Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על-ידי הפעילות הרפואית של הצבא האמריקאי לחקר המחקר (USAMRAA) באמצעות פרס התפתחות הרעיון של הפרס לא. W81XWH-18-1-303 ו W81XWH-18-2-0013 ובנוסף על ידי הפרס לא. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH 18-2-0018, ו W81XWH-18-2-0019 סרטן הערמונית ביווריפוטורי רשת (PCBN). מימון תמיכה המחברים ' מעבדה על ידי המכון הלאומי לסרטן במוסדות הלאומי לבריאות (גרנט מספר RO1CA177984) מוכרת גם. רג'ביר דהיי הוא מדען בכיר בקריירה מחקר במחלקה לענייני ותיקי, BX004473 וממומן על ידי NIH-UO1CA199694 (RD). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחבר והן לא בהכרח אושרו על ידי משרד הביטחון או צבא ארה ב. אנו מודים לג Shigenaga, מנהל מתקן הליבה בסן פרנסיסקו VAMC, עבור עזרתה עם NextSeq 500 ברצף.

מחקר זה נערך בהתאם להנחיות המוסריות של הכלל המקובל בארה ב ואושר על ידי הוועדה המוסדית לחקר האדם.
1. מיקרודיסקציה
הערה: הרקמות CRPC גרורות עם תכונות אדנוקרצינומה (CRPC-Adeno) או NE בידול (CRPC-NE) הושגו מסרטן הערמונית ביווריפוטורי רשת (PCBN). 10-מיקרון PCa סעיפים על שקופ?...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לבודד RNA מ-FFPE רקמות ו-סרום נגזר EVs באמצעות ערכות שהיו ממוטבת כדי להגדיל את התשואה והאיכות של RNAs מבודדים. עוד, RNAs מטוהרים שימשו כדי ליצור ספריות cDNA עבור רצפי RNA קטן. שני השלבים המפורטים הם הכרחיים בקביעת האיכות והעומק של קריאות הרצף הבאות הן התוצאה הסופית מהפעלת<sup...

סרטן הערמונית מונע על ידי אנדרוגנים משחק דרך איתות AR. לכן, מיקוד מסלול AR הוא הטיפול הבעד של המחלה1. עם זאת, התנגדות לעתים קרובות מנסחלת כתוצאה של טיפולים ייעודיים והמחלה מתקדמת ל-CRPC גרורתית מתקדם2. Crpc הוא טיפל בדור השני של טיפול AR הכולל enzalutamide ו abiraterone2,3 אשר משפר את ההישרדות בתחילה. עם זאת, משתנים קטלניים כגון NEPC לעתים קרובות להגיח 25 ל 30% של מקרים CRPC מטופלים שיש להם אפשרויות טיפול מוגבלות, המוביל לתמותה מוגברת3. Nepc נוצר באמצעות תהליך בידול הפיך המכונה נד, שבו pca תאים לעבור מעבר השושלת אדנוקרצינומות ולהראות ירידה ביטוי של AR וביטוי מוגבר של סמני השושלת NE כולל אנולאז 2 (ENO2), כרומוגראנס a (chga), ו synaptophysin (syp)4. בהינתן כי אלה משתנים התנגדות להיווצר כתוצאה של התערבויות טיפוליות, זה חיוני לפענח מסלולים המובילים לדור של זה קטלני, קשה לטפל בצורה של PCa.
הגנומיקה של NEPC פוענח לאחרונה במחקר ממצה שנעשה על ידי באלטרן אל. לפיו העתקת מספר שינויים, מוטציות, נוקלאוטיד יחיד מערכת פולימורית (SNPs), ו-DNA מתילציה מ החולה-נגזר רקמות גרורתי נותחו5. למרות התקדמות משמעותית בהבנת הגנומיקה של צורה זו אגרסיבי של PCa, מעט ידוע על הגורמים האפיגנטיים, כולל RNAs קטן לא קידוד (microRNAs) כי הם מעורבים במעבר של CRPC-אדנוקרצינומה כדי NEPC. Micrornas (mirnas) הם 22 bp ארוך, כפול תקועים rnas כי לפעול בעיקר על ידי דיכוי ביטוי הגנים לאחר ההמרה על ידי אינטראקציות ספציפיות רצף עם 3 '-אזורים בלתי מתורגמים (utrs) של מטרות mrna הקנצוני6. כמה oncomirs ו דכאי הגידול כבר זוהו, ואת תפקידם בוויסות התפרצות המחלה גרורות כבר נחקרו היטב בסוגי סרטן שונים6,7. אלה שאינם קידוד קטן rnas לעתים קרובות משמשים מטרות חשובות מאוד בשליטה תמותת מחלות6,8,9. מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו הבנת ההשפעות הפרפרין של miRNAs בסרטן גרורות דרך התחבורה שלהם ב EVs, כגון אקסוזומים, כי זרימה במחזור הדם ולאפשר לתאי הגידול לשלוח אלה שליחים משניים למיקומים גרורתית בסביבה חופשית nuclease10,11,12. EVs לסחוב miRNAs מתאי הגידול כדי להעביר את ההשפעות שינוי צורה של תאים מארחים12. זיהוי של EVs כמו שליחים משניים של תאים סרטניים יכול אפוא להיות שימושי זיהוי לא פולשני של חומרת המחלה.
מיר-1246 הוא מאוד upregulated ב EVs מ אגרסיבי PCa, וזה מצביע על חומרת המחלה13. אלה miRNAs הקשורים EV לא רק לשמש בסמנים בלתי פולשנית של המחלה, אלא גם לשחק תפקידים חשובים פונקציונלית בנהיגה tuמוריגנזה. כך, חיוני להבין את המשמעות של רפרטואר miRNA כי הוא קשור לצורות עמידות של PCa כדי לאפשר זיהוי טוב יותר של סמנים שאינם פולשנית, כמו גם משמעותם הפונקציונלית.
הופעתו של רצף הדור הבא הציע את הפלטפורמה המקיפה ביותר כדי ללמוד את הפרטים של נוף הגידול מעורבים שינויים הגנום כגון מוטציות, מיקומים מחדש כרומוזום, כרומופרזיס, ו מתילציה, כולם תורמים באופן משמעותי לצורה ולטבע של סרטן14,15,16. כמו כן, הוא גם כלי חיוני כדי להבין את שינויים אפיגנומית המכריע המתרחשים בתא הגידול, כי הם לעתים קרובות שחקנים חשובים בחומרת המחלה17. במטרה להבין את הרפרטואר miRNA הקשורים הדור של NEPC, רצפי RNA קטן בוצע על רקמות הקרמד גרורות FFPE ואת הסרום המקביל שלהם נגזר EVs. RNA נגזר מכל אחד מאותם שני מקורות לדוגמה הוא (1) נמוך בתשואה ו (2) של איכות רעה בשל השפלה כי לעתים קרובות קורה בשל קיבעון פורמלין ו-EV בידוד. יתר על כן, יצירת ספריות cDNA היא קריטית, אבל מסורבלת, צעד של רצף הפעלה. כך, שיטות לבידוד RNAs אלה ושימוש בהם כדי ליצור ספריות עבור רצפי RNA קטנים דורשים אופטימיזציה כדי להפיק נתונים מדויקים ואמינים.
קיימות מספר שיטות לפרופיל ביטוי miRNA בדגימות שונות, כולל RT-PCR, מיקרו-מערכים והיברידיזציה באתרו (ISH). פרוטוקול המשתמש ב-RNA הנגזר מרקמות FFPE כדי להעריך את ביטוי miRNA על ידי RT-PCR ו-ISH פורסם לאחרונה18. טכנולוגיות עדכניות יותר מציעות פלטפורמות ממצה ומקיפות יותר ליצירת פרופיל ביטוי miRNA במדגם. ננו מחרוזת nCounter מציע פלטפורמת זיהוי miRNA רגיש19, אבל הזיהוי מוגבל לעתים קרובות על ידי מספר mirna הזמינים במערך (~ 2,000). בתרחיש כזה, פלטפורמה רגישה יותר וממצה כגון רצף הדור הבא מציעה עומק רחב בהרבה של זיהוי מירנא ויצירת פרופיל סימולטני בדגימות שונות20. השיטה שימש כדי לקבוע את החתימות mirna ב שתן או פלזמה מ-pca חולים21,22,23. במאמר הנוכחי, פרוטוקול מוצג להשתמש פלטפורמת רצף הדור הבא כדי לחקור פרופילי miRNA הקשורים CRPC אגרסיבי באמצעות רקמות FFPE ו-EV RNAs נגזר סרום.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

אבלציה של קולטן האנדרוגן (AR) איתות על ידי מניעת אנדרוגן היא המטרה של הקו הראשון של טיפול בסרטן הערמונית שגורמת בתחילה רגרסיה הסרטן. עם זאת, במספר משמעותי של מקרים, המחלה מתקדמת מתקדם, סירוס עמידים בסרטן הערמונית (CRPC), אשר יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות הוא לעתים קרובות אגרסיבי. גרורות רחוקות נצפה בעיקר בשלב זה של המחלה האגרסיבית. CRPC מטופלת על ידי דור שני של מעכבי מסלול AR כי לשפר את ההישרדות בתחילה, ואחריו הופעתה של התנגדות תרפיה. סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים (NEPC) הוא גרסה נדירה של סרטן הערמונית (PCa) כי לעתים קרובות מתפתחת כתוצאה של התנגדות תרפיה דרך תהליך בידול המכונה בידול נוירואנדוקרינים (נד), שבו תאים PCa לעבור מעבר השושלת מ אדנוקרצינומות ולהראות ביטוי מוגבר של סמני השושלת הנוירואנדוקריניים (NE). בנוסף על שינויים גנומית המניע את ההתקדמות ואת השינויים כדי NEPC, גורמים אפיגנטיים ורמזים microenvironmental נחשבים שחקנים חיוניים התקדמות המחלה הנהיגה. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט כדי לזהות את הנהגים epigenetic (כלומר, RNAs קטנים שאינם קידוד) המשויכים PCa מתקדם. באמצעות מיקרורונאס מטוהרים מתוך formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) רקמות גרורתי מתאים הסרום הנגזר הנגזרות ושלפוחיות (EVs), הפרוטוקול מתאר כיצד להכין ספריות עם בקרת איכות המתאימה לרצף מיקרורונאס ממקורות אלה לדוגמה. בידוד רנ א משניהם FFPE ו EVs הוא לעתים קרובות מאתגרת, כי רוב זה מושפל או מוגבל בכמות. פרוטוקול זה יהיה להרחיב על שיטות שונות כדי לייעל את כניסות RNA וספריות cDNA כדי להניב קריאות ספציפיות ביותר ונתונים באיכות גבוהה על רצף.

הספרייה הוכנה לאחר בידוד רנ א ובדיקת איכות בוצעה. ג'ל טיהור עבור הספרייה cDNA מוגבר הכין מ RNA מבודדים מרקמות microdissected ו-סרום נגזר EVs מוצג באיור 1 ואיור 2. גודל המוצר עבור מתאם-ligated מקשר התכתב על 136-160 bp עבור כל מדגם. איור 1א-ב מסומנים כדי להצי...

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

התנגדות תרפיה מתפתחת לעתים קרובות בחולים עם סרטן הערמונית מתקדם, ובמקרים מסוימים, סרטן מתקדם לסוג קטלני שנקרא סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים. הערכת קטן ללא קידוד RNA-תיווך שינויים מולקולריים המאפשרים מעבר זה יאפשר מחלות טוב יותר ריבוד וזיהוי של מנגנונים סיבתי המובילים לפיתוח של סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים.

רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

עם השימוש בפרוטוקול זה החוקרים יכולים לזהות exome הרומן או חוץ תאי מבוסס מיקרו הסלולר מבוסס רקמות עבור סרטן הערמונית מתקדם. בידוד RNA הן מרקמות F-F-B והן מזרעים חוץ-תאיים הוא לעתים קרובות מאתגר מכיוון שרובו נוצר או נמצא בכמות מוגבלת חלקיק זה ירחיב על שיטות שונות כדי לייעל את תשומות R-N-A וספריות C-D-N-A לגנים נתונים ספציפיים ביותר בחינם ובאיכות גבוהה עבור רצף הדור הבא. רצף הדור הבא מציע את הפלטפורמה המקיפה ביותר להבנת שינוי מולקולה בגידול העומד בבסיס התקדמות הגידול חלקיק זה מותאם עם מדגם קליני לסרטן הערמונית, והוא יכול לספק תובנות חדשניות על הביולוגיה הבסיסית של סרטן הערמונית אגרסיבי מתקדם.אופטימיזציה של ספריות C-D-N-A מחומר קלט נמוך היא צעד מכריע להפעלת רצף מוצלחת ולכן חשוב מאוד ליצור ספריות C-D-N-A באיכות גבוהה כדי לקבל תוצאות מדויקות. לאחר ביצוע ניתוח מיקרו של רקמות כפי שנעשה בעבר להמשיך בידוד סרום נגזר E-V של Thaw שורות של דגימות סרום החולה בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 110 מיקרו ליטרים של דגימת סרום מופשרת לצינור ומסתובבים ב-2,000 פעמים G במשך שלושים דקות.בחר את הנדן סופר עבור E-V הבאים או בידוד exosome ולהשליך את גלולת דברה. ב 30 microleters של סרום אקסוסום בידוד reagent לסופר natent. דגירה זה ארבע מעלות צלזיוס במשך שלושים דקות.סובב בעשרת אלפים פעמים G במשך עשר דקות. בחר את E-V סופר nadent בזהירות מבלי להפריע גלולה בצינור נפרד 1.5 מיליליטר ולאחסן מינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי. ואז להשעות מחדש את גלולת E-V ב 70 מיקרו ליטרים של P-B-S מוכן במים ללא גרעין.לאחר בידוד R-N-A הכולל מרקמות מיקרו ניתוח, ו E-V מטוהרים של באמצעות ערכות מסחריות לבצע הכנת הספרייה לתוך חמישה מיקרו ליטר של מדגם R-N-A מנורמל ארבעים גרם למיקרו ליטר במיקרו ליטר אחד של שלושה מתאם ראשוני. מחממים מראש את האופניים התרמיים ל-70 מעלות ומדגרים את הדגימה לשתי דקות. מיד להעביר את הדגימות על קרח.בצינור נפרד לערבב שני ליטרים זעירים של חיץ קשירה, מיקרו ליטר אחד של מעכב RNase ומיקרו ליטר אחד של T4 RNA ligase שתיים, מוטציה מחיקה. מערבבים מצעי פאי ליפה למעלה ולמטה. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיקרו ליטרים של התערובת לצינור עם מתאם R-N-A 3 פריים על קרח.מחממים את העגל התרמי ל-28 מעלות צלזיוס. ולמקום את הצינור במחזור התרמי כדי דגירה במשך שעה אחת. לאחר מכן, להוסיף מיקרו ליטר אחד של פתרון עצירה לתוך הצינור תוך שמירה על המדגם על האופניים התרמיים.דגירה ב 28 מעלות צלזיוס לעוד 15 דקות. ואז מיד להסיר את הצינור ולשמור על קרח. בצינור נפרד להוסיף מיקרוליטר אחד של חמישה מתאם ראשוני.העברה למחזור תרמי שחומם מראש ל-70 מעלות צלזיוס. ותתגרה במשך שתי דקות. מיד למקם את הצינור על הקרח כדי למנוע reannealing של המתאמים.הוסף מיקרו ליטר אחד של עשרה מילימול A-T-P לצינור של D טבע חמישה מתאם עיקרי. מערבבים את ההיפוך של עוגת לירה ומוסיפים מיקרו ליטר אחד של קשירה T4 R-N-A לתערובת. מערבבים מצעי פאי לים.העבר שלושה מיקרוליטרים של תערובת זו לצינור המכיל את שלושת המתאם העיקרי קשירה R-N-A. מניחים את הצינור על האופניים התרמיים כי כבר מחומם מראש ל 28 מעלות צלזיוס ודגירה במשך שעה אחת. לאחר מכן מיד להעביר את הצינור על הקרח או להמשיך עוד יותר עם הדגימות או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.כדי לבצע R-T-P-C-R, השתמש בשישה ליג'רים זעירים של כל מתאם המגררים R-N-A והוסף לו מיקרו-ליגר אחד של R-N-A R-T. מעבירים את הצינור למחזור התרמי שחומם מראש ל-70 מעלות ומטמיעה במשך שתי דקות. העבר את הצינור לקרח.בצינור נפרד לערבב שני מיקרו ליטר של 5X, חיץ גדיל, 5 מיקרו ליטר של 12.5 milimoler DNTP של, מיקרו ליטר אחד של 100 milimolar DTT, מיקרו ליטר אחד של מעכבי R-N-A, ומיקרו ליטר אחד של תעתיק הפוך. הוסף חמישה microliters של תערובת זו RNA קשירה מתאם ולהעביר אותו למחזור התרמי כי כבר שחומם מראש ל 50 מעלות צלזיוס כדי דגירה במשך שעה אחת. לאחר שעה להעביר את המתאם קשירה DNA חינם מיד לקרח.בצינור נפרד, מערבבים 25 מיקרוליטרים של תערובת PCR, שני מיקרו ליטרים של פריימר PCR RNA, שני מיקרו ליטרים של אינדקס פריימר PCR RNA, ו 8.5 microliters של מים חינם של RNA. הוסף 37.5 מיקרוליטרים של תערובת זו ל-12.5 מיקרוליטר של CDNA עם חיבור מתאם. מעבירים את הצינור למחזור התרמי שחומם מראש ל-98 מעלות צלזיוס.תכנת את רכיב האופניים התרמי כפי שהוצע בפרוטוקול היצרן כאשר מספר המחזור שונה ל- 15. לאחר השלמת, לשמור על המדגם בארבע מעלות צלזיוס. המשך או אחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.כדי לטהר את הדנ"א המשלים, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של צבע טעינת הדנ"א לכל דגימת דנ"א משלימה. ול-10 מיקרוליטרים של הרזולוציה הגבוהה האחרונה וה-RNA המותאם אישית. הפעל 30 מיקרוליטרים של כל מדגם בשני נתיבים נפרדים הסמוכים זה לזה בג'ל פוליאקרילמיד TBE שישה אחוזים.עם RNA מותאם אישית האחרון ברזולוציה גבוהה האחרון, רווח הביניים בין שתי דגימות שונות. הפעל את הג'ל במאגר X TBE אחד ב 145 וולט במשך כ 30 עד 40 דקות. עקוב אחר החזית הכחולה התחתונה של צבע הטעינה.עצרו את האלקטרופורזה כשהיא מתקרבת לתחתית הג'ל. מעבירים את הג'ל במאגר X TBE אחד עם 5 מיקרוגרם לאתידיום ברומיד מילימטר. דמיינו את הג'ל בטרנסילומינטור וחתכו את הג'ל בדיוק בין 145 סמני הבסיס ל-160 סמני זוג הבסיס ומעט מעל סמן 145 זוג הבסיסים כדי למנוע זיהום עם עמעום מתאם.צעד קריטי הוא טיהור CDNA מגררת שנעשה על ידי חיתוך הג'ל בדיוק כמו עמעום מתאם לרוץ מאוד לאבד את המותג הרצוי. מעבירים את חתיכות הג'ל לצינורות שבירת דנ"א שנשמרו בשני צינורות איסוף מילימטר. תסתובב ב-20 אלף פעמים למשך שתי דקות.ולהוסיף 300 מיקרו ליטרים של מים נטולי RNase ולאפשר לו להסתובב בעדינות על נדנדה לילה בטמפרטורת החדר. כדי לבצע את משקעים DNA ביום שלמחר להעביר את התוכן של הצינור ל 5 צינורות מסנן מיקרון. ספין 600 פעמים G במשך עשר שניות בלבד.לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של גליקוגן שלושים מיקרוליטרים של שלושה נתרן אצטט טוחן, צבע גלולה 1X ו-975 מיקרוליטרים של 100 אחוז אתנול לדנ"א אלוט. סובב ב 17, 000 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. להשליך את supernatant ולהוסיף 75 אחוז אתנול לשטוף את גלולה.לאחר ספינינג ב 17,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות להשליך את העל-טבעי דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס על בלוק תרמי לחלוטין להתאדות את האתנול. להשעות מחדש את גלולה עם 12 microliters של 10 מילימולר טריידר כלוריד ב PH 8.5. לאחר מכן לבצע בדיקת איכות הספרייה על ידי דילול DNA מטוהרים חינם עשר פעמים באמצעות microliter אחד של CDNA מדולל לרוץ על bioanalyzer.ודא שגודל מוצר הדנ"א המשלים תואם לטווח ה-RNA הקטן באלקטרופרוגרמה בין 136 ל-160 זוגות בסיסים. חשב את הטוטנות הכוללת עבור כל דגימה. לנרמל כל מדגם ל 2 nanomolar באמצעות טריס הידרוכלוריד ב PH 8.5.החזק את הספריות על-ידי ערבוב כמויות שוות של כל דגימת ננו-מולאר בצינור PCR יחיד של מאתיים מיקרוליטר. התנערות ורצף בעקבות השלבים כמתואר בכתב היד. במחקר זה הוכנה הספרייה לאחר בידוד RNA ובוצעו בדיקות איכות.גודל המוצר עבור מיקרו Rnase קשור מתאם התאים כ 136 כדי 160 זוגות בסיס עבור כל מדגם. הקטעים המודגשים מראים את מגוון הג'ל שנצץ במדויק לספריית הכנה קטנה של RNA. איור זה מראה את אלקטרופורזת הג'ל ואת האלקטרופרוגרמות לספריית הדנ"א המטוהרת.מיקרו לנתח רקמת FFPE וסרום נגזר EV של. המדדים הייצוגיים מהפעלה קטנה של רצף RNA מדגימים את צפיפות האשכולות הצפויה, ציון Q, אחוז מסנן עובר באשכול ואת שיעורי התשואה והשגיאות המשוערים עבור רקמת FFP וסרום שנגזרו ממיקרו. ציון ה- Q בשתי הדגימות הראה ערך מעל שלוש המציין 99.9 אחוזים של דיוק שיחת הבסיס.ותעריפי השגיאה היו כולם מתחת לאחד. כל שלב בהכנת הספרייה צריך להתבצע בקפידה צינורות יש להעביר מיד לקרח לאחר כל דגירה. שלב קריטי בפרוטוקול הוא חיתוך הג'ל בדיוק כדי להבטיח שיש לך ספריית CDNA נטולת עמעום מתאם.יצירת ספריית CDNA דורשת מיטוב להפעלת רצף באיכות גבוהה. הבנת פרוטוקול זה תסייע לצופים לשער פרטים קטנים אלה להכנה אחרת של ספריית רצף מדגימות מקור מוגבלות להציע סרום ו vesicles חוץ תאיים. טכניקה זו סייעה לנו בזיהוי מיקרונאז חדש הקשורים תוקפנות הגידול והתנגדות טיפול בחולים בסרטן הערמונית גרורתי.טכניקות אלה יכולות לשער לסוגי מחלות אחרים שיכולים לסייע בגילוי סמן ביולוגי חדשני. כמו טכניקה זו משתמשת בחומרים ביולוגיים כגון סטריציה נגזר סרום ודגימות רקמה, יש לנקוט אמצעי זהירות מתאימים. כמו כן, אתידיום ברומיד הוא מסרטן ידוע ויש לטפל בו בזהירות רבה באמצעות פרוטוקול זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

באמצעות 22C 3 נוגדן Anti-PD-L1 להתרכז ביופסיה ודוגמאות ציטולוגיה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

הכנת מיטוכונמיטומיה של רקמות סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטאומוניקס כמותיים

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף RNA: לימה, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...