Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
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这项工作得到了美国陆军医学研究获取活动（USAMRAA）的支持，该奖通过"创意发展奖"获得第1号。W81XWH-18-1-303 和 W81XWH-18-2-0013，此外还有第 1 号奖。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018 和 W81XWH-18-2-0019 前列腺癌生物储存库网络 （PCBN）。国家卫生研究院国家癌症研究所（批准编号RO1CA177984）对作者实验室的资助也得到了承认。Rajvir Dahiya 是退伍军人事务部的高级研究职业科学家，BX004473，由 NIH-UO1CA199694 （RD） 资助。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议，不一定得到国防部或美国陆军的认可。我们感谢朱迪·希格纳加，旧金山VAMC核心设施总监，她协助下Seq 500音序器。

这项研究是按照美国共同规则的伦理准则进行的，并经人类研究机构委员会批准。
1. 微解剖
注：FFPE转移CRPC组织具有腺癌特征（CRPC-Adeno）或NE分化（CRPC-NE）从前列腺癌生物储存网络（PCBN）获得。玻璃玻片上的10微米PCa部分为手动微解剖做好准备，如前18条所述。简要总结：
<ol><li>通过将幻灯片浸泡在二甲苯中（2x，每个10?...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. 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L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

在本文中，我们将描述一种使用经过优化以提高分离RNA的产量和质量的试剂盒从FFPE组织和血清衍生EV中分离RNA的协议。此外，纯化RNA用于生成用于小RNA测序的cDNA库。列出的两个步骤对于确定排序读取的质量和深度都至关重要，而排序读取是运行24的最终结果。因此，优化这些关键步骤对于成功的测序运行至关重要。
FFPE衍生RNA分离的一个重要步骤是用蛋白酶K...

前列腺癌是由雄激素通过AR信号作用的驱动。因此，瞄准AR通路是治疗疾病的主要途径1。然而，由于靶向疗法，抗药性往往随之而来，疾病发展到晚期转移性CRPC2。CRPC由第二代AR治疗，包括苯甲酰胺和阿比拉酮2，3，最初提高存活率。然而，致命变种，如NEPC经常出现在25-30%的治疗CRPC病例，有有限的治疗选择，导致死亡率增加3。NEPC通过称为NED的可逆的分化过程出现，其中PCa细胞经历从腺癌的谱系开关，并显示AR的表达减少和NE系谱标记的表达增加，包括乙烷2（ENO2），色球素A（CHGA）和突触素（SYP）4。鉴于这些抗药性变异是治疗干预的结果，因此必须破译导致产生这种致命、难以治疗的PCa形式的途径。
最近，贝尔特兰等人进行的一项详尽研究破译了NEPC的基因组学，其中分析了拷贝数的改变、突变、单核苷酸多态性（SNPs）和来自患者衍生转移组织的DNA甲基化。尽管在了解这种侵略性形式的PCa的基因组学方面取得了显著进展，但人们对表观遗传因素知之甚少，包括参与CRPC-腺癌向NEPC过渡的小型非编码RNA（微RNA）。微RNA（miRNA）是22bp长的双链RNA，主要通过抑制基因表达，通过序列特异性相互作用与3'未翻译区域（UtRs）的共和mRNA目标6。现已发现几种肿瘤抑制剂和肿瘤抑制剂，它们在调节疾病发病和转移中的作用已在不同癌症中得到了很好的研究。这些小型非编码RNA经常作为控制疾病死亡率的非常重要的目标6，8，9。最近的研究集中在了解miRNA在癌症转移中的副体效应，通过它们在EV中的传输，如外生体，在血液中流动，并允许肿瘤细胞发送这些二次信使转移到转移位置在无核酸酶环境10，11，12。EV携带来自肿瘤细胞的miRNA，从宿主细胞12转移转化效应。因此，将EV识别为肿瘤细胞的二次信使，对于非侵入性疾病严重程度的检测非常有用。
miR-1246在来自腐蚀性PCa的EV中高度调节，它表明疾病严重程度为13。这些与EV相关的miRNA不仅作为该病的非侵入性生物标志物，而且在推动肿瘤发生方面起着重要的作用。因此，必须了解与抗性形式的PCa相关的miRNA表谱的重要性，以便更好地识别非侵入性生物标志物及其功能意义。
下一代测序的出现为研究肿瘤景观的细节提供了最全面的平台，涉及基因组的改变，如突变、染色体重新定位、染色体分治和甲基化，所有这些都对癌症14、15、16的形式和性质有重大贡献。同样，它也是一个必要的工具，以了解发生在肿瘤细胞的巨大表观基因组变化，往往是疾病严重程度17的重要参与者。为了了解与NEPC的产生相关的miRNA谱系，对FFPE转移性CRPC组织及其相应的血清衍生EV进行了小RNA测序。从这两个样本源之一衍生的RNA是（1）产量低和（2）质量不良，由于形式固定和EV分离通常发生降解。此外，生成 cDNA 库是测序运行的关键但繁琐的步骤。因此，分离这些RNA并使用它们生成小RNA测序库的方法需要优化才能生成准确可靠的数据。
有几种方法可以分析不同样品中的miRNA表达，包括RT-PCR、微阵列和原位杂交（ISH）。使用FFPE组织衍生RNA评估RT-PCR和ISH的miRNA表达的协议最近发表于18。较新的技术为在样本中分析 miRNA 表达提供了更详尽和更全面的平台。NanoString nCounter 提供一个敏感的 miRNA 检测平台19，但检测通常受到阵列中可用的 miRNA 数量的限制（+2，000）。在这种情况下，一个更敏感和详尽的平台，如下一代测序提供了更广泛的深度的miRNA识别和同时分析在不同的样本20。该方法已用于确定来自PCa患者21、22、23的尿液或血浆中的miRNA特征。在本篇文章中，提出了使用下一代测序平台研究使用FFPE组织和血清衍生EVRNA与腐蚀性CRPC相关的miRNA曲线的协议。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

雄激素受体（AR）的消融信号通过雄激素剥夺是前列腺癌治疗的第一线，最初导致癌症回归的目标。然而，在大量病例中，该疾病进展于晚期、抗割礼性前列腺癌（CRPC），其治疗选择有限，而且往往具有攻击性。远转移主要观察到在侵略性疾病的这个阶段。CRPC由第二代AR通路抑制剂治疗，最初提高存活率，随后出现治疗阻力。神经内分泌前列腺癌 （NEPC） 是前列腺癌 （PCa） 的罕见变体，通常通过称为神经内分泌分化 （NED） 的变性过程，通过治疗阻力而发展，其中 PCa 细胞经历一个系接开关从腺癌，并显示神经内分泌 （NE） 血统标记的表达增加.除了驱动NEPC进展和分化的基因组变化外，表观遗传因子和微环境线索被认为是推动疾病进展的重要因素。本手稿提供了详细的协议，用于识别与高级 PCa 相关的表观遗传驱动因素（即小型非编码 RNA）。使用来自正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 转移组织和相应血清衍生的细胞外囊泡 （EV） 的纯化微RNA，该协议描述了如何为测序准备具有适当质量控制的库来自这些样本来源的微RNA。从FFPE和EV中分离RNA通常具有挑战性，因为大部分RNA要么降解，要么数量有限。该协议将详细阐述优化RNA输入和cDNA库的不同方法，在测序时产生最具体的读取和高质量的数据。

该库是在RNA分离后制备的，并进行了质量检查。从从微解剖组织和血清衍生的EV中分离出的RNA制备的扩增cDNA库的凝胶纯化如图1和图2所示。适配器连带miRNA的产品尺寸对应于每个样品约136-160 bp。图1A-B被标记为显示应精确切除用于小RNA库制备的凝胶范围。图2A-B显示了微解剖组织和血?...

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Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

治疗阻力经常在晚期前列腺癌患者中发展，在某些情况下，癌症进展到一种称为神经内分泌前列腺癌的致命亚型。评估促进这种转变的微小非编码RNA介导的分子变化，将有助于更好地进行疾病分层，并识别导致神经内分泌前列腺癌发展的因果机制。

从卡西甲抗性前列腺癌患者的甲酸固定组织和血清衍生的外源体对小型非编码RNA进行测序

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

使用此协议，研究人员可以识别新的外膜或细胞外囊泡为基础的和组织为基础的微细胞为晚期前列腺癌。从F-F-B组织和细胞外囊泡中隔离RNA通常是具有挑战性的，因为大部分RNA要么被去创造，要么数量有限。下一代测序为了解肿瘤分子变化提供了最全面的平台，该粒子利用前列腺癌临床样本进行了优化，并可对晚期侵略性前列腺癌的基础生物学提供新颖的见解。从低输入材料优化 C-D-N-A 库是成功测序运行的关键步骤，因此生成高质量的 C-D-N-A 库以获得准确结果非常重要。在进行组织进行微解剖后，如以前一样，在四摄氏度下进行分离，分离出的E-V的Thaw系列患者血清样本。将110微升解冻血清样品转移到一个管子上，在两千次G下旋转30分钟。选择超纳登进行后续的E-V或外体分离，并丢弃德布里颗粒。在30微莱特血清外显体分离试剂到超级纳蒂。孵育它四摄氏度的三十分钟。在一万次 G 下旋转十分钟。在单独的 1.5 毫升管中仔细选择 E-V 超级纳登，而不干扰颗粒，并储存零下 80 摄氏度以进行未来分析。然后在70微升P-B-S中重新悬浮在无核酸酶无水中准备的E-V颗粒。从微解剖组织中隔离总 R-N-A 后，使用商业套件纯化 E-V 将 5 微升的正态 40nogram R-N-A 样品以 3 个素适配器的微升进行 5 微升的规范化 40n1。将热循环器预热至 70 摄氏度，并孵育样品两分钟。立即将样品转移到冰上。在一个单独的管混合两微升结扎缓冲液，一微升的RNase抑制剂和一微升的T4RNA连结两，一个删除突变体。上下混合馅饼床上用品。然后将四微升的混合物加入管子，在冰上使用 R-N-A 3 素适配器。将热循环器预热至 28 摄氏度。将管子放在热循环器中孵育一小时。之后，将一微升止损溶液加入管中，同时将样品留在热循环器上。在28摄氏度下再孵育15分钟。然后立即取出管子，并留在冰上。在单独的管中添加五个素适配器的一微升。转移到预热至 70 摄氏度的热循环器。孵育两分钟立即将管子放在冰上，以防止适配器重新连接。在 D 性质五个素适配器的管中加入一微升十毫摩尔 A-T-P。混合再见馅饼撒尿，并添加一微升的T4 R-N-A连接到混合。混合再见馅饼撒尿。将该混合物的三微升转移到包含三个主要适配器的管内，连接 R-N-A。将管子放在已预热至 28 摄氏度的热循环器上，并孵育一小时。之后，立即将管子转移到冰上，然后继续处理样品，或在零下80摄氏度下储存，供将来使用。要执行 R-T-P-C-R，请使用每个适配器的六个微 liger 连接 R-N-A，并为此添加一个 R-N-A R-T 底土微 liger。将管子转移到预热至 70 摄氏度的热循环器，并孵育两分钟。将管子转移到冰上。在一个单独的管混合两微升5X，股缓冲液，5微升12.5米利莫勒DFT的，一微升100米利摩尔DTT，一微升的R-N-A抑制剂，和一微升的逆转录酶。将这种混合物的五微升加入适配器连接的RNA，并将其转移到已预热至50摄氏度的热循环器中孵育一小时。一小时后，适配器立即将免费DNA连接到冰上。在单独的管中，混合25微升PCR混合物、2微升RNA PCR底材、2微升RNA PCR素板指数和8.5微升RNA自由水。将 37.5 微升添加到适配器连接 CDNA 的 12.5 微升中。将管子转移到预热至 98 摄氏度的热循环器。按照制造商协议中的建议对热循环器进行编程，将循环编号修改为 15。完成后，将样品保持在摄氏四度。继续或储存在零下80摄氏度，供将来使用。要净化连接的免费DNA，请在每个免费DNA样本中加入10微升的DNA加载染料。并至10微升的高分辨率后者和定制RNA后者。在 6% 的 TBE 聚丙烯酰胺凝胶中，在每个单独的通道中运行每个样品的 30 微升。与自定义RNA后和高分辨率后，中间空间之间的两个不同的样品。在一个 X TBE 缓冲液中以 145 伏运行凝胶约 30 至 40 分钟。跟踪装载染料的下蓝色前部。当电泳接近凝胶底部时，停止电泳。将凝胶转移到一个 X TBE 缓冲液中，每毫米溴化乙基 5 微克。在转光器中可视化凝胶，在 145 基对和 160 基对标记之间精确切割凝胶，并略高于 145 基对标记，以避免适配器二丁体污染。关键的一步是纯化连接CDNA，它通过切割凝胶精确，因为适配器二丁字运行非常失去所需的品牌。将凝胶片转移到保存在两毫米收集管中的DNA破碎管中。在两万次 G 下旋转两分钟。并添加三百微升无 RNase 水，并允许它在室温下在摇杆上轻轻旋转过夜。第二天进行DNA沉淀，将管内物转移到5微米过滤管。旋转 600 次 G 严格十秒钟。然后加入两微升的糖原三十微升三摩尔醋酸钠、1X 颗粒漆和 975 微升的 100% 乙醇，以洗脱 DNA。在 4 摄氏度下旋转 17，000 次 G，旋转 20 分钟。丢弃上一液，加入75%的乙醇来清洗颗粒。在4摄氏度的17000倍G下旋转5分钟后，丢弃上经液，在37摄氏度的热块上孵化管子，将乙醇完全蒸发。在PH 8.5下，用12微升的10毫摩尔氯化三氯乙烯重新悬浮颗粒。接下来，通过稀释纯化和免费DNA十次，并使用稀释的CDNA的一微升在生物分析器上运行，执行库质量检查。确保免费DNA产品大小对应于电谱中136到160个碱基对之间的小RNA范围。计算每个样本的总摩尔度。使用 PH 8.5 的三盐酸盐使每个样品标准化为 2 纳米摩尔。通过将两个纳米摩尔样品的等量混合到一个两百微升 PCR 管中，来保持库。遵循手稿中描述的步骤的变性和顺序。在这项研究中，该库是在RNA分离和进行质量检查后编写的。适配器连接微 Rnase 的产品大小对应于每个样品约 136 到 160 个基对。突出显示的部分显示了为制备的小RNA库精确切除的凝胶范围。此图显示了纯化免费 DNA 库的凝胶电泳和电图。微解剖FFPE组织和血清衍生EV的。小型RNA测序运行的代表性指标显示了预期的聚类密度、Q评分、聚类通过滤波器百分比，以及微解剖FFP组织和血清衍生EV的估计产量和误差率。两个样本中的 Q 分数显示高于 3 的值，表示基本呼叫精度的 99.9%。误差率都低于1。图书馆准备的每一步都应认真执行，每次孵化后，应立即将管子转移到冰中。协议中的一个关键步骤是精确切割凝胶，以确保您拥有无适配器的、纯的 CDNA 库。生成 CDNA 库需要优化，以进行高质量的测序运行。了解此协议将有助于观看者从有限源样本中推断出这些微小细节到其他测序库准备，以表明血清和细胞外囊泡。这项技术帮助我们识别出与转移性前列腺癌患者相关的肿瘤攻击性和治疗耐药性的新微鼻。这些技术可以推断到其他疾病类型，可以帮助小说生物标志物的发现。由于该技术使用生物材料，如条纹衍生血清和组织样本，应采取适当的预防措施。此外，溴化乙基是一种已知的致癌物质，应使用本议定书非常谨慎地处理。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

科研

癌症研究

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

雄激素依赖性和去势抗性前列腺癌的荧光自体小鼠模型

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

22C3 Anti-PD-L1 抗体精矿在非小细胞肺癌活检及细胞学标本中的应用

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

福尔马林固定癌组织标本免疫肿瘤学自动复合免疫荧光小组研究

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

利用成像质谱技术捕获组织与细胞之间的小分子通信

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

免疫荧光对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的半自动PD-L1特征化及枚举

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

卵巢癌组织线粒体的制备与控制卵巢组织进行定量蛋白质组学分析

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

用于低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动解剖方案

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 测序的三种微分表达分析方法：利马、边缘、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...