Name: investigating intestinal barrier breakdown in living organoids
Uploaded: 2020-03-26T13:00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Tyska forskningsstiftelsen (DFG) [KFO257, projekt 4 till M.S. och projekt 1 till C.B.; FOR2438, projekt 2 till M.S. och E.N. och projekt 5 till C.B.; SFB1181 projekt C05 till C.B.; TRR241, projekt A06 till N.B.L. och M.S., projekt A03 till C.B., BR5196/2-1 till N.B.L. och BE3686/2 till C.B.]; det tvärvetenskapliga centrera för klinisk forskning (IZKF) av kliniskt centrera Erlangen (till M.S., E.N., och M.B.), W. Lutz Stiftungen (till M.S.) och Forschungsstiftungen Medizin av kliniskt centrera Erlangen (till M.S.). Det nuvarande arbetet utfördes i (partiell) uppfyllande av kraven för att erhålla graden Dr Med. av Marco Bardenbacher.

Alla steg slutfördes i enlighet med och efterlevnaden av alla relevanta riktlinjer för tillsyn och institutionsvård av djur.
1. Plätering av organoider
<ol><li>Isolera organoider enligt beskrivningen tidigare3. Förfarandet beskrivs kortfattat nedan.
	<ol>
<li>Samla tunntarmen från möss.</li>
		<li>Öppna tunntarmen längsgående och ta bort villi tips genom att skrapa den inre tarmvävnaden med ett täckslip.</li>
		<li>Skär tarmvävnaden i små bitar med sax.</li>
		<li>Tvätta bitar 5x i kall fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) genom pipettering av bitarna 10x upp och ner med en 25 ml pipett.</li>
		<li>Inkubera vävnadsbitarna i kall 2 mM EDTA-lösning på is i 30 min på en horisontell skakplattform. Låt vävnadsbitarna sedimentera.</li>
		<li>Byt ut EDTA-lösningen mot PBS-bufferten när vävnadsbitarna har lagt sig i botten. Kasta supernatanten och tillsätt 20 ml PBS.</li>
		<li>Släpp tarmkrypterna från vävnaden genom att kraftigt pipettera 10x upp och ner med en 10 ml pipett.</li>
		<li>Samla upp supernatanten i centrifugeringsrör och inspektera den med faskontrastmikroskopi. För att göra detta, tillsätt en droppe av supernatant till en 96 väl cell kultur platta. Håll centrifugeringsrören på is.</li>
		<li>Upprepa steg 1.1.6–1.1.8 tills antalet tarmkrypter i det insamlade supernatanten minskar.</li>
		<li>Passera de fraktioner som innehåller flest kryptor genom en 70 μm cell sil.</li>
		<li>Centrifugera kryptan suspension vid 300 x g, 4 °C i 5 min.</li>
		<li>Kasta supernatanten och resuspend pelleten i kall PBS för att tvätta kryptorna. Upprepa sedan centrifugeringssteget enligt beskrivningen i 1.1.11.</li>
		<li>Resuspend pelleten i totalt 25 μL per brunn av en 1:1 blandning av cellmatrislösning och murine organoid odling medium och platta organoider i en 48 väl cell kultur plattor.</li>
		<li>Inkubera organoiderna vid 37 °C, 5% CO2, i 20 min så att cellmatrislösningen stelnar.</li>
		<li>Täck organoider med 300 μL murine organoid medium per brunn.</li>
		<li>Odla organoiderna vid 37 °C, 5% CO2, ändra mediet var 2-3 dagar.</li>
		<li>Använd organoider för experiment efter 7 dagars kultur.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered organoiderna för barriärintegritetsmätningen.
	<ol>
<li>Förcoat alla centrifugeringsrör som kommer att användas för att lagra organoider under pläteringsprocessen med bovin serum albumin (BSA) genom att lägga till tillräckligt av en 0,1% BSA-lösning i PBS för att täcka alla plastytor. Ta sedan bort BSA-lösningen igen och förvara centrifugeringsrören på is.</li>
		<li>Tina cellmatrislösningen och organoidodlingsmediet på is.</li>
	</ol></li>
	<li>För att separera organoiderna, ta försiktigt bort odlingsmediet och återsuspend organoiderna från en brunn av en 48-brunnsplatta i 1 ml kall PBS. Lös upp cellmatrisen genom kraftig pipettering. Håll alltid organoidupphängningen i centrifugeringsrör förbelagda med BSA och håll alltid på is. OBS: Densiteten, storleken och placeringen av organoiderna i den kamrade täckglidbilden påverkas av det delade förhållandet, cellmatrislösningskoncentrationen och hanteringen av organoid-cellmatrisfjädringen. Det rekommenderas att man i förväg övar hanteringen av cellmatrislösningen. Vanligtvis är åtta välkammarglasöverdrag lämpliga för analysen. Organoider som härrör från en brunn av en konfluent 48 väl platta kan delas upp i två brunnar av en åtta väl kamrade täcken (40 μL av organoid-cell matris pellet per brunn).</li>
	<li>Centrifugera organoidfjädringen vid 300 x g vid 4 °C i 5 min.</li>
	<li>Kassera försiktigt supernatanten och resuspend pelleten med 1 ml kall PBS.</li>
	<li>Centrifugera organoidfjädringen vid 300 x g, 4 °C i 5 min.</li>
	<li>Kassera supernatanten helt och resuspend organoider som härrör från en brunn från en 48 väl platta i 40 μL kallt medium. Fragmentera stora organoidstrukturer genom pipettering av organoidsuspensionen 5x genom en 10 μL pipettspets för att samla upp strukturer med en storlek på 40–60 μm för sådd. OBS: Använd 10 μl spetsen på en 100 μL pipettspets för fragmentering av organoidstrukturerna och öva steg 1.7 i förväg för att säkerställa konsekventa resultat. Kontrollera storleken på organoiderna med faskontrastmikroskopi i centrifugeringsröret. Se till att det inte finns fler multislipade organoider närvarande och att organoidfragmenten är ungefär 40–60 μm långa.</li>
	<li>När organoiderna har fått önskad storlek, blanda dem med 40 μl av cellmatrislösningen (medium:cellmatrislösning = 1:1). OBS: Förhållandet mellan och cellmatrislösning måste hållas konstant för att uppnå konsekventa resultat. Utspädningen av cellmatrislösningen minskar styvheten hos organoidbloben och påverkar dess diffusionsegenskaper. Använd förkylda pipetspetsar (-20 °C) för alla suspensioner som innehåller cellmatrislösning.</li>
	<li>Placera 40 μL av organoid-cell matrislösningsfjädringen i mitten av varje brunn av ett 8 välklade täckslip.</li>
	<li>Håll rutschkanan på en isförpackning i 5 min. Detta bevarar cellmatrisen organoid suspensionsvätska och ökar organoidkoncentrationen vid täckytan genom gravitation.</li>
	<li>Inkubera i 20 min vid 37 °C och 5% CO2 för att möjliggöra polymerisering av organoid-cellmatrisblob.</li>
	<li>Tillsätt 150 μl organoidodlingsmedium per brunn och inkubera i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2 innan du fortsätter med experimentell behandling.
	<ol>
<li>Använd denna period för att behandla organoider och modulera deras barriärintegritet enligt motsvarande vetenskapliga hypotes. För den positiva kontrollen, behandla organoiderna i 48 timmar med IFN-γ för att undersöka IFN-γ tillhörande tät junction nedbrytning och permeabilitet ökning. Stimulera den positiva kontrollen med 10 U/ml (10 ng/ml) rekombinant murine IFN-γ. Lämna organoider av en väl obehandlad.</li>
	</ol></li>
	<li>Odla organoider vid 37 °C och 5% CO2 för upp till 48 timmar.</li>
</ol>2. OrganoidPermeabilitet Analys
<ol><li>Ta mikroskopets inkubationskammare till 37 °C minst 2 timmar innan du påbörjar experimentet för att minska termisk avdrift medan organoiderna avbildas.</li>
	<li>Förbered en 100 mM lösning av LY i PBS. Förvaras på is skyddad från ljus.</li>
	<li>Förbered en 200 mM lösning av EGTA i PBS. Förvara den på is.</li>
	<li>Överför det kamrade täcket, inklusive organoiderna till inkubationskammaren i ett inverterat2 konfokalmikroskop och slå på CO 2-inkubationen (5 %). Se till att det kammade täcket är tätt låst i mikroskopets stadium.</li>
	<li>Med hjälp av organoider i en och en referens, justera bildinställningarna i mikroskopet. Tillsätt LY (3 μL 100 mM LY i 150 μl medium) för att få en slutlig volym på 1 mM LY i 300 μl medium. Inkubera på mikroskopet i 1 h och justera fokus för avbildning av organoidernas lumen. Definiera den laserenergi som krävs för LY-excitation (488 nm) och instrumentets respektive detektionskänslighet och försök att avbilda LY-fluorescensen vid 30–40 % av det tillgängliga dynamiska omfånget för det instrument som används. OBS: Justera laser excitationsenergin och detektionseffektiviteten på obehandlade organoider 70 min efter tillsats av LY. Se till att excitation energi är tillräckligt hög för att få en väl exponerad bild. För att undvika mättnad av LY-fluorescens i mikroskopiska bilder rekommenderas att dessa inställningar justeras efter att LY-diffusionen har nått ett stabilt tillstånd.</li>
	<li>Definiera organoidernas position genom differentialinterferenskontrast (DIC) levande avbildning. Försök att avbilda organoider med jämförbara diametrar (80 ± 30 μm) och fokusera på den centrala delen av organoiderna för att avbilda deras lumen. Definiera ungefär 10 organoider per brunn och försök att avbilda endast organoider nära täckytan med en sfärisk struktur. OBS: Antalet organoider som kan avbildas per körning beror på mikroskopets hastighet. Det rekommenderas att bilden av organoiderna inom ett 5 min intervall. På en vanlig laserscanning mikroskop, 40 positioner totalt är en rimlig utgångspunkt.</li>
	<li>Registrera DIC och LY fluorescens av varje position för att dokumentera organoid form och autofluorescens innan du lägger LY till brunnarna, som används för barriärintegritetsanalysen.</li>
	<li>Avbilda inte organoider som visar hög autofluorescens. Detta beror på ansamling av döda celler i organoid lumen, och resultaten av autofluorescent organoider är svåra att analysera efteråt.</li>
	<li>Späd 3 μL av den beredda LY-lösningen (100 mM LY i 150 μL medium) och tillsätt detta försiktigt till varje brunn utan att vidröra det kamrade täcket. Den rekommenderade koncentrationen av LY per brunn är 1 mM. Den slutliga volymen per brunn bör vara 300 μL.</li>
	<li>Kontrollera snabbt fokus för de definierade positionerna och korrigera om det behövs. OBS: LY sprids snabbt genom cellmatrisen. Därför måste konfikalavbildningen startas inom 3 min efter tillsats av fluorofore.</li>
	<li>Starta en timelapse-bild på mikroskopet. Ta en fluorescensbild av varje position var 5:e minut i totalt 70 minuter. OBS: Organoiderna avbildades i 5 min intervall för att visualisera LY upptag över tiden. För att mäta nedbrytningen av tarmbarriären är det tillräckligt att registrera fluorescensen före och 60 minuter efter LY-tillsats och återigen 10 min efter tillsats av EGTA.</li>
	<li>Tillsätt 3 μl av den beredda EGTA-lösningen per brunn utan att vidröra det kamrade täcket. Den rekommenderade koncentrationen i egta-kammetaften är 2 mM. Den totala volymen per brunn bör vara 300 μL.</li>
	<li>Starta en andra time-lapse. Registrera fluorescensen hos de definierade organoiderna igen med ett intervall på 5 minuter i totalt 30 minuter.</li>
	<li>Kassera allt enligt lokala säkerhetsföreskrifter. OBS: Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>3. Dataanalys
<ol><li>Analysera endast resultaten av de organoider som tog upp LY efter EGTA tillägg.</li>
	<li>Resultaten kan kvantifieras med Fiji ImageJ.</li>
	<li>Öppna datauppsättningen i ImageJ genom att klicka på Arkiv | Öppna och välj bilddata. I följande bioformat importalternativ dialogrutan välj Visa stack med: Hyperstack.</li>
	<li>Öppna regionen av intresse (ROI) chef genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI Manager.</li>
	<li>Rita en oval AVKASTNING genom att klicka på knappen Oval markering i menyraden ImageJ. Rita ett urval som innehåller organoidens inre lumen. Tryck sedan på Lägg till i ROI-hanteraren.</li>
	<li>Upprepa stegen för tre representativa områden utanför organoiden.</li>
	<li>Klicka på Analysera i menyraden och välj Ange mått. Aktivera endast genomsnittligt grått värde och inaktivera alla andra mätningar. Klicka sedan på OK.</li>
	<li>Kontrollera att alla ROIs är markerade i ROI-hanteraren. Klicka på Mer | Multi åtgärd. I alternativdialogrutan väljer du Mät alla [...] segment och En rad per segment. Klicka sedan på OK.</li>
	<li>Markera alla värden i resultatfönstret och kopiera dem till ett kalkylbladsprogram för vidare analys. OBS: Om organoidens position flyttas under tidsfördröjningen måste avkastningen justeras i enlighet med detta. Om du vill göra det väljer du rätt avkastning i ROI-chefen och flyttar den till den nya positionen. Klicka sedan på Uppdatera i ROI-chefen. Utför mätningen för varje timepoint individuellt genom att klicka på Mät i ROI-hanteraren och växla sedan till nästa tidpunkt i bildfönstret med hjälp av fältet längst ned. Samla alla mått i ett kalkylblad. Den individuella formen och rörelsen av organoider under bildperioden kräver analys av data på ett manuellt sätt.</li>
	<li>Beräkna medelintensitetsvärdet för de tre ROIs utanför organoiden för varje timepoint.</li>
	<li>Dividera intensiteten av ROI inuti organoid lumen med medelintensiteten av ROI utanför och medelintensiteten inuti organoid.</li>
	<li>För att beräkna den relativa ökningen av luminal organoid fluorescens, dela den relativa fluorescensen (se steg 3.11) vid varje tidpunkt som avbildas av den minimala relativa fluorescensen. OBS: Använd den minimala relativa fluorescensen, eftersom diffusionen av fluorofore ibland kan vara långsam i början av experimentet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>L&#243;pez-Posadas, R., St&#252;rzl, M., Atreya, I., Neurath, M. F., Britzen-Laurent, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+GTPases+and+Cytoskeleton+in+Cellular+Barrier+Defects+during+Gut+Inflammation.">Interplay of GTPases and Cytoskeleton in Cellular Barrier Defects during Gut Inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1240 (2017).</li><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease:+pathogenesis.">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Leslie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+and+toxin+production+by+Clostridium+difficile+within+human+intestinal+organoids+result+in+disruption+of+epithelial+paracellular+barrier+function.">Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function.</a> Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).</li><li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport,+sensing+and+incretin+secretion.">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 16831 (2015).</li><li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types.">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19 (2018).</li><li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Measurement+of+Epithelial+Barrier+Permeability+in+Human+Intestinal+Organoids.">Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).</li><li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids.">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).</li><li>Tomita, M., Hotta, Y., Ohkubo, R., Awazu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+transport+was+observed+not+in+hydrophilic+compounds+but+in+dextran+in+Caco-2+cell+monolayers.">Polarized transport was observed not in hydrophilic compounds but in dextran in Caco-2 cell monolayers.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (3), 330-331 (1999).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Denna analys erbjuder en teknik för att studera tarmbarriären integritet inom levande organoider. Hela analysen är baserad på små intestinala mus organoider och confocal levande cellmikroskopi. Därför är det obligatoriskt att öva korrekt hantering av organoider i förväg. Vid isolering kan organoider rutinmässigt delas och lagras genom kryofrysning3,9. För denna analys rekommenderar vi att man delar organoiderna 48 timmar innan behandlingen påbörjas. Denna period ger organoiderna chansen att helt stänga och bilda sfäriska strukturer. Såddningen av organoiderna för experimentet är ett kritiskt steg inom analysen. För att minska individuella hanteringsvariationer rekommenderar vi ett rutinförfarande för såddprocessen. Detta steg är avgörande, och ett rutinmässigt hanteringsprotokoll minskar tydligt experimentella variationer.
Under såddproceduren (steg 1.7) fragmenteras organoiderna genom repetitiv passering genom en standard 10 μL pipettspets. Porstorleken på denna produkt varierar från företag till företag. Detta förfarande bör praktiseras i förväg, och resultatet bör alltid kontrolleras med faskontrastmikroskopi. När de organoider som erhållits når önskad storlek, ändra inte proceduren.
Såddningen av organoiderna måste optimeras och anpassas för den tillgängliga mikroskopiska installationen. För att kunna odla och avbilda organoider i minst 48 timmar krävs absolut en inkuberad mikroskopkammare. Välj ett kammarstrum som matchar dina krav. Vid sådd organoider, se till att koncentrera organoider på täcket ytan. Detta är möjligt genom att hålla det kamrade täcket på en isförpackning i 5 min efter att cellmatris-organoid suspension. Detta steg är viktigt för att öka kvaliteten på konfokal levande cell imaging. Den axiella upplösningen och arbetsavståndet för konfokalmikroskoplinser är särskilt begränsade. Ju närmare du tar provet till linsen, desto bättre kan du bild det och mindre laserenergi behövs för att excitera LY fluorescens.
Phototaxis är en viktig fråga när det gäller levande cellmikroskopi. Inom denna analys utesluter vi detta alternativ. En funktionell AJC är synlig genom uteslutning av LY från organoid lumen (Figur 1, PBS). Tillsatsen av EGTA i slutet av experimentet orsakar bindning av bivalentjoner, som är kofaktorer för AJC-proteiner. LY är utesluten från organoid lumen endast i vitala organoider med en funktionell AJC komplex. I allmänhet kan fluorescerande molekyler användas för att mäta tarmbarriärens integritet. Vi valde LY istället för andra vanliga fluorofores såsom fluorescein märkt dextran eftersom de transporteras transcellulärt i tarmceller från basala till det apikala facket9. Vi valde också LY på grund av dess ringa storlek. LY har en molekylvikt på 457 Da och underlättar därför undersökningen av barriärpermeabiliteten för små molekyler. Lysrörsmolekylen måste väljas beroende på den vetenskapliga fråga som undersöks. Eftersom fototoxiska AJC-defekter finns måste laser excitationsenergi minskas eller bildningsintervallet förlängas. Den optimala konfokalavbildningstekniken för denna analys är spinning av skivmikroskopi. Respektive instrument möjliggör konfial avbildning med kort exponeringstid vid låg lasereffekt.
Olika modeller har redan utvecklats för att studera tarmbarriären integritet in vitro. Medan användningen av analyser baserade på cellinje monolayers eller experiment in vivo minskar, organoid-baserade metoder ökar. I motsats till metoder som tidigare beskrivits4,5,6,7, tillåter vår metod kvantifiering av barriärfunktion över tiden. Detta möjliggör exponering av organoider till ytterligare stimuli under experimentets gång. Här tillämpar vi EGTA som en andra stimulans i slutet av experimentet som en positiv kontroll.
I motsats till situationen in vivo, i vår analys LY läggs till i mediet och tränger in i organoid från utsidan basolateral epitelial sida mot insidan apikal lumen. LY är liten och används endast för att visualisera tätheten av tarmbarriären. Molekyler och stimuli som modulerar epitelskiktet vid den apikala ytan måste injiceras i organoidens lumen7. För att minska den experimentella ansträngningen och för att kunna mäta barriärintegriteten hos många organoider samtidigt valde vi att applicera det fluorescerande färgämnet utifrån.
Vi använde analysen för att undersöka funktionen av IFN-γ på den snäva korsningen av små intestinala mus organoider. Det faktum att vi kunde analysera barriärintegriteten hos levande organoider erbjuder framtida möjligheter att tillämpa denna teknik för att beskriva hämmare för den inflammation-inducerad nedbrytning av tarmbarriären. Ämnen som motverkar den nedsatta barriärfunktionen som orsakas av IFN-γ kan vara kandidater för behandling av inflammatoriska tarmsjukdomar, där nedsatt barriärfunktion är en av de patogena faktorerna10.

Epitelbarriärens integritet upprätthålls av det apikala junctionalkomplexet (AJC), som består av snäva korsnings- (TJ) och följsamhetskorsning (AJ) proteiner1. Den polariserade strukturen av AJC är avgörande för dess funktion in vivo. Dysregulation av AJC finns i olika sjukdomar och misstänks vara en viktig utlösande faktor för inflammatoriska tarm patogenes. Förlust av tarmbarriärfunktion representerar den inledande händelsen av sjukdomen. Följande flyttning av commensal bakterier och inflammatoriska reaktioner är de smärtsamma konsekvenserna2.
Olika in vitro- och in vivo-modeller har utvecklats för att undersöka regleringen av AJC. Transwell-analysen är baserad på tvådimensionella (2D) cell monolayers som härleddes från tumör cellinjer. Dessa system är bra att bedöma med optiska och biokemiska metoder och möjliggöra analys av många prover samtidigt men saknar många funktioner i primära celler och differentieringsprocesser som finns in vivo. Att undersöka barriärintegriteten är också möjligt i djurmodeller. I terminalexperiment kan effekterna av specifika behandlingar in vivo på permeabiliteten i hela tarmen kvantifieras. Dessa modeller kräver dock ett stort antal djur, och de tillåter inte detaljerad visualisering av de underliggande molekylära processerna. Numera förbättrade 3D in vitro-modeller finns tillgängliga som nära rekapitulering cell differentiering processer, cellpolarisering, och representerar crypt-villus struktur tarmen3. Tillämpningen av 3D intestinala organoider för funktionella analyser kräver anpassning av tillgängliga metoder från 2D-modeller. Här beskriver vi en modell för att undersöka tarmbarriärens integritet i levande små intestinala mus organoider. Analysen inrättades för att undersöka effekten av IFN-γ på barriärintegriteten och respektive snäva kopplingsproteiner8.
I motsats till den teknik som tillämpas av Leslie4, Zietek5, eller Pearce6, som mäter fluorescens efter avlägsnande lucifer gul (LY) från mediet, tillåter vår metod kvantifiering av luminal upptag av fluorofore över tiden. Därför representerar resultatet ett dynamiskt upptag kinetisk och vår analys möjliggör tillämpning av ytterligare stimuli eller hämmare under experimentet. Det faktum att båda analyserna mäter upptaget från utsidan basolateral sida till insidan apikal yta står i tydlig kontrast till situationen in vivo. I en modell som beskrivs av Hill et al.7, utforskades detta ämne. Vid microinjection av fluorofore i organoid lumen, fluorescens kvantifierades. Riktningen av diffusion föreställer riktningen som är närvarande in vivo. Den tekniska ansträngningen av microinjection minskar tydligt genomströmningen av denna metod. I motsats till den modell som beskrivs här möjliggör mikroinjektionsmetoden mätning av effekter som kräver biologisk aktivering på den apikala epitelytan.
Den organoidbarriärintegritetsmodell som presenteras här är baserad på levande cellmikroskopi och möjliggör analys av dynamiska förändringar inom AJC-förordningen över tid. Inställningen kan användas för att testa den farmakologiska effekten av ämnen som inducer och hämmar tarmbarriärens integritet. Dessutom bidrar organoidbaserade modeller till att minska antalet djur som används för farmakologiska studier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well culture plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>#80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 - spinning disc</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>excitation laser 488 nm / emission filter 525/25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 15 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11507411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation tube 50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow CH dilithium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced, phenol red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Cell matrix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>M. musculus C57/Bl6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverslip</td>
			<td></td>
			<td>24x60 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoid Growth Medium mouse</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#06005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine IFN-&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Cat#575304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating intestinal barrier breakdown in living organoids

Organoider och tredimensionella (3D) cell kulturer tillåter undersökning av komplexa biologiska mekanismer och förordningar in vitro, som tidigare inte var möjligt i klassiska cell kultur monolayers. Dessutom monolayer cell kulturer är bra in vitro-modell system men representerar inte de komplexa cellulära differentiering processer och funktioner som är beroende av 3D-struktur. Detta har hittills bara varit möjligt i djurförsök, som är mödosamma, tidskrävande och svåra att bedöma med optiska tekniker. Här beskriver vi en analys för att kvantitativt bestämma barriärintegriteten över tiden i levande små intestinala mus organoider. För att validera vår modell tillämpade vi interferongamma (IFN-γ) som en positiv kontroll för barriärförstöring och organoider som härrör från IFN-γ receptor 2 knock out möss som en negativ kontroll. Analysen gjorde det möjligt för oss att bestämma effekten av IFN-γ på tarmbarriären integritet och IFN-γ inducerad nedbrytning av den snäva korsningen proteiner claudin-2, -7 och -15. Denna analys kan också användas för att undersöka effekterna av kemiska föreningar, proteiner, toxiner, bakterier, eller patient-härledda sonder på tarmbarriären integritet.

För att validera tillämpningen av 3D små intestinala mus organoider som en modell för att kvantifiera effekten av föreningar som reglerar tarmbarriären integritet, tillämpade vi IFN-γ. För att göra detta isolerade vi och odlade organoider som härrör från IFN-γ lyhörd vildtyp och IFN-γ-receptor-2 knockout möss, som inte svarar på IFN-γ8. Vid behandling i 48 timmar med IFN-γ eller PBS (kontroll) exponerades alla organoider för LY och avbildades av confocal spinning disc levande cellmikroskopi i 5 min intervall under en period av 70 min. Den funktionella integriteten hos tarmbarriären i denna modell resulterade i uteslutning av LY från organoid lumen medan intraluminal ackumulering av LY betecknade förstörelse av TJ. De representativa fluorescens mikroskopiska bilderna efter 70 minuters inkubation med LY visar tydligt att intraluminal LY fluorescens endast var synlig i organoider från vilda djur som behandlats med IFN-γ. Vid oskrida (PBS) kontroller eller i organoider som härrör från knock out djur (IFN-γR2ΔIEC, figur 1), fanns ingen intraluminal LY fluorescens efter 70 min.
Tillsats av EGTA orsakar en ospecificerad uppdelning av tarmbarriären integritet genom att binda TJ kofaktorer. Denna kontroll användes alltid i slutet av experimentet för att visa respektive organoid förmåga att ta upp LY (figur 1). Om ingen intraluminal LY fluorescens upptäcktes vid EGTA behandling, organoid uteslöts från experimentet.
För den kvantitativa utvärderingen av mikroskopiska resultat mättes LY fluorescens inom organoid lumen och utanför organoid. Relativa intensitetsvärden beräknades (fluorescens inuti/ fluorescens utanför + inuti) och visas för varje bild av den tidpunkt som avbildas. Det rekommenderas att undvika avbildning av organoider av varierande storlek. Vi valde att fokusera på organoider med en diameter på 80 ± 30 μm (figur 2). Ett schema av protokollet med representativa bilder visas i figur 3. Några stora problem och felsökningstekniker visas och diskuteras i figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig01.jpg"> Figur 1: Tarmbarriärens integritet kan analyseras i musorganoider. Intestinala organoider från IFN-γR2WT och IFN-γR2ΔIEC odlades i närvaro av IFN-γ för 48 h eller lämnas obehandlad. För att undersöka tarmbarriärens integritet tillsattes LY (457 Da) och konfikotiska fluorescerande bilder fångades i 5 min intervall i totalt 70 min. Representativa bilder vid tidpunkten 0 min, 70 min, och efter tillsats av EGTA visas (grön = Lucifer gul; Skalstång = 20 μm). Denna siffra har ändrats från Bardenbacher et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig02.jpg"> Figur 2: Liten tarmorganoid barriär integritet modell ger kvantitativa resultat. AA) Fluorescens fastställdes i och utanför organoiden. Relativa intensitetsvärden beräknades (inuti/fluorescens utanför + insida) i förhållande till den ursprungliga relativa intensiteten + SEM och visas för varje tidpunkt. (B) Storleksfördelning av analyserade organoider. För att minska standardavvikelsen och felen på grund av förändringar i förhållandet mellan yta och volym analyserade vi endast organoider med en diameter på 80 ± 30 μm. Medelvärdena för respektive organoiddiametrar visas + SD (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). Medeldiametervärdena varierade inte nämnvärt mellan de olika grupperna (enkelriktad ANOVA). (C)Organoidernas permeabilitet fastställdes 70 minuter efter tillsats av LY. Det definierades genom att dividera intraluminal fluorescensintensiteter efter 70 min med de minimala relativa fluorescensintensiteter som uppmättes under observationsperioden. Varje stapel representerar medelvärden + SD, mätt i 10 organoider som härletts från två oberoende experiment (IFN-γR2WT, n = 20; IFN-γR2ΔIEC, n = 18). IFN-γ ökade signifikant LY-upptaget endast i IFN-γR2WT organoider. p-värde <0,001 i Students t-test. Denna siffra har ändrats från Bardenbacher et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig03.jpg"> Bild 3: Schematiskt protokoll med representativa bilder. (A)Schematisk beskrivning av protokollets huvudsteg. b)Representativa bilder av protokollets huvudsteg. (B1) DIC mikroskopi bild av en central skiva genom en lämplig organoid som valdes för permeabilitet analys. Den streckade linjen representerar en bredd på 89 μm.(B2) Fluorescensmikroskopibild av samma organoid i (B1) innan du lägger till LY. Bilden visar organoidens autofluorescens. (B3) En organoid 70 min efter tillsats av LY. Den avbildade organoiden visar inget upptag av LY och därför en intakt barriärfunktion. Prickade linjer visar ROIs för vidare analys. Organoidens inre lumen och tre representativa områden runt organoiden är markerade. (B4) En organoid efter tillsats av EGTA. Organoiden kan kan komma att kunna analyseras vidare eftersom det visar LY-upptag efter EGTA-behandlingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60546/60546fig04.jpg"> Figur 4: Felsökning av vanliga problem. a)Tabell med gemensamma problem och lösningar. (B)Exemplariska bilder. (B1) DIC bild av en stor multibranched organoid som inte är lämplig för denna analys. (B2). Konfika bild av en organoid som visar hög autofluorescens innan LY lades till mediet. Organoid uteslöts från kvantifiering. (B3) Konfial bild av en organoid som visar låg autofluorescens innan LY lades till mediet. Fluorescensen kvantifierades i detta fall. (B4) Organoid visar inget LY upptag från medium 30 min efter tillsats av EGTA och därför utesluten från kvantifiering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60546/60546fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids at JoVE.com

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Här beskriver vi en teknik för att kvantifiera barriärintegriteten hos små tarmorganoider. Det faktum att metoden är baserad på levande organoider möjliggör sekventiell undersökning av olika barriärintegritetsmodulerande ämnen eller kombinationer av dessa på ett tidsuppslöjt sätt.

Undersöka intestinal barriär nedbrytning i levande organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Med syfte att undersöka intestinal barriärintegritet utvecklade vi en metod för att mäta tarmbarriärens integritet hos mus små tarmorganoider. Däremot hänvisar vi till används monolayer cell kultur, är vår analys bygger på tredimensionella små intestinala organoider. Anpassning av en tvådimensionell analys till vår modell var avgörande för dess praktiska.Analysen är baserad på organoider odlade in vitro och dess tillämpning kommer att bidra till att definiera inducerare och hämmare av tarmbarriären integritet. Regleringen av snäva korsningsproteiner är ett viktigt inslag i alla epitelceller. Vår analys möjliggör funktionen och analysen av epitelial barriärintegritet.För att mäta barriären integritet organoider isolerade från mus tarmvävnad, första precoat alla centrifugering rör som kommer att användas för lagring av organoider under pläteringsprocessen med tillräckligt 0,1%BSA i PBS för att täcka alla av plastytor. Ta omedelbart bort BSA-lösningen och lägg tuberna på is. Därefter tina cellmatrislösningen och organoidkulturmediet på is och ta försiktigt bort odlingsmediet från varje brunn av en 48 brunnsorganoid odlingsplatta.Tvätta varje brunn med en milliliter kall PBS innan kraftigt pipettering att lösa upp cellmatriser. När relativt homogena cell suspensioner har erhållits, tvätta organoiderna med färska PBS två gånger genom centrifugeringen och resuspend varje organoid kultur i 40 mikroliter av kallt medium. Dissociate de stora organoid strukturer genom en 10 microliter pipetter spets fem gånger för att samla strukturer med en 40 till 60 mikrometer storlek och blanda varje organoid suspension med 40 mikroliter av nyberedda cellmatrislösning.Lägg till varje organoid cellmatris lösning suspension i mitten av enskilda brunnar av en åtta väl chambered coverslip och placera bilden på en icepack i fem minuter. Vid slutet av inkubationen, placera bilden på 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 20 minuter för att möjliggöra polymerisering av organoid cellmatrisstrukturen innan du lägger till 150 mikroliter av organoid kultur medium till varje brunn för en 24 timmars inkubation i cellkulturen inkubator. Vid slutet av inkubationen behandlar du de positiva kontrollväldarna med 10 nanogram per milliliter rekombinant murin interferon gamma i 48 timmar.För att utföra en permeabilitetsanalys, överför den kammade täcklinen till 37 grader Celsius värmde inkubationskammaren i ett inverterat konfokalmikroskop och ställ in kammarens koldioxid till 5%Lås täcklinan tätt på mikroskopstadiet och justera mikroskopets bildframställningsinställningar för att visualisera organoiderna i en brunn i kammaren. Tillsätt sedan tre mikroliter av nyberedda 100 millimolar Lucifer gul i 150 mikroliter medium till en brunn för en timmes inkubation i mikroskopkammaren. I slutet av inkubationen, justera fokus för att visualisera lumen av referensorganoiden och definiera erforderlig laserenergi för Lucifer gul excitation och respektive detektionskänslighet för instrumentet för att avbilda Lucifer gul signal vid 30 till 40%av instrumentets tillgängliga dynamiska omfång.Alternativt kan signalintensiteten modifieras genom att exponeringstiden ändras. För att hitta positionerna för cirka 10 organoider med en sfärisk struktur nära täckplattan ytan per brunn genom differentiell inblandning kontrast levande avbildning, fånga organoider med jämförbara diametrar och fokusera på den centrala delen av organoider till bilden lumen. Registrera den differentiella inblandning kontrasten och Lucifer gul fluorescens av varje position för att dokumentera form och auto-fluorescens av varje organoid.När alla organoider har avbildats, tillsätt 150 mikroliter medium, inklusive Lucifer gul, till Lucifer gula behandlingsbrunnar och bild alla brunnar var femte minut i 70 minuter. I slutet av bildbehandlingssessionen, tillsätt fyra mikroliter av nyberedda EGTA till 100 mikroliter medium. Tillsätt den utspädda EGTA till lämpliga brunnar.Sedan, spela in fluorescens av organoider i varje brunn var femte minut i 30 minuter. Var noga med att öva hantering och kultur eller organoider i förväg som cellulär livskraft och integritet är en förutsättning för att lyckas med analysen. I detta representativa experiment, efter 70 minuters behandling med Lucifer gul intraluminal Lucifer gul fluorescens var endast synlig i organoider från vilda typ djur som behandlats med interferon gamma.Varken ostimulerade kontroller, eller organoider som härrör från interferon gamma receptor-2 knockout djur visade intraluminal Lucifer gul fluorescens i slutet av behandlingsperioden. Tillägg av EGTA orsakade en ospecifik nedbrytning av tarmbarriären integritet genom att sequestering snäva junction co-faktorer, vilket resulterar i Lucifer gult upptag och uttryck i alla organoider oavsett ursprung eller behandling villkor. De relativa intensitetsvärdena för Lucifer gul fluorescensnivå inom den organoida lumen och utanför varje organoid kan också kvantifieras.Var noga med att välja organoider med en jämförbar storlek runt konfiguration och att välja den inställda axeln så att du kan föreställa dig den centrala lumen av organoid. Förutom att använda ämnen som inducerar tarmbarriärnedbrytning kan vi också undersöka strategier för hämning av tarmbarriärförstörelse. Eftersom denna metod är baserad på primära celler från ett enda djur, kan den användas för många analyser, vilket minskar antalet djur som krävs för varje experiment.

Research

JoVE Journal

Medicine

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

MR-guidad Rubbning av blod-hjärnbarriären med hjälp Transkraniell fokuserat ultraljud i en råttmodell

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funktionell bedömning av intestinal motilitet och tarmväggen Inflammation i Gnagare: Analyser i en standardiserad modell av intestinal manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye

Trabekelverket svar på tryck Elevation i vardags mänskliga ögat

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE geners: Screening av en heptameren-typ liten guide RNA bibliotek för potentiella cancer terapeutiska medel

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murina Modell av Intestinal ischemi-reperfusionsskada

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Exergaming in Older People Living with HIV Improves Balance, Mobility and Ameliorates Some Aspects of Frailty

Exergaming i äldre personer som lever med HIV förbättrar balansen, rörlighet och förbättrar vissa aspekter av Frailty

Approximately 1.2 million people in the United States live with HIV infection. Medical advancements have increased the life expectancy and this cohort is ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysera gynnsamma effekterna av Kosttillskott på intestinala epiteliala barriärfunktioner Under experimentell kolit

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In vitro- analyser för att bedöma blod-hjärnbarriären Mesh-liknande fartygsformation och störning

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...