em&gt; Трехмерное карциному груди Суррогаты

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Тракция Микроскопия интегрирована с микрофлюиди для хемотаксической коллективной миграции

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

Получение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы для усиления экспансии фибробластов человека in vitro

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

В vitro Модель человека кожные гипертрофические рубцы с помощью макромолекулярной crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...