Name: investigating intestinal barrier breakdown in living organoids
Uploaded: 2020-03-26T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
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この研究は、ドイツ研究財団(DFG)[KFO257、プロジェクト4からM.S.、プロジェクト1からC.B.への助成金によって支えられました。FOR2438、プロジェクト2からM.S.とE.N.、プロジェクト5からC.B.へ。SFB1181 プロジェクト C05 から C.B.TRR241、プロジェクトA06からN.B.L.とM.S.、プロジェクトA03からC.B.、BR5196/2-1からN.B.L.、BE3686/2からC.B.へ]。エアランゲン臨床センター(M.S.、E.N.、M.B.)の学際的な臨床研究センター(IZKF)、W.ルッツ・スティフトゥン(M.S.)、臨床センターアーランゲンのフォルシュングシュスティフトゥンメディジン(M.S.へ)。本研究は、マルコ・バーデンバッハー博士の学位を取得するための要件の(部分的な)充足で行われた。

すべてのステップは、関連するすべての規制および制度的動物ケアガイドラインに従って完了しました。
1. オルガノイドのめっき
<ol><li>前述のオルガノイドを分離する 3.手順は以下に簡単に説明します。
	<ol>
<li>マウスから小腸を収集します。</li>
		<li>小腸を縦方向に開き、内側の腸組織をカバースリップで掻き取ることによって絨毛先端を取り除く。</li>
		<li>はさみを使って小さくて腸組織を切ります。</li>
		<li>25 mL ピペットで10倍上下にピペットを入れ、冷たいリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で5倍洗浄します。</li>
		<li>冷たい2 mM EDTA溶液を氷の上で、水平揺れプラットフォームで30分間インキュベートします。組織片を堆積物にします。</li>
		<li>組織片が底部に落ち着いたら、EDTA溶液をPBSバッファーに交換します。上清を捨て、PBSを20mL加えます。</li>
		<li>腸内窩を組織から10mLピペットで10倍上下に激しくピペット化して組織から放出する。</li>
		<li>遠心管に上清を集め、位相差顕微鏡で検査します。これを行うには、上清の滴を96ウェル細胞培養プレートに加える。氷の上に遠心チューブを保管してください。</li>
		<li>収集した上清の腸管の納骨堂の数が減少するまで、ステップ1.1.6~1.1.8を繰り返します。</li>
		<li>最も多くの暗号を含む分数を70 μmの細胞ストレーナーに渡します。</li>
		<li>300xgで、5分間4°Cgでクリプトサスペンションを遠心分離します。</li>
		<li>上清を捨て、ペレットを冷たいPBSで再び懸濁させて、納骨堂を洗います。その後、1.1.11で説明したように遠心分離のステップを繰り返します。</li>
		<li>細胞マトリックス溶液とマウスオルガノイド培養培地の1:1混合物のウェル当たり合計25μLのペレットを再懸濁し、48ウェル細胞培養プレートにオルガノイドをプレートします。</li>
		<li>オルガノイドを37°C、5%CO2で20分間インキュベートし2、細胞マトリックス溶液を固化させます。</li>
		<li>オルガノイドを300μLのマウスオルガノイド培地で覆います。</li>
		<li>オルガノイドを37°C、5%CO22で培養し、2~3日ごとに培地を交換する。</li>
		<li>培養7日後の実験にはオルガノイドを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>バリア完全性測定のためにオルガノイドを準備します。
	<ol>
<li>すべてのプラスチック表面をカバーするためにPBSに0.1%BSA溶液を添加して、メッキプロセス中にオルガノイドをホッキプロセス中に保存するために使用されるすべての遠心チューブをPBSに追加してプレコートします。その後、もう一度BSA溶液を取り出し、氷の上に遠心チューブを保管します。</li>
		<li>細胞マトリックス溶液およびオルガノイド培養液を氷上で解凍する。</li>
	</ol></li>
	<li>オルガノイドを分離するには、慎重に培養培地を除去し、冷たいPBSの1mLで48ウェルプレートの1つのウェルからオルガノイドを再懸濁する。激しいピペット処理により細胞マトリックスを溶解します。BSAでコーティングされた遠心チューブにオルガノイド懸濁液を常に保管し、常に氷の上に保管してください。 注:チャンバーカバースリップスライド内のオルガノイドの密度、サイズ、位置は、分割比、細胞マトリックス溶液濃度、およびオルガノイド細胞マトリックス懸濁液の取り扱いによって影響を受ける。セルマトリックス溶液の取り扱いを事前に実践することをお勧めします。通常、8つのよくチャンバーガラスカバーリップは、アッセイに適しています。コンフルエント48ウェルプレートの1つのウェルから誘導されるオルガノイドは、8つのウェルチャンバーカバースリップ(オルガノイド細胞マトリックスペレットの40 μLあたりウェル)の2つのウェルに分割することができます。</li>
	<li>オルガノイド懸濁液を4°Cで300xgで5分間遠心する。 g</li>
	<li>慎重に上清を捨て、冷たいPBSの1 mLでペレットを再懸濁します。</li>
	<li>オルガノイド懸濁液を300xg、4°Cで5分間遠心分離する。 g</li>
	<li>上清を完全に捨て、48ウェルプレートから得られたオルガノイドを40μLの冷媒で再懸濁します。大きなオルガノイド構造をフラグメント化し、オルガノイド懸濁液を10μLピペットチップを通して5xをピペット化し、播種用40~60μmの大きさの構造を収集します。 注:オルガノイド構造の断片化には100 μLピペットチップの10μLチップを使用し、ステップ1.7を事前に実施して一貫した結果を確認します。遠心管内の位相コントラスト顕微鏡によりオルガノイドのサイズを制御します。これ以上多分岐オルガノイドが存在しなくて、オルガノイド断片の長さはおよそ40~60μmであることを確認してください。</li>
	<li>オルガノイドが所望のサイズを得たら、細胞マトリックス溶液の40 μLと混合する(培地:細胞マトリックス溶液= 1:1)。 注:一貫した結果を得るには、媒体とセルマトリックスの溶液比を一定に保つ必要があります。細胞マトリックス溶液の希釈は、オルガノイブブブブブの剛性を減少させ、拡散特性に影響を与えます。セルマトリックス溶液を含むすべての懸濁液に、あらかじめ冷却されたピペットチップ(-20°C)を使用してください。</li>
	<li>オルガノイド細胞マトリックス溶液懸濁液の40 μLを、8ウェルチャンバーカバースリップの各ウェルの中央に配置します。</li>
	<li>スライドをアイスパックに5分間置いておいて下さいます。これは細胞マトリックスオルガノイド懸濁液を維持し、重力によってカバースリップ表面でオルガノイド濃度を増加させる。</li>
	<li>37°Cで20分間インキュベートし、5%CO2でインキュベートし、オルガノイド細胞マトリックスブロブの重合を可能にします。2</li>
	<li>オルガノイド培地1ウェルあたり150μLを加え、実験処理を進める前に37°Cで24時間、CO2を5%インキュベートします。
	<ol>
<li>オルガノイドを治療し、対応する科学的仮説に従ってバリアの完全性を調節するために、この期間を使用します。陽性対照のために、IFN-γ関連の緊密な接合の分解および透過性の増加を調査するためにIFN-γで48時間のオルガノイドを治療する。10 U/mL(10 ng/mL)組み換えマウスIFN-γで正のコントロールを刺激します。1つのオルガノイドをよく治療せずに残します。</li>
	</ol></li>
	<li>培養オルガノイドは37°Cで、5%CO2で48時間まで培養した。2</li>
</ol>2. オルガノイド透過性アッセイ
<ol><li>実験を開始する前に、少なくとも2時間で顕微鏡のインキュベーションチャンバーを37°Cに持ち込み、オルガノイドを撮影しながら熱ドリフトを低減します。</li>
	<li>PBSでLYの100 mM溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。</li>
	<li>PBSでEGTAの200 mM溶液を調製します。氷の上に保管してください。</li>
	<li>オルガノイドを含むチャンバーカバースリップを反転した共焦点顕微鏡のインキュベーションチャンバーに移し、CO2インキュベーション(5%)をオンにします。チャンバーカバースリップが顕微鏡の段階内でしっかりとロックされていることを確認してください。</li>
	<li>オルガノイドを参考にして、顕微鏡の撮像設定を調整します。LY(100 mM LYの3 μLを150 μLの培地で3μL)添加し、300 μLの培地で1mM LYの最終容積を得る。顕微鏡で1時間インキュベートし、オルガノイドの内腔のイメージングに焦点を合わせます。LY励起(488 nm)と各検出感度に必要なレーザーエネルギーを定義し、使用されている機器のダイナミックレンジの30~40%でLY蛍光を画像化します。 注:LYを添加した後70分の未処理オルガノイドでレーザー励起エネルギーと検出効率を調整します。励起エネルギーが十分に露出した画像を得るのに十分な高さであることを確認します。顕微鏡画像内のLY蛍光の飽和を避けるために、LY拡散が定常状態に達した後にこれらの設定を調整することをお勧めします。</li>
	<li>微分干渉コントラスト(DIC)ライブイメージングによりオルガノイドの位置を定義します。同等の直径(80±30μm)のオルガノイドを画像化し、オルガノイドの中央スライスに焦点を当ててルーメンをイメージします。ウェルあたり約10個のオルガノイドを定義し、カバースリップ表面に近いオルガノイドのみを球状構造で画像化しようとします。 注:1回の走行で画像化できるオルガノイドの数は、顕微鏡の速度によって異なります。オルガノイドを5分間隔で画像化することをお勧めします。通常のレーザー顕微鏡では、合計で40の位置が合理的な出発点です。</li>
	<li>障壁の完全性の調査のために使用される井戸にLYを加える前にオルガノイドの形および自己蛍光を文書化するためにあらゆる位置のDICおよびLYの蛍光を記録する。</li>
	<li>高い自己蛍光を示すオルガノイドを画像化しないでください。これは、オルガノイドの内腔内の死んだ細胞の蓄積によるもので、その後の自己蛍光オルガノイドの結果を分析するのは困難です。</li>
	<li>調製したLY溶液(100 mM LY中150 μLの培地)を3 μL希釈し、チャンバーカバースリップに触れることなく、これを各ウェルに慎重に加えます。井戸ごとのLYの推奨濃度は1 mMです。井戸あたりの最終ボリュームは300 μLである必要があります。</li>
	<li>定義された位置のフォーカスを素早く確認し、必要に応じて修正します。 注:LYはセルマトリックスを通して素早く拡散します。したがって、共焦点イメージングは、フルオロフォアの添加後3分以内に開始する必要があります。</li>
	<li>顕微鏡でタイムラプスイメージングを開始します。5分ごとに全ての位置の蛍光像を、合計70分間撮ります。 注:オルガノイドを5分間隔で画像化し、時間経過とともにLYの取り込みについて可視化した。腸バリア破壊を測定するには、LY添加後60分前後、EGTA添加後10分の蛍光を記録すればよい。</li>
	<li>チャンバーカバースリップに触れることなく、準備されたEGTA溶液をウェルごとに3μL追加します。EGTAのチャンバーカバースリップ内の推奨濃度は2 mMです。ウェルあたりの総体積は300 μLである必要があります。</li>
	<li>2 回目のタイムラプスを開始します。定義されたオルガノイドの蛍光を、合計30分間5分の間隔で再び記録します。</li>
	<li>地域の安全規制に従ってすべてを廃棄します。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>EGTA添加後にLYを取り上げたオルガノイドの結果のみを分析する。</li>
	<li>結果はフィジーの ImageJ で定量化できます。</li>
	<li>[ファイル ] をクリックしてデータセットを ImageJで開く |画像データを開いて選択します。次の [BIO フォーマットインポート オプション] ダイアログで、[スタックの表示形式: ハイパースタック] を選択します。</li>
	<li>[分析] をクリックして対象地域 (ROI) マネージャーを開きます。ツール|ROI マネージャー.</li>
	<li>ImageJ メニュー バーの[楕円] 選択ボタンをクリックして、楕円の ROI を描画します。オルガノイドの内腔を含む選択を描きます。次に、ROI マネージャで[追加] を押します。</li>
	<li>オルガノイド以外の 3 つの代表的な領域に対して、この手順を繰り返します。</li>
	<li>メニューバーの[分析]をクリックし、[計測値を設定]を選択します。[平均グレー値のみ]を有効にし、その他の測定を無効にします。次に、[OK]をクリックします。</li>
	<li>ROI マネージャですべての ROI が選択されていることを確認します。ROI マネージャで、[その他] をクリックします。マルチメジャーオプションダイアログで、[すべての [..] スライスを測定し、スライスごとに 1 行を選択します。次に、[OK]をクリックします。</li>
	<li>[結果]ウィンドウですべての値を選択し、さらに分析するためにスプレッドシート アプリケーションにコピーします。 注:オルガノイドの位置がタイムラプスイメージング中に移動した場合、ROIはそれに応じて調整する必要があります。これを行うには、ROI マネージャで正しい ROI を選択し、新しい職位に移動します。次に、ROI マネージャで [更新] をクリックします。ROI マネージャで [計測] をクリックして各タイムポイントの計測を個別に実行し、下部のバーを使用してイメージ ウィンドウの次のタイムポイントに切り替えます。スプレッドシートにすべての測定値を収集します。イメージング期間中のオルガノイドの個々の形状と動きは、手動でデータを分析する必要があります。</li>
	<li>各時間のオルガノイド外の3つのROIの平均強度値を計算します。</li>
	<li>オルガノイドの内腔内のROIの強度を、外側のROIの平均強度とオルガノイド内の平均強度で割ります。</li>
	<li>蛍光光の発光オルガノイドの相対的な増加を計算するために、最小の相対蛍光によって画像化された各時点での相対蛍光(ステップ3.11参照)を分割する。 注:最小限の相対蛍光を使用して、時には、蛍光の拡散が実験の開始時に遅くなることがあるため。</li>
</ol>

<ol>
	<li>L&#243;pez-Posadas, R., St&#252;rzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+GTPases+and+Cytoskeleton+in+Cellular+Barrier+Defects+during+Gut+Inflammation.">Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).</li><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).</li><li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types.">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).</li><li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Measurement+of+Epithelial+Barrier+Permeability+in+Human+Intestinal+Organoids.">Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+transport+was+observed+not+in+hydrophilic+compounds+but+in+dextran+in+Caco-2+cell+monolayers.">Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このアッセイは、生きているオルガノイド内の腸のバリア完全性を研究する技術を提供する。全体のアッセイは、小腸マウスオルガノイドと共焦点の生細胞顕微鏡に基づいています。したがって、オルガノイドの適切な取り扱いを事前に実践することが義務付けられている。分離すると、オルガノイドは、凍結凍結33、99によって日常的に分割され、保存することができる。このアッセイのために、治療を開始する前にオルガノイド48時間を分割することをお勧めします。この期間は、オルガノイドに完全に閉じて球状の構造を形成する機会を与えます。実験のためのオルガノイドの播種は、アッセイ内の重要なステップです。個々の処理のバリエーションを減らすために、シード処理の手順を定期的に行うことをお勧めします。このステップは非常に重要であり、ルーチン処理プロトコルは明らかに実験的な変動を減らします。
シード処理の手順(ステップ1.7)の間に、オルガノイドは標準の10 μLピペットチップを通して反復的な通過によって断片化される。この製品の細孔の大きさは会社によって異なります。この手順は事前に実施する必要があり、結果は常に位相差顕微鏡で確認する必要があります。オルガノイドが所望のサイズに達したら、手順を変更しないでください。
オルガノイドの播種は、利用可能な顕微鏡セットアップに合わせて最適化し、適合する必要があります。少なくとも48時間のオルガノイドを培養および画像化することができるように、インキュベートされた顕微鏡室が絶対に必要である。あなたの要件に合ったチャンバーカバースリップを選択してください。オルガノイドを播種するときは、オルガノイドをカバースリップ表面に集中してください。これは、細胞マトリックスオルガノイド懸濁液を置いた後、5分間氷パック上にチャンバーカバースリップを維持することによって可能です。このステップは、共焦点ライブ細胞イメージングの品質を高めるために重要です。共焦点顕微鏡レンズの軸方向の決断および作動距離は特に限られる。試料をレンズに近づけるほど、より良い画像を作成でき、LY蛍光を励起するために必要なレーザーエネルギーが少なくなります。
光タキシーは、生細胞顕微鏡に関しては重要な問題です。このアッセイでは、このオプションを除外します。機能的なAJCは、オルガノイドのルーメンからLYを排除することによって見える(図1、PBS)。実験の最後にEGTAを添加すると、AJCタンパク質の補因子である二価イオンの隔離が引き起こす。LYは、機能的なAJC複合体を有する重要なオルガノイドでのみオルガノイドの内腔から除外される。一般に、蛍光分子は、腸壁の完全性を測定するために使用することができる。我々は、基底から有端コンパートメント9に腸細胞内でトランス細胞に輸送されるため、ジキストランと標識されたフルオレセインのような他の一般的に使用されるフルオロフォアの代わりにLYを選んだ。また、そのサイズが小さいためLYを選びました。LYは457 Daの分子量を有し、したがって、低分子のバリア透過性の調査を容易にする。蛍光分子は、調査した科学的な質問に応じて選択する必要があります。光毒性AJC欠陥が存在するため、レーザー励起エネルギーを低減するか、イメージング間隔を延長する必要があります。このアッセイの最適な共焦点イメージング技術は、回転円盤顕微鏡です。各機器は、低レーザーパワーでの短い露光時間で共焦点イメージングを可能にします。
異なるモデルは、インビトロで腸のバリア完全性を研究するために既に開発されています。細胞株単層または生体内実験に基づくアッセイの使用は減少しているが、オルガノイドベースの方法は増加している。前に説明した方法とは対照的に4,,5,6,7,我々の方法は、時間の経過と共にバリア関数の定量化を可能にする。これにより、実験の過程でオルガノイドを追加の刺激に曝露することができます。ここでは、実験終了時にEGTAを第2の刺激として、陽性対照として適用します。
生体内の状況とは対照的に、我々のアッセイLYは培地に添加され、外側のバソラテラル上皮側から内側の円膜内腔に向かってオルガノイドを貫通する。LYは小さく、腸の障壁の圧迫感を視覚化するためにのみ使用されます。上端面で上皮層を調節する分子と刺激は、オルガノイドの内腔7に注入される必要がある。実験作業を減らし、同時に多くのオルガノイドのバリア完全性を測定できるように、外部から蛍光色素を適用することを選択しました。
このアッセイを用いて、小腸マウスオルガノイドの密接点におけるIFN-γの機能を調べた。生きているオルガノイドのバリア完全性を分析できたという事実は、腸の障壁の炎症誘発性破壊の阻害剤を記述するためにこの技術を適用する将来の可能性を提供する。IFN−γによって引き起こされるバリア機能の障害を打ち消す物質は、炎症性腸疾患の治療の候補となり得るが、その中でバリア機能障害が病原因子10の一つである。

上皮バリアの完全性は、尖形接合複合体(AJC)によって維持され、これは密接合(TJ)および付着接合(AJ)タンパク質1からなる。AJCの偏光構造は、生体内での機能にとって極めて重要です。AJCの調節不全は様々な疾患に存在し、炎症性腸病態の重要な引き金であると疑われる。腸バリア機能の喪失は、疾患の起点となる事象を表す。次の昏睡状態細菌の転位と炎症反応は、痛みを伴う結果2である。
AJCの規制を調査するために、さまざまなインビトロモデルとインビボモデルが開発されています。トランスウェルアッセイは、腫瘍細胞株に由来した2次元(2D)細胞単層に基づいています。これらのシステムは、光学的および生化学的方法によって評価し、同時に多くのサンプルの分析を可能にするのに良いが、一次細胞および生体内に存在する分化プロセスの多くの特徴を欠いている。バリアの完全性の調査は、動物モデルでも可能です。末期実験では、生体内での特定の治療が腸全体の透過性に及ぼす影響を定量化することができる。しかし、これらのモデルは多くの動物を必要とし、基礎となる分子プロセスの詳細な視覚化を可能にしません。今日改良された3D in vitroモデルは、細胞分化プロセス、細胞偏光を密接に再現し、腸のクリプト・ビラス構造を表す利用可能である3.機能解析のための3D腸器官の適用には、2Dモデルから利用可能な方法の適応が必要です。ここでは、小腸マウスオルガノイドの生きている腸のバリア完全性を調査するモデルについて説明する。このアッセイは、障壁完全性およびそれぞれのタイトな接合タンパク質8に対するIFN-γの影響を調べるために設立された。
培地からルシファーイエロー(LY)を除去した後に蛍光を測定するレスリー4、Zietek5、またはピアース6の技術とは対照的に、我々のアプローチは、時間の経過とともにフルオロフォアの発光取り込みの定量を可能にする。4したがって、結果は動的取り込み速度を表し、我々のアッセイは実験の過程で追加の刺激または阻害剤の適用を可能にする。両アッセイが外側側から内側の円柱表面への取り込み量を測定するという事実は、生体内の状況とは対照的である。Hillら 7 が説明したモデルでは、このトピックが検討されました。フッ素の内腔への蛍光体のマイクロインジェクションの際、蛍光を定量化した。拡散の方向は、生体内に存在する方向を表す。マイクロインジェクションの技術的な努力は明らかにこの方法の効率を減らす。ここで説明するモデルとは対照的に、マイクロインジェクション法は、上皮上皮表面上皮上皮上皮上の生物学的活性化を必要とする効果の測定を可能にする。
ここで示すオルガノイドバリア完全性モデルは、生細胞顕微鏡に基づいており、時間の経過に伴うAJC規制内の動的変化の分析を可能にします。セットアップは、腸の障壁の完全性を誘発し、阻害する物質の薬理学的影響をテストするために適用することができる。さらに、オルガノイドベースのモデルは、薬理学的研究に使用される動物の数を減らすのに役立ちます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well culture plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>#80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 - spinning disc</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>excitation laser 488 nm / emission filter 525/25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 15 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11507411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced, phenol red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Cell matrix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>M. musculus C57/Bl6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslip</td>
			<td></td>
			<td>24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid Growth Medium mouse</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#06005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat#575304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating intestinal barrier breakdown in living organoids

オルガノイドおよび三次元(3D)細胞培養は、従来の細胞培養単層では不可能であったインビトロにおける複雑な生物学的メカニズムおよび規制の調査を可能にする。さらに、単層細胞培養はインビトロモデルシステムでは良いが、複雑な細胞分化プロセスや3D構造に依存する機能を表していない。これはこれまでのところ、動物実験でのみ可能であり、これは手間がかかり、時間がかかり、光学技術によって評価するのが難しいものです。ここでは、小腸マウスオルガノイドの生活におけるバリア完全性を時間の経過とともに定量的に決定するためのアッセイについて述べる。我々のモデルを検証するために、インターフェロンγ(IFN-γ)をバリア破壊の陽性対照として適用し、IFN-γ受容体2由来のオルガノイドはマウスを負の対照としてノックアウトした。このアッセイにより、腸のバリア完全性に対するIFN-γの影響と、密接結合タンパク質クローディン-2、-7、および-15のIFN-γによる分解を決定することができました。このアッセイは、化学物質、タンパク質、毒素、細菌、または患者由来のプローブが腸壁の完全性に及ぼす影響を調べるのにも使用できます。

3D小腸マウスオルガノイドをモデルとして適用し、腸のバリア完全性を調節する化合物の効果を定量化するために、IFN-γを適用した。これを行うために、IFN-γ応答性野生型およびIFN-γ-受容体-2ノックアウトマウスに由来するオルガノイドを単離して培養した。IFN-γまたはPBS(コントロール)で48時間の治療を行った場合、すべてのオルガノイドをLYに曝露し、70分間5分間の共焦点回転円盤ライブ細胞顕微鏡で画像化した。このモデルにおける腸壁の機能的完全性は、オルガノイドの内腔からLYを排除し、LYの内膜蓄積はTJの破壊を意味した。LYによるインキュベーションの70分後の代表的な蛍光顕微鏡画像は、イントラミナルLY蛍光がIFN-γで処理された野生型動物のオルガノイドでのみ見られたことを明確に示している。ノックアウト動物に由来するオルガノイド(IFN-γR2ΔIEC、図1)に対する非刺激性(PBS)コントロールでは、70分後には内皮性LY蛍光は存在しなかった。
EGTAの添加は、TJの補因子を隔離することによって腸壁の完全性の非特異的な内訳を引き起こす。この制御は、実験の最後に、それぞれのオルガノイドがLYを取り込む能力を実証するために常に利用した(図1)。EGTA治療でイントラミンリンLY蛍光が検出されなかった場合、オルガノイドは実験から除外された。
顕微鏡結果の定量的評価のために、LY蛍光をオルガノイドの内腔内およびオルガノイドの外側で測定した。相対強度値を算出し(蛍光内部/蛍光外+内部)、各時点画像について示した。さまざまなサイズのオルガノイドのイメージングを避けることをお勧めします。直径80±30μmのオルガノイドに焦点を当てることを選んだ(図2)。代表的なイメージを持つプロトコルの概略を図 3に示します。いくつかの主要な問題とトラブルシューティングのテクニックを図 4に示し、説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig01.jpg"> 図1:腸バリアの完全性をマウスオルガノイドで解析できる。IFN-γR2WTおよびIFN-γR2ΔIECからのΔIEC腸内オルガノイドを、48時間または未治療のままにしてIFN-γの存在下で培養した。腸バリアの完全性を調べるには、LY(457 Da)を追加し、共焦点蛍光画像を5分間に5分間撮影し、合計70分、EGTAの添加後の代表的な画像(緑色=ルシファーイエロー)を示します。スケールバー= 20 μm)。この図はBardenbacherら 8. から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig02.jpg"> 図2:小腸オルガノイドバリア完全性モデルは、定量的な結果を提供する。(A)LY蛍光はオルガノイドの内外で決定した。相対強度値は、初期相対強度+SEMに対して(内部/蛍光外部+内部)計算され、各時点に対して示されている。(B) 分析されたオルガノイドのサイズ分布表面対体積比の変化による標準偏差と誤差を減らすために、直径80±30μmのオルガノイドのみを分析した。WTIFN-γR2ΔIEC、n= 18)。平均直径値は、異なるグループ間で有意に変化しなかった(一方向ANOVA)。(C)オルガノイドの透過性は、LYを添加した後70分を決定した。70分後の内アルミニウム蛍光強度を、観察期間中に測定された最小相対蛍光強度で割ることによって定義した。各バーは、2つの独立した実験から得られた10のオルガノイドで測定された平均値+SDを表します(IFN-γR2WT、n= 20;IFN-γR2ΔIEC、n= 18)。IFN-γは、IFN-γR2WTオルガノイドでのみLY取り込み量を有意に増加させた。学生の t 検定での p 値 <0.001この図はBardenbacherら 8. から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig03.jpg"> 図 3: 代表的なイメージを使用したスケマティック プロトコル(A) プロトコルの主要なステップの説明。(B) プロトコルの主要なステップの代表的な写真。(B1)透過性分析のために選択された適切なオルガノイドを介した中央スライスのDIC顕微鏡画像。点線は、LYを追加する前に89μm(B2)の同じオルガノイドの蛍光顕微鏡画像を表B1します。B2画像はオルガノイドの自己蛍光を示しています。(B3)LYを添加した後70分のオルガノイドである。描かれたオルガノイドはLYの取り込みがなく、したがって無傷のバリア機能を示す。点線は、さらなる分析のための ROI を示します。オルガノイドの内腔とオルガノイドの周りの3つの代表的な領域がマークされています。(B4)EGTAの添加後のオルガノイド。オルガノイドは、EGTA治療後にLY取り込みが示されるため、さらなる分析に使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig04.jpg"> 図 4: 一般的な問題のトラブルシューティング(A) 一般的な問題と解決策を含むテーブル。(B) 例示的な画像。(B1)このアッセイには適さない大型多分岐オルガノイドのDIC像。(B2)LYが培地に添加される前に高い自己蛍光を示すオルガノイドの共焦点像。オルガノイドを定量から除外した。(B3)LYが培地に添加される前に低自己蛍光を示すオルガノイドの共焦点像。この場合、蛍光を定量化した。(B4)オルガノイドは、EGTAを添加した後30分の培地からLY取り込みがなく、したがって定量から除外された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

ここでは、小腸オルガノイドのバリア完全性を定量化する手法について説明する。この方法が生きているオルガノイドに基づいているという事実は、時間分解された方法で物質またはその組み合わせを調節する異なるバリア完全性の逐次的な調査を可能にする。

生きているオルガノイドにおける腸のバリア破壊の調査

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

腸のバリア完全性を調べたいのち、小腸小器官のマウスにおける腸バリアの完全性を測定する手法を開発しました。これに対し、我々は使用した単層細胞培養を指し、我々のアッセイは3次元の小腸オルガノイドに基づいている。2次元アッセイをモデルに適応させることは、その実用性にとって不可欠でした。このアッセイは、インビトロで培養されたオルガノイドに基づいており、その適用は腸バリア完全性の誘導物質および阻害剤を定義するのに役立ちます。密接タンパク質の調節は、すべての上皮細胞の重要な特徴です。当社のアッセイは、上皮バリア完全性の機能と解析を可能にします。マウスの腸組織から分離されたオルガノイドのバリア完全性を測定するために、まず、プラスチック表面のすべてをカバーするのに十分な0.1%BSAでメッキプロセス中にオルガノイドを保存するために使用される遠心チューブのすべてをプレコートします。すぐにBSA溶液を取り除き、チューブを氷の上に置きます。次に、細胞マトリックス溶液とオルガノイド培養液を氷上で解凍し、48ウェルオルガノイド培養板の各ウェルから培養液を慎重に除去する。細胞マトリックスを溶解するために精力的にピペットする前に、冷たいPBSの1ミリリットルでそれぞれをよく洗います。比較的均質な細胞懸濁液が得られた場合、遠心分離により新鮮なPBSでオルガノイドを2回洗浄し、各オルガノイド培養物を40マイクロリットルの冷媒で再懸濁する。大きなオルガノイド構造を10マイクロリットルピペットチップを5回解化し、40~60マイクロメートルの大きさの構造を収集し、各オルガノイド懸濁液を40マイクロリットルの新たに調製したセルマトリックス溶液と混合します。各オルガノイド細胞マトリックス溶液懸濁液を8つのウェルチャンバーカバースリップの個々の井戸の中央に加え、スライドをアイスパックの上に5分間置きます。インキュベーションの終わりに、スライドを摂氏37度、炭酸ガス5%を20分間置き、オルガノイド細胞マトリックス構造の重合を可能にしてから、細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートするために各ウェルに150マイクロリットルのオルガノイド培養培地を添加する。インキュベーションの終了時に、正のコントロールウェルを、組換えマウスインターフェロンガンマの1ミリリットルあたり10ナノグラムで48時間治療します。透過性アッセイを行うため、チャンバーカバースリップを反転共焦点顕微鏡の37°C加温インキュベーションチャンバーに移し、チャンバーの二酸化炭素を顕微鏡のステージにしっかりとロックして顕微鏡の1ウェルでオルガノイドを視覚化するように設定します。次に、作りたての100ミリモルルルシファーイエローを150マイクロリットルの培地に3マイクロリットル加え、顕微鏡室に1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、基準オルガノイドのルーメンを視覚化するために焦点を合わせ、ルシファー黄色の励起に必要なレーザーエネルギーと、ルシファーイエロー信号を機器の利用可能なダイナミックレンジの30〜40%で画像化するための機器のそれぞれの検出感度を定義します。あるいは、信号強度は露光時間を変更することで変更することができる。微分干渉対ライブイメージングによって、カバースリップ表面に近い球状構造を有する約10個のオルガノイドの位置を見つけ、同等の直径のオルガノイドを捕獲し、オルガノイドの中央スライスに焦点を合わせ、内腔を画像化する。各オルガノイドの形状と自動蛍光を記録するために、各位置の差動干渉コントラストとルシファー黄色蛍光を記録します。すべてのオルガノイドが画像化されたら、ルシファーイエローを含む150マイクロリットルの培地をルシファーイエローの治療井戸に加え、5分ごとにすべての井戸を70分間画像化します。イメージングセッションの終了時に、調製したEGTAを4マイクロリットルの培地に100マイクロリットル加えます。希釈したEGTAを適切なウェルに加えます。次に、オルガノイドの蛍光を5分毎に30分間記録する。細胞の生存率と完全性がアッセイの成功の前提条件であるとして、取り扱いと培養またはオルガノイドを事前に実践してください。本代表的実験では、ルシファー黄色の内皮ルシファー黄色蛍光で70分間の治療の後、インターフェロンガンマで処理された野生型動物のオルガノイドでのみ見える。非刺激性コントロールも、インターフェロンガンマ受容体-2ノックアウト動物由来のオルガノイドも、治療期間の終わりに内アルミナルルシファー黄色蛍光を示さなかった。EGTAの添加は、狭い接合部の共因子を隔離することによって腸壁の完全性の非特異的な崩壊を引き起こし、起源または治療条件に関係なく、すべてのオルガノイドにおけるルシファー黄色の取り込みおよび発現をもたらした。オルガノイド腔内および各オルガノイドの外側のルシファー黄色蛍光レベルの相対強度値も定量化することができる。構成の周りに同等のサイズのオルガノイドを選択し、オルガノイドの中央の内腔を想像できるように、設定された軸を選択してください。腸バリア破壊を誘発する物質を用いれば、腸バリア破壊の抑制に関する戦略も調べることができる。この方法論は単一の動物からの初等細胞に基づいているので、多くのアッセイに使用することができ、各実験に必要な動物の数を減らすことができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

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