Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
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この作品は、米国陸軍医学研究買収活動(USAMRAA)が、受賞番号のアイデア開発賞を通じて支援しています。W81XWH-18-1-303およびW81XWH-18-2-0013およびさらに賞番号によって。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0019前立腺癌バイオリポジトリネットワーク(PCBN)。国立衛生研究所の国立がん研究所(助成金番号RO1CA177984)による著者研究室への資金援助も認めされています。Rajvir Dahiyaは、BX004473退役軍人省のシニアリサーチキャリアサイエンティストであり、NIH-UO1CA199694(RD)の資金提供を受けています。意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省または米国陸軍によって承認されるものではありません。サンフランシスコVAMCの中核施設ディレクターであるジュディ・シゲナガ氏が、NextSeq 500シーケンサーの支援をいただいたことに感謝しています。

この研究は、米国共通規則の倫理指針に従って行われ、人間研究に関する機関委員会によって承認された。
1. マイクロダイセクション
注:腺癌特徴(CRPC-アデノ)またはNE分化(CRPC-NE)を有するFFPE転移性CRPC組織は、前立腺癌バイオレポジトリネットワーク(PCBN)から得られた。ガラススライド上の10ミクロンPCaセクションは、前に説明したように?...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

この記事では、単離されたRNAの収率と品質を高めるために最適化されたキットを使用して、FFPE組織および血清由来EVからRNAを分離するプロトコルについて説明します。さらに、精製されたRNAを用いて、小型RNAシーケンシング用のcDNAライブラリーを生成した。リストされている両方のステップは、実行24からの最終結果であるシーケンス読み取りの品質と深さを決定する際に?...

前立腺癌は、ARシグナル伝達を介して作用するアンドロゲンによって駆動される。従って、AR経路を標的とすることは、疾患1の主力治療法である。しかし、耐性は、標的療法の結果としてしばしば起こり、疾患は進行性転移性CRPC2に進行する。CRPCは、エンザルタミドとアビラテロン2、3を含む第2世代のAR療法によって治療され、最初は生存を改善する。しかし、NEPCのような致死的な変異体は、治療オプションが限られている治療CRPC症例の25~30%に出現することが多く、死亡率3の増加につながる。NEPCは、NEDとして知られる可逆的トランス分化プロセスを介して生じ、ここでPCa細胞は腺癌からの系統スイッチを受け、ARの発現の減少およびエノラーゼ2(ENO2)、クロクロニンA(CHGA)、およびシナプトフィシン(SYP)4を含むNE系統マーカーの発現の増加を示す。これらの耐性変異体が治療介入の結果として生じることを考えると、PCaの治療が困難なこの致命的な、治療が困難な生成につながる経路を解読することが不可欠である。
NEPCのゲノムは最近、Beltranらによって行われた徹底的な研究で解読され、それによってコピー数の変化、突然変異、単一ヌクレオチド多型(SN)、および患者由来転移組織からのDNAメチル化が分析された5。この積極的な形態のPCaのゲノムの理解が著しく進歩しているにもかかわらず、CRPC-腺癌からNEPCへの移行に関与する小さな非コードRNA(microRNA)を含むエピジェネティックな要因についてはほとんど知られていない。マイクロRNA(miRNA)は、コグネイトmRNA標的6の3'-非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用によって主に転写後の遺伝子発現を抑制することによって作用する22bp長い、二本鎖RNAである。いくつかの腫瘍および腫瘍抑制剤が同定され、疾患発症および転移を調節するその役割は、異なる癌6、7においてよく研究されている。これらの小さな非コーディングRNAは、多くの場合、疾患死亡率6、8、9を制御する上で非常に重要なターゲットとして機能します。最近の研究は、エキソソームのようなEVにおける輸送を介した癌転移におけるmiRNAのパラクリン効果を理解することに焦点を当てており、その血流中を流れ、腫瘍細胞がこれらの二次メッセンジャーをヌクレアーゼフリー環境10、11、12の転移位置に送ることを可能にする。EVは、宿主細胞12から形容作用を伝達するために腫瘍細胞からmiRNAを運ぶ。したがって、腫瘍細胞の二次メッセンジャーとしてのEVの同定は、疾患重症度の非侵襲的検出に有用である可能性がある。
miR-1246は、積極的なPCaからEVで高度にアップレギュレーションされ、疾患重症度13を示す。これらのEV関連miRNAは、疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能するだけでなく、腫瘍形成を駆動する上で機能的に重要な役割を果たす。したがって、非侵襲的バイオマーカーとその機能的意義をより良く同定できるように、PCaの耐性形態に関連するmiRNAレパートリーの意義を理解することが不可欠です。
次世代シーケンシングの出現は、突然変異、染色体転位、染色体上昇、メチル化などのゲノムの変化を含む腫瘍景観の詳細を研究するための最も包括的なプラットフォームを提供し、そのすべてが癌14、15、16の形態および性質に大きく寄与する。同様に、腫瘍細胞で起こり、疾患重症度17の重要なプレーヤーであることが多い膨大なエピゲノム変化を理解することも不可欠なツールです。NEPCの生成に関連するmiRNAレパートリーを理解することを目的として、FFPE転移CRPC組織およびそれに対応する血清由来EVに対して小さなRNAシーケンシングを行った。これら2つのサンプル源のいずれかに由来するRNAは、(1)収率が低く、(2)ホルマリン固定およびEV分離のためにしばしば起こる劣化による悪品質である。さらに、cDNAライブラリの生成は、シーケンス実行の重要ですが、面倒なステップです。したがって、これらのRNAを分離し、それらを使用して小さなRNAシーケンシング用のライブラリを生成する方法は、正確で信頼性の高いデータを生成するための最適化が必要です。
RT-PCR、マイクロアレイ、インシトゥハイブリダイゼーション(ISH)など、さまざまなサンプルでmiRNA発現をプロファイリングする方法がいくつかあります。FFPE組織由来RNAを用いてRT-PCRおよびISHによるmiRNA発現を評価するプロトコルが最近公開された18.最近の技術は、サンプルでmiRNA発現をプロファイリングするためのより包括的で包括的なプラットフォームを提供します。NanoString nCounterは、感度の高いmiRNA検出プラットフォーム19を提供していますが、検出は、多くの場合、アレイで利用可能なmiRNAの数(〜2,000)によって制限されます。このようなシナリオでは、次世代シーケンシングのようなより敏感で網羅的なプラットフォームは、異なるサンプル20におけるmiRNA同定および同時プロファイリングのはるかに広い深さを提供する。この方法は、PCa患者21、22、23からの尿または血漿中のmiRNAシグネチャを決定するために使用されている。現在の記事では、FFPE組織と血清由来EVRNAを使用して積極的なCRPCに関連するmiRNAプロファイルを研究するために、次世代シーケンシングプラットフォームを使用するプロトコルが提示されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

アンドロゲン剥奪によるアンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達のアブレーションは、最初に癌の退行をもたらす前立腺癌の治療の最初のラインの目標です。しかし、かなりの数の症例において、疾患は進行した去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)に進行し、治療の選択肢が限られており、しばしば攻撃的である。遠い転移は、主に攻撃的な疾患のこの段階で観察される。CRPCは、最初は生存を改善する第2世代のAR経路阻害剤によって治療され、その後、治療抵抗性の出現が続く。神経内分泌前立腺癌(NEPC)は、しばしば神経内分泌分化(NED)として知られているトランス分化プロセスを介して治療抵抗性の結果として発症する前立腺癌(PCa)の稀な変異体であり、PCa細胞は系統スイッチを受ける腺癌から、神経内分泌(NE)系統マーカーの発現の増加を示す。NEPCへの進行とトランス分化を促進するゲノム変化に加えて、エピジェネティックな要因と微小環境の手掛かりは、疾患の進行を促進する上で不可欠なプレーヤーと考えられています。この原稿は、高度なPCaに関連するエピジェネティックドライバ(すなわち、小さな非コーディングRNA)を識別するための詳細なプロトコルを提供します。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)転移組織および対応する血清由来細胞外小胞(EV)からの精製マイクロRNAを使用して、プロトコルはシーケンシングのための適切な品質管理を備えたライブラリを準備する方法を記述するこれらのサンプルソースからのマイクロRNA。FFPE と EV の両方から RNA を分離することは、ほとんどの RNA が劣化しているか、または量が制限されているため、多くの場合困難です。このプロトコルでは、RNA入力とcDNAライブラリを最適化して、シーケンス時に最も具体的な読み取りと高品質のデータを得るためのさまざまな方法について詳しく説明します。

ライブラリは、RNA分離後に調製し、品質チェックを行った。マイクロセク剖組織および血清由来のEVから単離されたRNAから調製した増幅cDNAライブラリーのゲル精製を図1および図2に示す。アダプター・リゲード miRNA の製品サイズは、サンプルごとに約 136−160 bp に対応しました。図1A-Bは、小さなRNAライブラリー?...

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Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

このプロトコルの使用によって研究者は、進行前立腺癌のための新しいエキソームまたは細胞外小胞ベースおよび組織ベースの微小細胞を同定することができる。F-F-B組織と細胞外小胞の両方からRNAを分離することは、そのほとんどが作成されているか、限られた量であるため、多くの場合、次世代シーケンシングのための最も特異的な自由で高品質なデータを生成するためにR-N-A入力およびC-D-N-Aライブラリを最適化するためのさまざまな方法について詳しく説明します。次世代シーケンシングは、この粒子が前立腺癌臨床サンプルで最適化された腫瘍進行の根底にある腫瘍の分子変化を理解するための最も包括的なプラットフォームを提供し、進行した積極的な前立腺癌の基礎生物学に関する新しい洞察を提供することができる。低入力材料からC-D-N-Aライブラリを最適化することは、正しい結果を得るために高品質のC-D-N-Aライブラリを生成することが非常に重要であるため、シーケンス実行を成功させるための重要なステップです。先に行われたように組織の微細解剖を行った後、血清由来E-Vの患者血清サンプルの解凍列を摂氏4度で分離する。解凍した血清サンプルの110マイクロリットルをチューブに移し、2000回Gで30分間回転します。その後のE-Vまたはエキソソーム分離のためにスーパーナデンを選び、デブレペレットを捨てます。スーパーナテントに血清エキソソーム分離試薬の30マイクロレターで。摂氏4度を30分間インキュベートします。10分間Gの1万倍のスピン。E-Vスーパーネートを慎重に選び、別の1.5ミリリットルチューブにペレットを邪魔することなく、将来の分析のためにマイナス80°Cを保存します。その後、ヌクレアーゼフリー水で調製した70マイクロリットルのP-B-SでE-Vペレットを再懸濁する。マイクロ解剖組織から総R-N-Aを分離した後、精製されたE-Vの市販キットを使用して、3つのプライムアダプターの1マイクロリットルで1マイクロリットルR-N-Aサンプル当たり5マイクログラムにライブラリ調製を行います。サーマルサイクラーを摂氏70度に予熱し、サンプルを2分間インキュベートします。すぐに氷の上にサンプルを移す。別のチューブでは、2マイクロリットルのライゲーションバッファー、RNase阻害剤の1マイクロリットル、T4 RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを混合し、欠失変異体を含む。バイパイの寝具を上下に混ぜます。その後、氷の上にR-N-A 3プライムアダプターでチューブにミックスの4マイクロリットルを追加します。サーマルサイクラーを摂氏28度に予熱します。そして、1時間インキュベートするためにサーマルサイクラーにチューブを置きます。その後、サンプルをサーマルサイクラーに入れたままチューブに1マイクロリットルのストップ液を加えます。摂氏28度でさらに15分間インキュベートします。その後、すぐにチューブを取り外し、氷の上に保ちます。別のチューブに5つの素数アダプターの1マイクロリットルを追加します。摂氏70度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。そして2分間インキュベートします。すぐにチューブを氷の上に置き、アダプターの再焼を防ぎます。Dネイチャー5素数アダプタのチューブに10ミリモールA-T-Pの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜ、ミックスにT4 R-N-Aリガーゼの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜます。この混合物の3マイクロリットルを、R-N-Aを結紮した3つの素数アダプタを含むチューブに移します。28°Cに予熱したサーマルサイクラーにチューブを置き、1時間インキュベートします。その後すぐに氷にチューブを転送し、サンプルでさらに進むか、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存します。R-T-P-C-Rを実行するには、各アダプタの6つのマイクロライガーをR-N-Aに結び付け、R-N-A R-Tプライマーのマイクロライガーを1個追加します。チューブを摂氏70度に予熱したサーマルサイクラーに移し、2分間インキュベートします。チューブを氷に移します。別のチューブには、2マイクロリットルの5X、ストランドバッファー、12.5ミリモラーDNTPの5マイクロリットル、100ミリモルDTTの1マイクロリットル、R-N-A阻害剤の1マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素を混合する。この混合物の5マイクロリットルをアダプターの連結RNAに加え、50°Cに予熱されたサーマルサイクラーに移して1時間インキュベートします。1時間後、アダプターは、すぐに氷に無料のDNAを結び付けた。別のチューブには、25マイクロリットルのPCRミックス、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー指数、および8.5マイクロリットルのRNAの遊離水を混合します。このミックスの37.5マイクロリットルを、CDNAを結び付けるアダプターの12.5マイクロリットルに加えます。チューブを摂氏98度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。サイクル番号を 15 に変更して、製造元のプロトコルで提案されているようにサーマルサイクラーをプログラムします。完了後、サンプルを摂氏4度に保ちます。今後の使用のためにマイナス80°Cで進むか、保存してください。結紮された無料DNAを精製するには、10マイクロリットルのDNAローディング色素を各無料のDNAサンプルに加えます。そして、後者の高解像度とカスタムRNAの10マイクロリットルに。6%TBEポリアクリルアミドゲルで互いに隣接する2つの別々のレーンで各サンプルの30マイクロリットルを実行します。カスタムRNA後者と高解像度後者では、2つの異なるサンプル間の中間空間。1X TBEバッファー内でゲルを145ボルトで約30~40分間実行します。ローディング色素の下の青い前面を追跡します。ゲルの底に近づくと電気泳動を停止します。ゲルを1つのX TBEバッファーに1ミリメートル当たり5マイクログラムの臭化エチジウムで移動します。トランスイルミネーションでゲルを視覚化し、145ベースペアと160ベースペアマーカーの間でゲルを正確にカットし、145ベースペアマーカーのわずかに上に切り取り、アダプタダイマーによる汚染を避けます。重要なステップは、アダプターダイマーが望ましいブランドに非常に失われるように正確にゲルを切断することによって行われる精製合体CDNAです。ゲル片を2ミリメートルの回収チューブに保管されたDNA破断チューブに移します。2分間Gの20,000倍でスピンします。そして、RNaseフリーの水の300マイクロリットルを追加し、室温で一晩ロッカー上で穏やかに回転させます。翌日にDNA沈殿を行うために、チューブの内容物を5ミクロンのフィルターチューブに移した。厳密に10秒間600回Gをスピンします。次に、3つの酢酸モルナトリウム、1Xペレット塗料、975マイクロリットルの100%エタノールのグリコーゲン30マイクロリットルを2マイクロリットル加え、DNAを溶出させます。摂氏4度で17,000倍のGで20分間スピンします。上清を捨て、75%エタノールを加え、ペレットを洗浄します。4°Cで17千倍Gで5分間回転した後、上清を捨て、熱ブロック上で37°Cでチューブをインキュベートし、エタノールを完全に蒸発させます。再び12マイクロリットルの10ミリモルトリシダークロリドをPH8.5で懸濁します。次に、精製された無料のDNAを10回希釈し、希釈したCDNAの1マイクロリットルを使用してバイオアナライザー上で実行することにより、ライブラリ品質チェックを実行します。無料のDNA製品サイズが、136と160塩基対の間のエレクトロフェログラム内の小さなRNAの範囲に対応していることを確認してください。各サンプルの総モルシティを計算します。PH8.5で塩酸トリ酸塩を使用して、各サンプルを2ナノモルに正規化します。200マイクロリットルの各ナノモルサンプルの等量を1つの200マイクロリットルPCRチューブに混合してライブラリを保持します。原稿に記載されている手順に従って変性および順序を変性する。本研究では、RNAの単離後にライブラリを作成し、品質チェックを行った。アダプターの連結されたマイクロRnaseの製品サイズは、各サンプルの約136〜160塩基対に対応した。強調表示されたセクションは、調製の小さなRNAライブラリーのために正確に切除されたゲルの範囲を示しています。この図は、精製された無料DNAライブラリー用のゲル電気泳動とエレクトロフェログラムを示しています。マイクロ解剖されたFFPE組織および血清由来EV.小さなRNAシーケンシングランからの代表的な指標は、予想されるクラスター密度、Qスコア、クラスター通過フィルタパーセンテージ、およびマイクロ解剖されたFFP組織および血清由来EVの推定収量および誤差率を示す。両方のサンプルのQスコアは、ベースコール精度の99.9パーセントを示す3つ以上の値を示した。そして、エラー率はすべて1を下回っていました。ライブラリの準備の各ステップは慎重に実行する必要があり、チューブは、各インキュベーション後すぐに氷に移す必要があります。プロトコルの重要なステップは、アダプターダイマーフリーで純粋なCDNAライブラリを持っていることを確認するためにゲルを正確に切断することです。CDNAライブラリを生成するには、高品質のシーケンス実行を最適化する必要があります。このプロトコルを理解することは、限られたソースサンプルからの他のシーケンシングライブラリの準備にこれらの微細な詳細を外挿する視聴者が血清および細胞外小胞を示唆するのに役立ちます。この技術は、転移性前立腺癌患者における腫瘍化アグレッシブおよび治療抵抗性に関連する新しいミクロナーゼを同定するのに役立った。これらの技術は、新規バイオマーカー発見に役立つ他の疾患タイプに外挿することができる。この技術は、ストリオン由来の血清や組織サンプルなどの生物学的材料を使用するので、適切な予防措置を講じる必要があります。さらに、臭化エチジウムは既知の発がん性物質であり、このプロトコルを使用して非常に慎重に取り扱う必要があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

アンチ PD L1 抗体は生検で非小細胞肺癌患者からの細胞のサンプル集中 22 3 を使用して

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

卵巣癌組織からのミトコンドリアの調製と定量プロテオミクス解析のためのコントロール卵巣組織

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

低腫瘍含量組織における腫瘍濃縮のための自動解剖プロトコル

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...