Name: investigating intestinal barrier breakdown in living organoids
Uploaded: 2020-03-26T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Tyske Forskningsfond (DFG) [KFO257, projekt 4 til M.S. og projekt 1 til C.B. FOR2438, projekt 2 til M.S. og E.N. og projekt 5 til C.B. SFB1181 projekt C05 til C.B. TRR241, projekt A06 til N.B.L. og M.S., projekt A03 til C.B., BR5196/2-1 til N.B.L. og BE3686/2 til C.B.] Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) under Det Kliniske Center Erlangen (til M.S., E.N., og M.B.), W. Lutz Stiftung (til M.S.) og Forschungsstiftung Medizin fra Det Kliniske Center Erlangen (til M.S.). Det nuværende arbejde blev udført i (delvis) opfyldelse af kravene for at opnå graden Dr. Med. af Marco Bardenbacher.

Alle trin blev gennemført i overensstemmelse med og overholdelse af alle relevante retningslinjer for regulering og institutionel pleje.
1. Plating af organoider
<ol><li>Isoler organoider som beskrevet tidligere3. Proceduren er kort beskrevet nedenfor.
	<ol>
<li>Saml tyndtarmen fra mus.</li>
		<li>Åbn tyndtarmen langsgående og fjern villi tips ved at skrabe det indre tarmvæv med en coverslip.</li>
		<li>Skær tarmvævet i små stykker med en saks.</li>
		<li>Vask stykker 5x i koldt fosfat-buffered saltvand (PBS) ved pipettering stykkerne 10x op og ned med en 25 ml pipette.</li>
		<li>Vævsstykkerne inkuberes i kolde 2 mM EDTA-opløsning på is i 30 minutter på en vandret rysteplatform. Lad vævsstykkerne sedimentere.</li>
		<li>Udskift EDTA-opløsningen med PBS-buffer, når vævsstykkerne sætter sig i bunden. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 20 ml PBS.</li>
		<li>Slip tarmkrypterne ud af vævet ved kraftigt at pipettere 10x op og ned med en 10 ml pipette.</li>
		<li>Supernatanten opsamles i centrifugationrør, og det efterses ved fasekontrastmikroskopi. For at gøre dette, tilføje en dråbe af supernatant til en 96 godt celle kultur plade. Hold centrifugeringsrør på is.</li>
		<li>Gentag trin 1.1.6-1.1.8, indtil antallet af tarmkrypter i det indsamlede supernatant falder.</li>
		<li>Der passeres de fraktioner, der indeholder de fleste krypter, gennem en 70 μm cellesi.</li>
		<li>Der centrifugeres for tifiksen ved 300 x g, 4 °C i 5 min.</li>
		<li>Supernatanten kasseres, og pelletsen suspenderes igen i kold PBS for at vaske krypterne. Gentag derefter centrifugeringstrinnet som beskrevet i 1.1.11.</li>
		<li>Resuspender pellet i alt 25 μL pr brønd af en 1:1 blanding af celle matrix opløsning og murine organoid kultur medium og plade organoiderne i en 48 brønd celle kultur plader.</li>
		<li>Inkubere organoiderne ved 37 °C, 5% CO2,, i 20 min for at gøre det muligt for cellematrixopløsningen at størkne.</li>
		<li>Antræk organoiderne med 300 μL murine organoid medium pr. brønd.</li>
		<li>Kultur organoiderne ved 37 °C, 5% CO2,ændre mediet hver 2-3 dage.</li>
		<li>Brug organoids til eksperimenter efter 7 dages kultur.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered organoids til barriere integritet måling.
	<ol>
<li>Præcoat alle centrifugeringsrør, der vil blive brugt til opbevaring af organoider under pletteringsprocessen med kvæg serum albumin (BSA) ved at tilføje nok af en 0,1% BSA opløsning i PBS til at dække alle plastoverflader. Fjern derefter BSA-opløsningen igen, og opbevar centrifugeringsrørene på is.</li>
		<li>Optø cellematrixopløsningen og organoidkulturmediet på is.</li>
	</ol></li>
	<li>For at adskille organoiderne fjernes dyrkningsmediet forsigtigt, og organoiderne suspenderes fra en brønd af en 48 brøndplade i 1 ml kold PBS. Cellmatrixen opløses ved kraftig pipettering. Hold altid organoid suspensionen i centrifugeringsrør forbelagt med BSA og opbevar altid på is. BEMÆRK: Densiteten, størrelsen og placeringen af organoiderne i det forkammerdæklige dækslipsdias påvirkes af splitforholdet, cellematrixopløsningskoncentrationen og håndteringen af organoid-cellematrixsuspensionen. Det anbefales at øve håndteringen af cellematrixopløsningen på forhånd. Normalt otte godt chambered glas dæksel er egnet til analysen. Organoider, der stammer fra en brønd af en flydende 48 brøndplade, kan opdeles i to brønde af en otte velchambereret dækslip (40 μL af organoid-cellematrixpellet pr. brønd).</li>
	<li>Organoidsuspensionen centrifugeres ved 300 x g ved 4 °C i 5 min.</li>
	<li>Kassér forsigtigt supernatanten og resuspender pellets med 1 ml kold PBS.</li>
	<li>Organoidsuspensionen centrifugeres ved 300 x g, 4 °C i 5 min.</li>
	<li>Supernatanten kasseres fuldstændigt, og organoiderne udredes fra en brønd fra en 48 brøndplade i 40 μL koldt medium. Fragmenter store organoidstrukturer ved at pipettere organoidsuspensionen 5x gennem en 10 μL pipettespids for at indsamle strukturer med en størrelse på 40-60 μm til såning. BEMÆRK: Brug 10 μL spidsen på en 100 μL pipettespids til fragmentering af organoidstrukturerne, og øv trin 1.7 på forhånd for at sikre ensartede resultater. Kontroller størrelsen af organoiderne ved fase kontrastmikroskopi i centrifugeringsrøret. Sørg for, at der ikke er flere flergrenede organoider til stede, og at organoidfragmenterne er ca. 40-60 μm lange.</li>
	<li>Når organoiderne har opnået den ønskede størrelse, blandes de med 40 μL af cellematrixopløsningen (medium:cellematrixopløsning = 1:1). BEMÆRK: Forholdet mellem til cellematrixopløsning skal holdes konstant for at opnå ensartede resultater. Fortyndingen af cellematrixopløsningen reducerer stivheden af organoid klat og påvirker dens diffusionsegenskaber. Brug forkølede pipetspidser (-20 °C) til alle suspensioner, der indeholder cellematrixopløsning.</li>
	<li>40 μL af organoid-celle matrix opløsning suspension i midten af hver brønd af en 8 godt chambered coverslip.</li>
	<li>Hold slæden på en ispose i 5 min. Dette bevarer cellematrixenorganoid suspension væske og øger organoid koncentration på coverslip overflade ved tyngdekraften.</li>
	<li>Inkuber i 20 min ved 37 °C og 5% CO2 for at muliggøre polymerisering af organoid-celle matrix klat.</li>
	<li>Der tilsættes 150 μL organoidkulturmedium pr. brønd og inkuberes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2, inden forsøgsbehandlingen fortsættes.
	<ol>
<li>Brug denne periode til at behandle organoiderne og modulere deres barriereintegritet i henhold til den tilsvarende videnskabelige hypotese. For positiv kontrol, behandle organoids i 48 timer med IFN-γ for at undersøge IFN-γ forbundet tæt krydset nedbrydning og permeabilitet stigning. Stimulere den positive kontrol med 10 U/ml (10 ng/mL) rekombinant murine IFN-γ. Lad organoids af en godt ubehandlet.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulturorganoider ved 37 °C og 5% CO2 i op til 48 timer.</li>
</ol>2. OrganoidPermeabilitet Assay
<ol><li>Mikroskopets inkubationskammer føres til 37 °C mindst 2 timer, før forsøget påbegyndes, for at reducere den termiske afdrift, mens organoiderne billeddannelse.</li>
	<li>Klargør en 100 mM opløsning AF LY i PBS. Opbevares på is beskyttet mod lys.</li>
	<li>Klargør en 200 mM eGTA-løsning i PBS. Opbevar den på is.</li>
	<li>Coverslip til kammeret overføres, herunder organoiderne, til inkubationskammeret i et omvendt2 konfokalmikroskop, og CO 2-inkubationen tændes (5 %). Sørg for, at den chambered coverslip er stramt låst inden for den fase af mikroskopet.</li>
	<li>Brug organoiderne i en samt en reference, juster billeddannelsesindstillingerne for mikroskopet. LY (3 μL på 100 mM LY i 150 μL medium) tilsættes for at opnå et endeligt volumen på 1 mM LY i 300 μL medium. Inkuber på mikroskopet i 1 time og juster fokus for billeddannelse af organoidernes lumen. Definer den nødvendige laserenergi til LY excitation (488 nm) og respektive detektionsfølsomhed af instrumentet, og prøv at afbilde LY fluorescensen ved 30-40% af det tilgængelige dynamiske område af det anvendte instrument. BEMÆRK: Juster laserexcitationsenergien og detektionseffektiviteten på ubehandlede organoider 70 min efter tilsætning af LY. Sørg for, at excitation energi er høj nok til at få et godt eksponeret billede. For at undgå mætning af LY fluorescens i mikroskopiske billeder anbefales det at justere disse indstillinger, når LY-diffusionen når en stabil tilstand.</li>
	<li>Definer placeringen af organoiderne ved differentialinterferenskontrast (DIC) levende billeddannelse. Prøv at afbilde organoider med sammenlignelige diametre (80 ± 30 μm) og fokusere på den centrale del af organoiderne til at afbilde deres lumen. Definer omkring 10 organoider pr. brønd og prøv kun at afbilde organoider tæt på dækseloverfladen med en sfærisk struktur. BEMÆRK: Antallet af organoider, der kan afbildes pr. kørsel, afhænger af mikroskopets hastighed. Det anbefales at afbilde organoiderne inden for et interval på 5 minutter. På en regelmæssig laserscanning mikroskop, 40 positioner i alt er et rimeligt udgangspunkt.</li>
	<li>Dic og LY fluorescensen på alle positioner registreres for at dokumentere organoidens form og autofluorescens, før LY tillægges brøndene, der anvendes til barriereintegritetsanalysen.</li>
	<li>Billed ikke organoider, der udviser høj autofluorescens. Dette skyldes ophobning af døde celler i organoid's lumen, og resultaterne af autofluorescerende organoider er svære at analysere bagefter.</li>
	<li>3 μL af den forberedte LY-opløsning (100 mM LY i 150 μL medium) fortyndes, og dette tilsættes omhyggeligt til hver brønd uden at røre ved den forkammerdæklige dækslip. Den anbefalede koncentration af LY pr. brønd er 1 mM. Det endelige volumen pr. brønd skal være 300 μL.</li>
	<li>Kontroller hurtigt fokus for de definerede positioner og korrekt, hvis det er nødvendigt. BEMÆRK: LY spreder sig hurtigt gennem cellematrixen. Derfor skal konfokale billeddannelse påbegyndes inden for 3 minutter efter tilsætning af fluorophore.</li>
	<li>Start en time-lapse billeddannelse på mikroskopet. Tag et fluorescensbillede af hver position hver 5. BEMÆRK: De organoider blev afbildet i 5 min intervaller for at visualisere LY optagelse over tid. For at måle nedbrydningen af tarmbarrieren er det tilstrækkeligt at registrere fluorescensen før og 60 min efter LY tilsætning og igen 10 min efter tilsætning af EGTA.</li>
	<li>Der tilsættes 3 μL af den forberedte EGTA-opløsning pr. brønd uden at røre ved den medkammerdæksel. Den anbefalede koncentration inden for EGTA's chambered coverslip er 2 mM. Det samlede volumen pr. brønd skal være 300 μL.</li>
	<li>Start en anden time-lapse. Fluorescensen af de definerede organoider registreres igen med et interval på 5 min i i alt 30 min.</li>
	<li>Kassér alt i henhold til lokale sikkerhedsregler. BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.</li>
</ol>3. Dataanalyse
<ol><li>Analyser kun resultaterne af de organoider, der tog LY efter eGTA tilsætning.</li>
	<li>Resultaterne kan kvantificeres med Fiji ImageJ.</li>
	<li>Åbn datasæt i ImageJ ved at klikke på Filer | Åbn og vælg billeddata. Vælg Vis stak med: Hyperstacki følgende dialogboks med importindstillinger for BIO-Formater.</li>
	<li>Åbn interesseområdelederen ved at klikke på Analysér | Værktøj | ROI Manager.</li>
	<li>Tegn et ovalt investeringsafkast ved at klikke på den ovale valgknap på menulinjen ImageJ. Tegn en markering, der indeholder organoidens indre lumen. Tryk derefter på Tilføj i ROI Manager.</li>
	<li>Trinnene gentages for tre repræsentative områder uden for organoid.</li>
	<li>Klik på Analysér på menulinjen, og vælg Angiv mål. Aktiver kun Mean Gray Value, og deaktiver alle andre målinger. Klik derefter på OK.</li>
	<li>Sørg for, at alle roi'er er valgt i ROI Manager. Klik på Mere i ROI Manager | Flere målpunkt . Vælg Mål alle [...] udsnit og Én række pr. udsnit i indstillingsdialogboksen . Klik derefter på OK.</li>
	<li>Marker alle værdierne i vinduet Resultater, og kopiér dem til et regnearksprogram til yderligere analyse. BEMÆRK: Hvis organoidens position bevægede sig under time-lapse-billeddannelse, skal investeringsafkastet justeres i overensstemmelse hermed. For at gøre dette skal du vælge det korrekte investeringsafkast i ROI-lederen og flytte det til den nye stilling. Klik derefter på Opdater i roi-styringen. Udfør målingen for hvert tidspunkt individuelt ved at klikke på Mål i ROI-styringen, og skift derefter til næste tidspunkt i billedvinduet ved hjælp af bjælken nederst. Saml alle målinger i et regneark. Den individuelle form og bevægelse af organoider i billeddannelsesperioden kræver en manuel analyse af dataene.</li>
	<li>Middelintensitetsværdien af de tre ROI'er uden for organoiden beregnes for hvert tidspunkt.</li>
	<li>Opdel intensiteten af roi inde i organoid's lumen med den gennemsnitlige intensitet af ROI udenfor og den gennemsnitlige intensitet inde i organoid.</li>
	<li>For at beregne den relative stigning i luminal organoid fluorescens divideres den relative fluorescens (se trin 3.11) ved hvert tidspunkt, der er afbildet af den minimale relative fluorescens. BEMÆRK: Brug den minimale relative fluorescens, fordi nogle gange diffusion af fluorophore kan være langsom i begyndelsen af forsøget.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L&#243;pez-Posadas, R., St&#252;rzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+GTPases+and+Cytoskeleton+in+Cellular+Barrier+Defects+during+Gut+Inflammation.">Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).</li><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).</li><li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types.">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).</li><li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Measurement+of+Epithelial+Barrier+Permeability+in+Human+Intestinal+Organoids.">Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+transport+was+observed+not+in+hydrophilic+compounds+but+in+dextran+in+Caco-2+cell+monolayers.">Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne analyse tilbyder en teknik til at studere tarmbarrieren integritet i levende organoider. Hele analysen er baseret på små tarmmus organoider og konfokal levende cellemikroskopi. Derfor er det obligatorisk at praktisere korrekt håndtering af organoider på forhånd. Ved isolering kan organoider rutinemæssigt opdeles og opbevares ved kryofrysning3,9. Til denne analyse anbefaler vi at opdele organoiderne 48 timer, før behandlingen påbegyndes. Denne periode giver organoids mulighed for helt at lukke og danne sfæriske strukturer. Såning af organoider til forsøget er et kritisk skridt i analysen. For at reducere individuelle håndteringsvariationer anbefaler vi en rutineprocedure for såningsprocessen. Dette trin er afgørende, og en rutinemæssig håndteringsprotokol reducerer klart eksperimentelle variationer.
Under såningsproceduren (trin 1.7) fragmenteres organoiderne ved gentagne passerer gennem en standard 10 μL pipettespids. Pore størrelsen af dette produkt varierer fra virksomhed til virksomhed. Denne procedure bør praktiseres på forhånd, og resultatet bør altid kontrolleres ved fase kontrastmikroskopi. Når organoiderne har opnået den ønskede størrelse, må proceduren ikke ændres.
Seedningen af organoiderne skal optimeres og tilpasses til den tilgængelige mikroskopiske opsætning. For at kunne kultur og billede organoids i mindst 48 timer, et inkuberet mikroskop kammer er absolut påkrævet. Vælg en chambered coverslip, der passer til dine krav. Ved såning af organoider, sørg for at koncentrere organoids på coverslip overflade. Dette er muligt ved at holde det kammerdæklige dækslip på en ispose i 5 minutter efter placering af cellematrix-organoid suspension. Dette trin er vigtigt at øge kvaliteten af konfokale levende celle imaging. Den aksiale opløsning og arbejdsafstand af konfokale mikroskoplinser er særligt begrænset. Jo tættere du bringer prøven til linsen, jo bedre kan du forestille det, og jo mindre laser energi er nødvendig for at ophidse LY fluorescens.
Phototaxis er et vigtigt spørgsmål, når det kommer til levende celle mikroskopi. Inden for denne analyse udelukker vi denne mulighed. En funktionel AJC kan ses ved udelukkelse af LY fra organoidens lumen (Figur 1, PBS). Tilføjelsen af EGTA i slutningen af forsøget forårsager beslaglæggelse af bivalent ioner, som er cofaktorer for AJC proteiner. LY er kun udelukket fra organoids lumen i vitale organoider med et funktionelt AJC-kompleks. Generelt kan fluorescerende molekyler bruges til at måle integriteten af tarmbarrieren. Vi valgte LY i stedet for andre almindeligt anvendte fluorophores såsom fluorescein mærket dextran, fordi de transporteres transcellulært i tarmceller fra de basale til den apikale rum9. Vi valgte også LY på grund af sin lille størrelse. LY har en molekylvægt på 457 Da og letter derfor undersøgelsen af barrierepermeabiliteten for små molekyler. Fluorescerende molekyle skal vælges afhængigt af det undersøgte videnskabelige spørgsmål. Da der findes fototoksiske AJC-defekter, skal laserexcitationsenergien reduceres, eller billedintervallet forlænges. Den optimale konfokale billeddannelse teknik til denne analyse er spinning disk mikroskopi. Respektive instrumenter muliggør konfokal billeddannelse med kort eksponeringstid ved lav lasereffekt.
Forskellige modeller er allerede blevet udviklet til at studere intestinal barriere integritet in vitro. Mens brugen af analyser baseret på cellelinje monolayers eller eksperimenter in vivo er faldende, organoid-baserede metoder stigende. I modsætning til tidligere beskrevne metoder4,5,6,7– giver vores metode mulighed for kvantificering af barrierefunktionen over tid. Dette gør det muligt at eksponere organoiderne for yderligere stimuli i løbet af forsøget. Her anvender vi EGTA som en anden stimulus i slutningen af eksperimentet som en positiv kontrol.
I modsætning til situationen in vivo, i vores analyse LY tilsættes i mediet og trænger ind i organoid udefra basolaterale epitelsiden mod indersiden apikale lumen. LY er lille og bruges kun til at visualisere tætheden af tarmbarrieren. Molekyler og stimuli, der modulerer det epitellag på den apikale overflade, skal sprøjtes ind i organoidens lumen7. For at reducere den eksperimentelle indsats og for at kunne måle barriereintegriteten af mange organoider på samme tid valgte vi at anvende det fluorescerende farvestof udefra.
Vi brugte analysen til at undersøge funktionen af IFN-γ på den tætte krydset af små tarmmus organoider. Det faktum, at vi var i stand til at analysere barrieren integritet i levende organoider giver fremtidige muligheder for at anvende denne teknik til at beskrive hæmmere for inflammation-induceret opdeling af tarmbarrieren. Stoffer, der modvirker den svækkede barrierefunktion forårsaget af IFN-γ, kan være kandidater til behandling af inflammatoriske tarmsygdomme, hvor nedsat barrierefunktion er en af de patogene faktorer10.

Integriteten af epitelbarrieren opretholdes af det apikale junctional kompleks (AJC), som består af tætte vejkryds (TJ) og tilslutningskrydsproteiner (AJ)1. AJC's polariserede struktur er afgørende for dens funktion in vivo. Dysregulering af AJC er til stede i forskellige sygdomme og er mistænkt for at være en vigtig udløser af inflammatorisk tarm patogenese. Tab af tarmbarrierefunktion repræsenterer den initierende hændelse af sygdommen. Følgende translokation af kommensal bakterier og inflammatoriske reaktioner er de smertefulde konsekvenser2.
Der er udviklet forskellige in vitro- og in vivo-modeller til at undersøge reguleringen af AJC. Den Transwell assay er baseret på to-dimensionelle (2D) celle monolayers, der var afledt af tumor cellelinjer. Disse systemer er gode til at vurdere ved optiske og biokemiske metoder og muliggøre analyse af mange prøver på samme tid, men mangler mange funktioner i primære celler og differentieringsprocesserne i vivo. Undersøgelse af barriereintegriteten er også mulig i dyremodeller. I terminale forsøg kan virkningerne af specifikke behandlinger in vivo på gennemtrængeligheden af hele tarmen kvantificeres. Men disse modeller kræver et stort antal dyr, og de tillader ikke detaljeret visualisering af de underliggende molekylære processer. I dag forbedret 3D in vitro modeller er tilgængelige, at nøje opsummere celle differentiering processer, celle polarisering, og repræsenterer krypt-villus struktur af tarmen3. Anvendelsen af 3D-tarmorganoider til funktionelle analyser kræver tilpasning af tilgængelige metoder fra 2D-modeller. Her beskriver vi en model til at undersøge tarmbarrierens integritet i levende små tarmmuseorganoider. Analysen blev oprettet for at undersøge virkningen af IFN-γ på barrierens integritet og de respektive tætte junction proteiner8.
I modsætning til den teknik, der anvendes af Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som måler fluorescens efter fjernelse lucifer gul (LY) fra mediet, vores tilgang giver mulighed for kvantificering af luminal optagelse af fluorophore over tid. Derfor repræsenterer resultatet en dynamisk optagelse kinetisk og vores analyse gør det muligt at anvende yderligere stimuli eller hæmmere i løbet af forsøget. Det faktum, at begge analyser måler optagelse udefra basolateral side til indersiden apikale overflade er i klar kontrast til situationen in vivo. I en model beskrevet af Hill et al.7, dette emne blev undersøgt. Ved mikroinjektion af fluorofhore i organoidens lumen blev fluorescensen kvantificeret. Diffusionsretningen repræsenterer den retning, der er til stede i vivo. Den tekniske indsats for mikroinjektion reducerer klart gennemløbet af denne metode. I modsætning til den model, der er beskrevet her, gør mikroinjektionsmetoden det muligt at måle effekter, der kræver biologisk aktivering på den apikale epiteloverflade.
Den organoidbarriereintegritetsmodel, der præsenteres her, er baseret på levende cellemikroskopi og muliggør analyse af dynamiske ændringer inden for AJC-reguleringen over tid. Opsætningen kan anvendes til at teste den farmakologiske virkning af stoffer, der fremkalder og hæmmer tarmbarrierens integritet. Desuden hjælper organoidbaserede modeller med at reducere antallet af dyr, der anvendes til farmakologiske undersøgelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well culture plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>#80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 - spinning disc</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>excitation laser 488 nm / emission filter 525/25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 15 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11507411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced, phenol red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Cell matrix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>M. musculus C57/Bl6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslip</td>
			<td></td>
			<td>24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid Growth Medium mouse</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#06005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat#575304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating intestinal barrier breakdown in living organoids

Organoider og tredimensionale (3D) cellekulturer gør det muligt at undersøge komplekse biologiske mekanismer og bestemmelser in vitro, som tidligere ikke var muligt i klassiske cellekultur monolag. Desuden monolayer cellekulturer er gode in vitro model systemer, men repræsenterer ikke de. komplekse cellulære differentiering processer og funktioner, der er afhængige af 3D-struktur. Dette har hidtil kun været muligt i dyreforsøg, som er besværlige, tidskrævende og svære at vurdere ved hjælp af optiske teknikker. Her beskriver vi en analyse til kvantitativt bestemme barrieren integritet over tid i levende små intestinal mus organoider. For at validere vores model anvendte vi interferon gamma (IFN-γ) som en positiv kontrol for barrieredestruktion og organoider afledt af IFN-γ receptor 2 knock out mus som en negativ kontrol. Analysen gav os mulighed for at bestemme virkningen af IFN-γ på tarmbarrierenintegritet og IFN-γ induceret nedbrydning af de stramme junction proteiner claudin-2, -7 og -15. Denne analyse kan også bruges til at undersøge virkningen af kemiske forbindelser, proteiner, toksiner, bakterier, eller patient-afledte sonder på tarmbarrieren integritet.

For at validere anvendelsen af 3D små tarmmuseorganoider som model til kvantificering af effekten af forbindelser, der regulerer tarmbarrierens integritet, anvendte vi IFN-γ. For at gøre dette isolerede og dyrkede vi organoider afledt af IFN-γ responsive wild type og IFN-γ-receptor-2 knockout mus, som ikke reagerer på IFN-γ8. Ved behandling i 48 timer med IFN-γ eller PBS (kontrol) blev alle organoider eksponeret for LY og afbildet ved konfokal roterende skivelevende cellemikroskopi i 5 min. Den funktionelle integritet af tarmbarrieren i denne model resulterede i udelukkelse af LY fra organoid's lumen mens intraluminal ophobning af LY betød ødelæggelse af TJ. De repræsentative fluorescensmikroskopiske billeder efter 70 minutters inkubation med LY viser tydeligt, at intraluminal LY fluorescens kun var synlig i organoider fra vilde dyr af typen, der blev behandlet med IFN-γ. I ustimulerede (PBS) kontroller eller i organoider fra udslåede dyr (IFN-γR2ΔIEC, Figur 1), var der ingen intraluminal LY fluorescens efter 70 min.
Tilføjelsen af EGTA medfører en uspecifik nedbrydning af tarmbarrierens integritet ved at afgrænse TJ-cofaktorer. Denne kontrol blev altid udnyttet i slutningen af forsøget til at påvise de respektive organoids evne til at tage LY (Figur 1). Hvis der ikke blev påvist intraluminal LY fluorescens ved Behandling med EGTA, blev organoiden udelukket fra forsøget.
Til kvantitativ vurdering af de mikroskopiske resultater blev LY fluorescens målt i organoidens lumen og uden for organoiden. Relative intensitetsværdier blev beregnet (fluorescens inde/ fluorescens udenfor + indeni) og vises for hvert punkt, der er afbildet. Det anbefales at undgå billeddannelse af organoider af forskellig størrelse. Vi valgte at fokusere på organoider med en diameter på 80 ± 30 μm (Figur 2). En skematisk protokol med repræsentative billeder er vist i figur 3. Nogle større problemer og fejlfindingsteknikker vises og diskuteres i figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig01.jpg"> Figur 1: Intestinal barriereintegritet kan analyseres i museorganoider. Tarmorganoider fra IFN-γR2WT og IFN-γR2ΔIEC blev dyrket i nærheden af IFN-γ i 48 timer eller venstre ubehandlet. For at undersøge tarmbarrierens integritet blev LY (457 Da) tilføjet, og konfokale fluorescerende billeder blev taget i 5 min. intervaller i i alt 70 min. Repræsentative billeder på tidspunkt 0 min, 70 min, og efter tilsætning af EGTA vises (grøn = Lucifer gul; Skalabjælke = 20 μm). Dette tal er blevet ændret fra Bardenbacher et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig02.jpg"> Figur 2: Lille intestinal organoid barriere integritet model giver kvantitative resultater. (A) LY fluorescens blev bestemt i og uden for organoid. Relative intensitetsværdier blev beregnet (inde/fluorescens udenfor + indenfor) i forhold til den oprindelige relative intensitet + SEM og vises for hvert tidspunkt. (B) Størrelsesfordeling af analyserede organoider. For at reducere standardafvigelsen og fejl som følge af ændringer i forholdet mellem overflade og volumen analyserede vi kun organoider med en diameter på 80 ± 30 μm. Gennemsnitsværdier for de respektive organoiddiametre vises + SD (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). Gennemsnitsdiameterværdierne varierede ikke signifikant mellem de forskellige grupper (envejs ANOVA). (C)Organoidernes gennemtrængelighed blev bestemt 70 min. efter tilsætning af LY. Det blev defineret ved at dividere intensiteten af intraluminal fluorescens efter 70 min. med de minimale relative fluorescensintensiteter målt i observationsperioden. Hver søjle repræsenterer middelværdier + SD, målt i 10 organoider udvundet af to uafhængige forsøg (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ øgede ly-optagelseen betydeligt kun i IFN-γR2WT organoids. p-værdi <0,001 i Student's t-test. Dette tal er blevet ændret fra Bardenbacher et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig03.jpg"> Figur 3: Skemaprotokol med repræsentative billeder. AA) En skematisk beskrivelse af protokollens hovedtrin. bB) Repræsentative billeder af protokollens vigtigste trin. (B1) DIC mikroskopi billede af en central skive gennem en passende organoid, der blev valgt til permeabilitet analyse. Den stiplede linje repræsenterer en bredde på 89 μm. (B2) Fluorescensmikroskopi billede af samme organoid i (B1) før du tilføjer LY. Billedet viser autofluorescens af organoid. (B3) En organoid 70 min efter tilsætning af LY. Den afbildede organoid viser ingen optagelse af LY og derfor en intakt barriere funktion. Punkterede linjer viser investeringsafkast til yderligere analyse. Den indre lumen af organoid og tre repræsentative områder omkring organoid er markeret. (B4) En organoid efter tilsætning af EGTA. Organoid'en kan anvendes til yderligere analyse, fordi det viser LY-optagelse efter EGTA-behandlingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig04.jpg"> Figur 4: Fejlfinding af almindelige problemer. (A) Tabel med fælles problemer og løsninger. bB) Eksemplariske billeder. (B1) DIC billede af en stor multibranched organoid, der ikke er egnet til denne analyse. (B2). Konfokal billede af en organoid, der viser høj autofluorescens, før LY blev tilføjet til mediet. Organoid blev udelukket fra kvantificering. (B3) Konfokal billede af en organoid, der viser lav autofluorescens, før LY blev tilføjet til mediet. Fluorescensen blev kvantificeret i dette tilfælde. (B4) Organoid viser ingen LY optagelse fra mediet 30 min efter tilsætning af EGTA og derfor udelukket fra kvantificering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids at JoVE.com

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Her beskriver vi en teknik til at kvantificere barriereintegriteten af små tarmorganoider. Det forhold, at metoden er baseret på levende organoider, gør det muligt at foretage sekventiel undersøgelse af forskellige barriereintegritetsmodulerende stoffer eller kombinationer heraf på en tidsløst måde.

Undersøgelse intestinal barriere opdeling i levende organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Med det formål at undersøge tarmbarrierens integritet udviklede vi en metode til at måle tarmbarrierens integritet i museminele tarmorganoider. I modsætning hertil henviser vi til brugt monolag cellekultur, vores analyse er baseret på tredimensionelle små tarm organoider. Tilpasning af en todimensionel analyse til vores model var afgørende for dens praktiske.Analysen er baseret på organoider dyrket in vitro og dens anvendelse vil bidrage til at definere inducere og hæmmere af tarmbarriere integritet. Reguleringen af stramme krydsproteiner er et vigtigt element i alle epitelceller. Vores analyse muliggør funktion og analyse af epitelbarriere integritet.For at måle barriereintegriteten for organoider, der er isoleret fra museintestinale væv, skal du først precoate alle de centrifugeringsrør, der skal anvendes til opbevaring af organoiderne under pletteringsprocessen med nok 0,1% BSA i PBS til at dække alle plastoverfladerne. Fjern straks BSA-opløsningen, og læg rørene på is. Dernæst tø celle matrix løsning og organoid kultur medium på is og forsigtigt fjerne kultur medium fra hver brønd af en 48 godt organoid kultur plade.Vask hver brønd med en milliliter kold PBS før kraftigt pipettering at opløse cellen matricer. Når der er opnået relativt homogene cellesuspensioner, vaskes organoiderne med frisk PBS to gange ved centrifugering, og hver organoidkultur skal opspærres igen i 40 mikroliter koldt medium. Dissocier de store organoid strukturer gennem en 10 mikroliter pipette spids fem gange for at indsamle strukturer med en 40 til 60 mikrometer størrelse og bland hver organoid suspension med 40 mikroliter frisklavet celle matrix løsning.Tilføj hver organoid celle matrix løsning suspension i midten af de enkelte brønde i en otte godt chambered coverslip og placere dias på en ispose i fem minutter. Ved slutningen af inkubationen skal du placere diaset ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 20 minutter for at muliggøre polymerisering af organoid celle matrix struktur, før du tilføjer 150 mikroliter af organoid kultur medium til hver brønd for en 24 timers inkubation i cellen kultur inkubator. Ved slutningen af inkubationen behandles de positive kontrolblys med 10 nanogram pr. milliliter rekombinant murin interferon gamma i 48 timer.For at udføre en permeabilitetsanalyse skal du overføre dækslet til 37 grader Celsius-opvarmet inkubationskammer i et omvendt konfokal mikroskop og indstille kammerets kuldioxid til 5%Lås dækslet stramt på mikroskopfasen og juster mikroskopets billeddannelsesindstillinger for at visualisere organoiderne i en brønd af kammeret. Derefter tilsættes tre mikroliter frisklavet 100 millimolar Lucifer gul i 150 mikroliter af medium til en brønd i en time inkubation i mikroskopkammeret. Ved slutningen af inkubationen justeres fokus for at visualisere lumen af referenceorganoidet og definere den nødvendige laserenergi til Lucifers gule ophidselse og instrumentets respektive detektionsfølsomhed for at afbilde Lucifers gule signal ved 30 til 40 % af instrumentets tilgængelige dynamiske område.Alternativt kan signalintensiteten ændres ved at ændre eksponeringstiden. For at finde placeringen af omkring 10 organoids med en sfærisk struktur tæt på coverslip overflade per godt ved differentialinterferens kontrast levende billeddannelse, fange organoider med sammenlignelige diametre og fokusere på den centrale skive af organoids at billedet lumen. Optag differentialeferens kontrast og Lucifer gule fluorescens af hver position til at dokumentere formen og auto-fluorescens af hver organoid.Når alle organoider er blevet afbildet, tilsættes 150 mikroliter af medium, herunder Lucifer gul, til Lucifer gule behandling brønde og billede alle brønde hvert femte minut i 70 minutter. I slutningen af billedbehandlingssessionen skal du tilføje fire mikroliter frisklavet EGTA til 100 mikroliter af medium. Tilsæt den fortyndede EGTA til de relevante brønde.Derefter registrere fluorescens af organoids i hver brønd hvert femte minut i 30 minutter. Sørg for at praktisere håndtering og kultur eller organoids på forhånd som cellulære levedygtighed og integritet er en forudsætning for succes i analysen. I dette repræsentative eksperiment var gul fluorescens kun synlig i organoider fra vilde dyr, der blev behandlet med interferon gamma, efter 70 minutters behandling med Lucifers gule intraluminale Lucifer-gule fluorescens.Hverken ustimulerede kontroller eller organoider afledt af interferon gamma receptor-2 knockout dyr viste intraluminal Lucifer gul fluorescens ved afslutningen af behandlingsperioden. Tilføjelsen af EGTA forårsagede en uspecifik nedbrydning af tarmbarrierens integritet ved at afsone stramme kollidsfaktorer, hvilket resulterede i Lucifers gule brug og udtryk i alle organoider uanset oprindelses- eller behandlingsvilkår. De relative intensitetsværdier for Lucifers gule fluorescensniveau inden for organoidlummen og ydersiden af hvert organoid kan også kvantificeres.Sørg for at vælge organoider med en sammenlignelig størrelse omkring konfiguration og for at vælge den indstillede akse, så du kan forestille dig den centrale lumen af organoid. Ud over at bruge stoffer, der fremkalder nedbrydning af tarmbarrieren, kan vi også undersøge strategier for hæmning af ødelæggelse af tarmbarrierer. Da denne metode er baseret på primærceller fra et enkelt dyr, kan den anvendes til mange analyser, hvilket reducerer antallet af dyr, der kræves til hvert forsøg.

Research

JoVE Journal

Medicine

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guided Forstyrrelse af blod-hjerne barrieren ved hjælp af Transcranial fokuseret ultralyd i en rottemodel

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functional Assessment of tarmmotilitet og tarmvæggen Inflammation i Gnavere: Analyser i en standardiseret model af Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye

Trabekelværket Reaktion på tryk Elevation i Living menneskelige øje

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE Gene Silencing: Screening af en heptamer-typen Lille guide RNA Bibliotek for potentielle kræft terapeutiske midler

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murin model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Exergaming in Older People Living with HIV Improves Balance, Mobility and Ameliorates Some Aspects of Frailty

Exergaming i ældre mennesker med hiv Forbedrer Balance, mobilitet og forbedrer nogle aspekter af skrøbelighed

Approximately 1.2 million people in the United States live with HIV infection. Medical advancements have increased the life expectancy and this cohort is ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analyse Gavnlige virkninger af kosttilskud på Intestinal epitelbarriere funktioner under Eksperimentel Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...