Name: bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos del Departamento William G. Lowrie de Ingeniería Química y Biomolecular y el Centro Integral del Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio. Los datos presentados en este informe provienen de imágenes procesadas con Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane) disponibles en el Centro de Microscopía e Imagen del Campus, La Universidad Estatal de Ohio. Esta instalación es apoyada en parte por la subvención P30 CA016058, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, MD.

Los autores reconocen a los voluntarios sanos que amablemente donaron su sangre. Los especímenes de sangre se obtuvieron después del consentimiento informado de los voluntarios de acuerdo con el protocolo de la Junta de Revisión Institucional (IRB) #2018H0268 revisado por el Comité de Ciencias Biomédicas de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Microfabricación de microarray de biopartículas
<ol><li>Usando procedimientos de fotolitografía estándar, genere la oblea de silicio maestra.<o...

<ol>
	<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer:+neutral+no+more.">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li><li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Platform+for+Measuring+Neutrophil+Chemotaxis+from+Unprocessed+Whole+Blood.">Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).</li><li>Ellett, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+sepsis+from+a+drop+of+blood+by+measurement+of+spontaneous+neutrophil+motility+in+a+microfluidic+assay.">Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay.</a> Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).</li><li>Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Gout:+Observations+over+a+Half-Century.">Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century.</a> The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).</li><li>Re&#225;tegui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+arrays+for+the+profiling+of+start+and+stop+signals+coordinating+human-neutrophil+swarming.">Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).</li><li>Morgan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+infection+in+the+trauma+patient.">Risk factors for infection in the trauma patient.</a> Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression.">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. 566, 553-557 (2019).</li><li>Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+cancer.">Neutrophils in cancer.</a> Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).</li><li>Grayson, P. C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Bench:+Neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+highlight+novel+aspects+of+innate+immune+system+involvement+in+autoimmune+diseases.">At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases.</a> Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+eye+of+the+neutrophil+swarm--navigation+signals+that+bring+neutrophils+together+in+inflamed+and+infected+tissues.">In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).</li><li>Kienle, K., L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarming:+an+essential+process+of+the+neutrophil+tissue+response.">Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response.</a> Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).</li><li>de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair:+going+forward+in+reverse.">Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo.">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li><li>L&#228;mmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+Arraying+neutrophils+in+swarms.">Cell migration: Arraying neutrophils in swarms.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).</li><li>Powell, D. R., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+Tumor+Microenvironment.">Neutrophils in the Tumor Microenvironment.</a> Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).</li><li>Uribe-querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+Cancer:+Two+Sides+of+the+Same+Coin.">Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin.</a> Journal of Immunology Research. 2015, (2015).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+Key+mediators+of+microbe+detection.">Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection.</a> Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).</li><li>Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+fungal+pathogens+by+toll-like+receptors.">Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors.</a> Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).</li><li>Thomas, C. J., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+receptor+function+in+neutrophils.">Pattern recognition receptor function in neutrophils.</a> Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).</li><li>Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TLRs+in+neutrophil+activation.">The role of TLRs in neutrophil activation.</a> Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).</li><li>Tan, S. Y., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+migration+in+inflammation:+intercellular+signal+relay+and+crosstalk.">Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).</li><li>Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+involvement+of+cyclooxygenase+isoforms+in+neutrophil+migration+in+vivo+and+in+vitro.">Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).</li><li>Afonso, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTB4+Is+a+Signal-Relay+Molecule+during+Neutrophil+Chemotaxis.">LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).</li><li>Gounni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Chemorepellent+Semaphorin+3E+Negatively+Regulates+Neutrophil+Migration+In+Vitro+and+In+Vivo.">In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo.</a> The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).</li><li>Dumic, J., Dabelic, S., Fl&#246;gel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3:+An+open-ended+story.">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li><li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart.">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li></ol>

Desarrollamos una plataforma de microsello para generar matrices uniformes de biopartículas para estimular el enjambre de neutrófilos in vitro. La naturaleza in vitro de nuestra plataforma nos permite eludir las complicaciones que surgen con los experimentos in vivo enjambre, a saber, la mala capacidad para analizar los mediadores liberados por los neutrófilos enjambres5. Además, los modelos in vivo se realizan típicamente en roedores11,12,...

Los neutrófilos, el glóbulo blanco más abundante en el torrente sanguíneo1, están ganando atención como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas2,3 porque pueden estar involucrados en una variedad de condiciones médicas incluyendo gota4, sepsis3, trauma5,6, cáncer1,7,8, y diversas enfermedades autoinmunes5,9. El enjambre de neutrófilos es un proceso multietapa, estrechamenteregulado con una complejidad que lo convierte en un foco particularmente interesante de estudio5,10,11. Durante el enjambre, los neutrófilos aíslan un sitio de inflamación del tejido sano circundante5,10,11. La regulación adecuada del enjambre de neutrófilos es esencial para promover la cicatrización de heridas y, en última instancia, la resolución de inflamación5,12. El enjambre de neutrófilos se ha estudiado principalmente in vivo en roedores12,13,14,15 y pez cebra10,11,12,15 modelos. Sin embargo, la naturaleza de estos modelos animales in vivo da lugar a limitaciones5. Por ejemplo, los mediadores liberados por neutrófilos durante el enjambre no son fácilmente accesibles para el análisis5. Además, hay muchas fuentes potenciales para un mediador dado in vivo, por lo que un experimento in vivo debe introducir una deficiencia genética para inhibir la producción celular y / o la interacción con el fin de investigar el papel de ese mediador en un proceso dado13. Un experimento in vitro elude esta complicación al permitir la observación de neutrófilos sin el contexto de células adicionales. Además, la investigación que describe la migración coordinada por neutrófilos humanos es limitada16. En una plataforma de enjambre in vitro, los neutrófilos humanos pueden ser analizados directamente. Una plataforma de enjambre in vitro podría ampliar los conocimientos adquiridos a partir de estudios in vivo proporcionando oportunidades para llenar las lagunas que dejan las limitaciones de los estudios in vivo.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma in vitro que imita el enjambre de neutrófilos in vivo, desarrollamos una plataforma de microsello que nos permite patrones de microarrays de biopartículas que estimulan el enjambre de neutrófilos de una manera controlada espacialmente. Generamos microarrays de biopartículas en portaobjetos de vidrio en un proceso de dos pasos. En primer lugar, utilizamos microestampado para generar un microarray de puntos de polielectrolito catiónico (CP). En segundo lugar, añadimos una solución de biopartículas que se adhieren a los puntos CP a través de la interacción electrostática. Al crear primero el patrón de la capa CP, podemos patrón selectivo de biopartículas cargadas negativamente para generar el patrón de enjambre de neutrófilos deseado. La capa cargada positivamente contiene las biopartículas cargadas negativamente a través del vigoroso paso de lavado que elimina las biopartículas de las áreas en el tobogán de vidrio que no tienen el CP. Tiene una carga superficial muy alta que inmoviliza las biopartículas del tamaño de un micron al portaobjetos de vidrio, inhibiendo así a los neutrófilos de eliminar las partículas de la posición patrón en el portaobjetos de vidrio. Esto da como resultado racimos de biopartículas dispuestos en un microarray. Cuando añadimos neutrófilos al microarray, formaron enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. A través del seguimiento de la migración de neutrófilos, descubrimos que los neutrófilos enjambres migran activamente hacia los cúmulos de biopartículas. Además, utilizamos esta plataforma para analizar ciertos mediadores que los neutrófilos liberan durante el enjambre. Encontramos 16 mediadores que se expresan diferencialmente durante el enjambre. Sus concentraciones siguen tres tendencias generales a lo largo del tiempo: aumento, disminución o pico. Nuestra plataforma de enjambre de neutrófilos in vitro facilita el análisis del enjambre de neutrófilos humanos controlado espacialmente, así como la recopilación y análisis de mediadores liberados por enjambre de neutrófilos. En una publicación anterior, demostramos que los pacientes con ciertas condiciones médicas (trauma, enfermedad autoinmune y sepsis), tenían neutrófilos que funcionaban de manera diferente a los de los donantes sanos5. En futuros estudios de investigación, nuestra plataforma podría utilizarse para analizar la función de neutrófilos entre una variedad de poblaciones de pacientes. Esta plataforma puede analizar cuantitativamente la compleja coordinación involucrada en el enjambre de neutrófilos. Se pueden realizar estudios adicionales para proporcionar información sobre la función neutrófila de una población de pacientes específica o la respuesta de neutrófilos a un patógeno de interés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#34;The Big Easy&#34; EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>18001</td>
			<td>Magnet to use with neutrophil isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td>777057437 / 77057343</td>
			<td>Okolab cage incubator for temperature and CO2 control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>17957</td>
			<td>Kit for immunomagnetic negative selection of human neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA54010 / MEF55037</td>
			<td>Inverted research microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli (K-12 strain) BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E2863</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag&#174; array</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 8-mm biopsy punch</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z708925</td>
			<td>To cut PDMS stamps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HetaSep</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7906</td>
			<td>Erythrocyte aggregation agent for separating buffy coat from red blood cells in fresh human blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nucleus fluorescent stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human L1000 Array</td>
			<td>Raybiotech Inc.</td>
			<td>AAH-BLG-1000-4</td>
			<td>High density array to detect 1000 human proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin (HSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5843</td>
			<td>Low endotoxin HSA, to prepare 2 % solutions in IMDM for isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbeccos&#39; Medium (IMDM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12440053</td>
			<td>To resuspend isolated neutrophils</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-EDTA tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-657-32</td>
			<td>Tubes for blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Reflective Chrome Photomask</td>
			<td>Front Range Photomask</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dimensions 5&#34; x 5&#34; x 0.09&#34; (L x W x D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Scanner</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ASCNGX00</td>
			<td>Fluorescence reader of protein patterned microdomains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Image Analsysis Software - Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>9.3.0</td>
			<td>Software for automatic cell tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiS Elements Advanced Research Software Package</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MQS31100</td>
			<td>Software for automatic live cell imaging and swarm size calculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine fluorescein isothiocyanate (PLL-FITC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3069-10MG</td>
			<td>30,000 - 70,000 MW PLL labeled with FITC, used to fluorescently label CP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecureSeal 8-well Imaging Spacer</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654008</td>
			<td>8-well, 9-mm diameter, adhesive imaging spacer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>590</td>
			<td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 ohm-cm 500 &#956;m SSP test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>Laurell</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td>Used to spincoat a 40-&#181;m layer of photoresist onto silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>2025</td>
			<td>Negative photoresist to make silicon master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td>Photoresist developer. Remove non-crosslinked SU-8 2025 from silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 (polydimethylsiloxane, PDMS)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td>2-part silicone elastomer kit for making microstamps and PDMS wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Exposure Masking System</td>
			<td>Klo&#233;</td>
			<td>UV-KUB 2</td>
			<td>Used to crosslink photoresist on silicon wafer through chrome mask with UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1287303</td>
			<td>High quality water to dilute bioparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetag 8185</td>
			<td>BASF</td>
			<td>8185</td>
			<td>Cationic polyelectrolyte (CP), powder, Copolymer of acrylamide and quaternized cationic monomer, forms &#34;inking solution&#34; for microstamping when dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Z2843</td>
			<td>Bioparticle powder, dissolve in water prior to addition to Zetag array</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioparticle microarrays for chemotactic and molecular analysis of human neutrophil swarming in vitro

El enjambre de neutrófilos es un proceso cooperativo por el cual los neutrófilos cierran un sitio de infección y promueven la reorganización de los tejidos. El enjambre se ha estudiado clásicamente in vivo en modelos animales que muestran patrones característicos de migración celular. Sin embargo, los modelos in vivo tienen varias limitaciones, incluyendo mediadores intercelulares que son difíciles de acceder y analizar, así como la incapacidad de analizar directamente a los neutrófilos humanos. Debido a estas limitaciones, es necesario una plataforma in vitro que estudia el enjambre de neutrófilos humanos y proporcione un fácil acceso a las señales moleculares generadas durante el enjambre. Aquí, un proceso de microsello de varios pasos se utiliza para generar un microarray de biopartículas que estimula el enjambre imitando una infección in vivo. El microarray de biopartículas induce a los neutrófilos a enjambre de una manera controlada y estable. En el microarray, los neutrófilos aumentan en velocidad y forman enjambres estables alrededor de los cúmulos de biopartículas. Además, se analizó el sobrenadante generado por los neutrófilos y se descubrió que 16 proteínas se expresaron diferencialmente en el transcurso del enjambre. Esta plataforma de enjambre in vitro facilita el análisis directo de la migración de neutrófilos y la liberación de proteínas de una manera reproducible y controlada espacialmente.

Cuando se añaden neutrófilos al microarray de biopartículas, los neutrófilos que contactan con los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre. El microarray de biopartículas fue validado mediante microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear la migración de neutrófilos hacia los cúmulos de biopartículas (Video S1). La migración de núcleos de neutrófilos individuales se realiza un seguimiento a medida que migran hacia el cúmulo de biopartículas. Cua...

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Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.

Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Este protocolo es significativo porque permite un análisis in vitro del enjambre de neutrófilos, que supera muchas limitaciones de nuestra incapacidad actual para experimentar. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un fácil acceso a las citoquinas y mediadores de lípidos secretados que los neutrófilos liberan durante el enjambre y permite el análisis cuantitativo de imágenes. Si bien aplicamos esta técnica a los neutrófilos, podría extenderse para analizar la migración de otros glóbulos blancos como monocitos y linfocitos T.Comience preparando una polielectrolita catiónica de 1,6 miligramos por mililitro, o solución de CP, añadiendo la cantidad adecuada de polvo de CP al agua y mezclándolo en la placa de agitación durante la noche o hasta que todos los sólidos se disuelvan. Si lo desea, la solución se puede hacer fluorescente mediante la adición de poli-L-lisina etiquetada con FITC. Genere la oblea de silicio maestro utilizando procedimientos de fotolitografía estándar.El diseño utilizado aquí es una matriz rectangular de cuatro por cuatro mililitros de círculos rellenos de 30 micrómetros de diámetro, con un centro de 150 micrómetros para el espaciado central, pero se puede modificar como se desee para diferentes aplicaciones. Recubrir una capa de 40 micrómetros de espesor de fotorresistente negativo en una oblea de silicio. Luego hornea la oblea a 65 grados Centígrados durante cinco minutos.Y 95 grados Celsius durante 10 minutos. Exponga la oblea a la luz UV a través de una fotomasca cromada con 150 a 160 mililitros por centímetro cuadrado. Hornee la oblea de nuevo a 65 grados Centígrados durante cinco minutos y 95 grados centígrados durante 10 minutos.A continuación, sumergirlo en el desarrollador de fotorresistsión durante 10 minutos. Y enjuáguelo con alcohol isopropílico. El patrón ahora debe ser visible en la oblea.A continuación, mezcle a fondo una proporción de 10 a una proporción de polidimetilsiloxano, o PDMS, prepolímero y su agente de curado. Y vierta la mezcla no curada sobre la oblea maestra en un plato de Petri. El vacío trata la mezcla DE PDMS no curada hasta que no haya burbujas de aire presentes.Luego cure durante la noche a 65 grados centígrados. Al día siguiente, usa un bisturí para cortar alrededor del exterior de la sección con patrón de la oblea. Y retire lentamente la losa de PDMS curada, colocándola en una tabla de corte limpia con el lado estampado hacia arriba.Golpee los sellos individuales de la losa PDMS con un punzón de biopsia de ocho milímetros y coloque cada sello boca abajo en la cinta adhesiva para eliminar los desechos. Con estos sellos mirando hacia arriba, ceba cada sello con 100 microlitros de la solución CP pre-preparada, asegurando que no se formen burbujas de aire entre la solución y el sello. A continuación, invierta los sellos en una capa de solución CP y retírelos después de una hora.Coloca cada sello húmedo boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio limpio de seis a ocho veces para eliminar el exceso de líquido. A continuación, tratar al vacío los sellos durante uno a dos minutos. Adherir un espaciador de imágenes de ocho pozos y ocho milímetros de diámetro en la parte superior de una diapositiva de vidrio limpio como guía para la colocación de sellos.Coloque un sello boca abajo en el portaobjetos de vidrio en el centro de cada pozo del espaciador de imágenes. A continuación, coloque un peso equilibrado de 5,6 gramos encima de cada sello y espere 10 minutos para el estampado. Retire los pesos y los sellos del portaobjetos y deje que la capa CP se seque a temperatura ambiente durante 24 horas antes de agregar biopartículas.Si el CP está etiquetado con FITC, compruebe la eficacia del estampado con un microscopio fluorescente. Corte una losa PDMS en blanco al tamaño del espaciador de imágenes y utilice el punzón de biopsia de ocho milímetros para crear pozos en el PDMS que se alineen con los pozos del espaciador. A continuación, adhiera la losa PDMS a la corredera de vidrio.Descongelar una solución de biopartículas y diluirla a 500 microgramos por mililitro en agua para inyección. Agregue 100 microlitros de solución de biopartículas a cada PDMS bien en el portaobjetos de vidrio y sacude el portaobjetos durante 30 minutos. Enjuague bien los pozos con agua y compruebe el patrón en la diapositiva con un microscopio fluorescente.La micromatástica de la biopartícula se puede almacenar en un ambiente libre de polvo a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses. Preparar las células resuspendándolas a 7,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en IMDM con 0,4% de albúmina sérica humana. Añada 100 microlitros de la suspensión a un pozo PDMS que contenga la micromatástica de biopartículas, asegurándose de que la suspensión celular sea convexa sobre la parte superior del PDMS y no contenga burbujas.Selle el pozo con un resbalón de cubierta de 12 milímetros de diámetro y presione suavemente hacia abajo con pinzas para que el exceso de suspensión celular se escape al borde del pozo, luego use un tejido para eliminar el exceso. Para crear imágenes de las células, cargue la matriz de micropartículas con células en la estación de imágenes de células vivas de un microscopio equipado con una incubadora de jaulas de 37 grados centígrados, un 5% de dióxido de carbono y un 90% de humedad relativa. Utilice microscopía de campo brillante, fluorescente y de lapso de tiempo para grabar imágenes con aumento de 10X cada 10 segundos a 405 nanómetros, 594 nanómetros y campo brillante.Incubar los neutrófilos en los pozos con biopartículas a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono durante tres horas, tomando muestras en los puntos de tiempo deseados. Utilice un microscopio de campo brillante para verificar que los enjambres se forman en el microarray. Recoger todo el volumen de sobrenadante de un solo pozo, y cargarlo en un tubo de filtro de centrífuga de 0,45 micrómetros, asegurándose de analizar cada punto de tiempo en triplicado.Centrifugar los tubos a 190 veces G y 20 grados Celsius durante cinco minutos, y recoger el volumen filtrado. A continuación, guarde las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el tiempo de procesamiento. Al intentar este protocolo, trabaje con fotorresistir y desarrollador en la campana de humos.Tener un protocolo aprobado por el IRB antes de tomar sangre de donantes humanos. Recuerde que los materiales derivados de la sangre humana son BSL2. Cuando se añaden neutrófilos a la micromatástica de la biopartícula, los neutrófilos que contactan los cúmulos de biopartículas se activan e inician la respuesta de enjambre.La micromatrices de biopartículas fue validada utilizando microscopía fluorescente de lapso de tiempo para rastrear las migraciones de neutrófilos hacia los racimos de biopartículas. Enjambres de neutrófilos estables se forman alrededor de cada cúmulo después de 30 a 60 minutos de exposición. Por el contrario, los neutrófilos no muestran migración colectiva en ausencia de cúmulos de biopartículas.La intensidad de fluorescencia de los núcleos de neutrófilos manchados se utilizó para determinar que el tamaño medio del enjambre alrededor de los racimos de biopartículas era de aproximadamente 1490 micrómetros al cuadrado. En ausencia de racimos, la fluorescencia de una región de interés determinada se mantuvo constante a lo largo del tiempo. Las pistas de migración de neutrófilos muestran que los neutrófilos convergieron en un grupo de biopartículas cuando uno estaba presente, pero no se observó convergencia en el sistema de control.Se midió la velocidad de los neutrófilos enjambres y no inactivados, y se encontró una diferencia estadísticamente significativa en las distribuciones de velocidad. La velocidad media de los neutrófilos enjambres fue de 20,6 micrómetros por minuto, mientras que la velocidad media para los neutrófilos de control fue de dos micrómetros por minuto. Las concentraciones de 16 proteínas que los neutrófilos liberan durante el enjambre se analizaron con el tiempo.10 proteínas aumentaron su concentración. Dos disminuyó. Y los cuatro restantes aumentaron durante la primera hora de enjambre, pero disminuyeron a partir de entonces.Al realizar este procedimiento, asegúrese de que todo esté limpio y sus sellos se secan correctamente, ya que estos son esenciales para el patrón exitoso de las partículas bacterianas. El desarrollo de esta técnica permitirá a los investigadores explorar nuevas preguntas en el campo del enjambre de neutrófilos, incluyendo cómo los mediadores libres y las vesículas extracelulares participan en la comunicación intercelular de neutrófilos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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