Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

이 작품은 미 육군 의학 연구 획득 활동 (USAMRAA)에 의해 지원된다 아이디어 개발 상을 통해 수상 번호. W81XWH-18-1-303 및 W81XWH-18-2-0013 및 추가 로 수상 번호. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, W81XWH-18-2-0018, 및 W81XWH-18-2-0019 전립선암 바이오리포시토리 네트워크(PCBN). 건강의 국가 학회에 있는 국립 암 학회에 의해 저자의 실험실에 자금 지원 (그랜트 번호 RO1CA177984) 또한 인정됩니다. Rajvir Dahiya는 재향 군인 업무부, BX004473의 수석 연구 경력 과학자이며 NIH-UO1CA199694 (RD)의 지원을 받습니다. 의견, 해석, 결론 및 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국방부 또는 미 육군의 승인을 받지는 않습니다. 샌프란시스코 VAMC의 핵심 시설 책임자인 주디 시게나가(Judy Shigenaga)가 NextSeq 500 시퀀서에 도움을 주신 것에 감사드립니다.

이 연구는 미국 공통 규칙의 윤리 적 지침에 따라 수행되었으며 인간 연구에 대한 기관위원회의 승인을 받았습니다.
1. 미세 해부
참고: 선암 기능(CRPC-Adeno) 또는 NE 분화(CRPC-NE)를 가진 FFPE 전이성 CRPC 조직은 전립선암 생체 분석 네트워크(PCBN)로부터 수득되었다. 유리 슬라이드에 10 미크론 PCa 섹션은 이전에 논의 된 바와 같이 수동 미세 해부를 ?...

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

이 문서에서는, 우리는 격리된 RNA의 수율 그리고 질을 증가시키기 위하여 최적화된 키트를 사용하여 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV에서 RNA를 격리하는 프로토콜을 기술합니다. 또한, 정제된 RNA는 작은 RNA 염기서열 분석용 cDNA 라이브러리를 생성하는데 사용되었다. 나열된 두 단계는실행(24)의최종 결과인 시퀀싱 판독의 품질 및 깊이를 결정하는 데 필수적이다. 따라서 이러한 중요한 ?...

전립선암은 AR 신호를 통해 작용하는 안드로겐에 의해 구동됩니다. 따라서, AR 통로를 표적으로 하는 것은 질병1에대한 주된 치료이다. 그러나, 저항은 표적으로 한 치료의 결과로 수시로 계속되고 질병은 향상된 전이성 CRPC2로점진합니다. CRPC는 엔잘루타미드와 아비라테론2,3을 포함하는 2세대 AR 요법에 의해 치료되며, 이는 초기에 생존을 향상시킨다. 그러나, NEPC와 같은 치명적인 이체는 수시로 증가한사망3로이끌어 내는 한정된 처리한 CRPC 케이스의 25-30%에서 나타납니다. NEPC는 NED로 알려진 가역적 분화 과정을 통해 발생하며, 여기서 PCa 세포는 선암으로부터 계보 전환을 거치고 AR의 대사감소 및 에놀라제 2(ENO2), 염색그라닌 A(CHGA) 및 시냅토피신(SYP)을 포함하는 NE 계보 마커의 발현 증가를 보여준다. 이러한 저항 변이체는 치료 적 개입의 결과로 발생 감안할 때, PCa의 형태를 치료하기 어려운이 치명적인 의 생성으로 이어지는 경로를 해독하는 것이 필수적이다.
NEPC의 유전체학은 최근 Beltran 등에서 수행한 철저한 연구에서 해독되었으며, 이에 의해 카피 수 변경, 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 및 환자 유래 전이성 조직으로부터의 DNA 메틸화를 분석하였다5. PCa의 이 공격적인 양식의 유전체학의 이해에 있는 중요한 전진에도 불구하고, NEPC에 CRPC 선암의 전환에 관여하는 작은 비코딩 RNA (microRNAs)를 포함하여 후성적인 요인에 관하여 거의 알려지지 않습니다. MicroRNAs(miRNAs)는 22 bp 길이, 이중 가닥 RNA로, 코그네이트 mRNA 표적의 3'-번역되지 않은 영역(UTRs)과의 서열 특이적 상호작용에 의해 유전자 발현 후 전사를 억제함으로써 주로 작용한다6. 몇몇 oncomirs 및 종양 억제제는 지금 확인되고, 질병 개시 및 전이 조절에 있는 그들의 역할은 다른암6,7에서잘 공부되었습니다. 이러한 작은 비코딩 RNA는 종종 질병 사망률6,8,9를조절하는 데 매우 중요한 표적으로 작용한다. 보다 최근의 연구는 엑소좀과 같은 엑소좀에서의 수송을 통해 암 전이에서 miRNAs의 파라크린 효과를 이해하는 데 초점을 맞추고 있으며, 이는 혈류에서 흐르고 종양 세포가 이러한 이차 메신저를 뉴클레아제 없는 환경에서 전이성 위치로 보낼 수 있도록하는 10,11,12. EV는 숙주세포(12)로부터형질전환 효과를 전달하기 위해 종양 세포로부터 miRNAs를 운반한다. 따라서 종양 세포의 이차 메신저로서 EV의 식별은 질병 중증도의 비침습적 검출에 유용할 수 있다.
miR-1246은 공격적인 PCa로부터 전기자동차에서 고도로 상승조절되며, 질병 중증도13을나타낸다. 이 EV 관련 miRNAs는 질병의 비침범성 biomarkers로 봉사할 뿐 아니라, 또한 종양 발생을 운전에 있는 기능적으로 중요한 역할을 합니다. 따라서, 비침습적 바이오마커의 더 나은 식별뿐만 아니라 그들의 기능적 중요성을 더 잘 식별할 수 있도록 PCa의 내성 형태와 연관되는 miRNA 레퍼토리의 중요성을 이해하는 것이 필수적이다.
차세대 염기서열 분석의 출현은 돌연변이, 염색체 재배치, 염색체 및 메틸화와 같은 게놈의 변경을 수반하는 종양 경관의 세부 사항을 연구하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공했으며, 이들 모두는 암의 형태와 특성에 크게 기여하고있다 14,15,16. 마찬가지로, 종양 세포에서 발생하는 광대한 후성 유전체 학적 변화를 이해하는 데 필수적인 도구이며 질병 중증도17에서종종 중요한 선수입니다. NEPC의 생성과 관련된 miRNA 레퍼토리를 이해하기 위한 목적으로, FFPE 전이성 CRPC 조직 및 이들의 상응하는 혈청 유래 EV에서 작은 RNA 염기서열 분석이 수행되었습니다. 이들 두 샘플 공급원 중 어느 하나에서 유래된 RNA는 (1) 수율이 낮고 (2) 포르말린 고정 및 EV 격리로 인해 종종 발생하는 열화로 인한 품질 불량이다. 또한 cDNA 라이브러리를 생성하는 것은 중요하지만 번거로운 순서 실행 단계입니다. 따라서 이러한 RNA를 격리하고 이를 사용하여 작은 RNA 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하는 방법은 정확하고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하기 위한 최적화가 필요합니다.
RT-PCR, 마이크로어레이 및 인-시트 혼성화(ISH)를 포함하여 상이한 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일화하는 몇 가지 방법이 있다. RT-PCR 및 ISH에 의한 miRNA 발현을 평가하기 위해 FFPE 조직 유래 RNA를 이용한 프로토콜은 최근18일발표되었다. 최신 기술은 샘플에서 miRNA 발현을 프로파일링하기 위한 보다 철저하고 포괄적인 플랫폼을 제공합니다. NanoString nCounter는 민감한 miRNA 검출플랫폼(19)을제공하지만, 검출은 종종 어레이에서 이용 가능한 miRNAs의 수에 의해 제한된다(~2,000). 이러한 시나리오에서, 차세대 시퀀싱과 같은 보다 민감하고 철저한 플랫폼은 상이한 샘플20에서훨씬 더 넓은 깊이의 miRNA 식별 및 동시 프로파일링을 제공한다. 상기 방법은 PCa환자21,22,23으로부터소변 또는 혈장에서 miRNA 서명을 결정하는 데 사용되어 왔다. 현재 기사에서, 프로토콜은 FFPE 조직 및 혈청 유래 EV RNA를 사용하여 공격적인 CRPC와 관련된 miRNA 프로파일을 연구하기 위해 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 제시된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

안 드로 겐 수용 체의 절제 (AR) 안 드로 겐 박탈에 의해 신호는 처음 암 회귀 결과 전립선 암에 대 한 치료의 첫 번째 라인의 목표. 그러나 상당수의 경우, 이 질병은 치료 옵션이 제한되어 있고 종종 공격적인 고급 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다. 먼 전이는 주로 공격적인 질병의이 단계에서 관찰됩니다. CRPC는 초기에 생존을 향상시키는 2세대 AR 통로 억제제에 의해 치료되고, 치료 저항성의 출현이 뒤따랐다. 신경 내분비 전립선암 (NEPC)은 종종 신경 내분비 분화 (NED)로 알려진 분화 과정을 통해 치료 저항의 결과로 발생하는 전립선 암 (PCa)의 드문 변이체이며, PCa 세포는 계보 스위치를 겪는다. 선암에서 신경 내분비 (NE) 계보 마커의 증가 된 발현을 보여줍니다. NEPC에 진행및 분화를 유도하는 게놈 변경 이외에, 후성 유전학 요인 및 미세 환경 단서는 질병 진행을 구동에 필수적인 선수로 간주됩니다. 이 원고는 고급 PCa와 연관된 후성 유전학 드라이버(즉, 작은 비코딩 RNA)를 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 전이성 조직과 그에 상응하는 혈청 유래 세포외 소포(EV)의 정제된 마이크로RNA를 사용하여 시퀀싱에 적합한 품질 관리를 통해 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 샘플 소스에서 microRNA. FFPE와 EV 모두에서 RNA를 분리하는 것은 종종 도전적이다 그것의 대부분은 저하 또는 수량에 제한되기 때문에. 이 프로토콜은 RNA 입력 및 cDNA 라이브러리를 최적화하여 시퀀싱 시 가장 구체적인 판독 및 고품질 데이터를 산출하는 다양한 방법에 대해 자세히 설명합니다.

라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사를 수행하였다. 미세 해부 조직 및 혈청 유래 EV로부터 분리된 RNA로부터 제조된 증폭된 cDNA 라이브러리에 대한 겔 정제는 도 1 및 도 2에나타내고 있다. 어댑터-결찰 miRNAs의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136-160 bp에 해당합니다. 도 1A-B는 작은 RNA 라이브러리 준비를 위해 ?...

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Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

치료 저항은 수시로 향상된 전립선암을 가진 환자에서 발전하고, 어떤 경우에는, 암은 신경 내분비 전립선암에게 불린 치명적인 특수형으로 점진합니다. 이 전이를 촉진하는 작은 비 코딩 RNA 매개 분자 변경을 평가하면 신경 내분비 전립선암의 발달로 이어지는 인과 메커니즘의 더 나은 질병 계층화 및 식별이 가능합니다.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

이 프로토콜의 사용으로 연구원은 고급 전립선 암을 위한 새로운 exome 또는 세포외 소포 기지를 둔 및 조직 기지를 둔 마이크로 세포를 확인할 수 있습니다. F-F-B 조직과 세포외 소포 모두에서 RNA를 분리하는 것은 대부분의 조직이 만들어지거나 제한된 수량이기 때문에 이 입자는 차세대 시퀀싱을 위한 가장 구체적인 자유롭고 고품질의 데이터를 유전자에 R-N-A 입력 및 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 다양한 방법에 대해 정교하게 설명할 것입니다. 차세대 시퀀싱은 종양 진행의 근간이 전립선암 임상 샘플에 최적화되어 종양 진행의 근간을 이해하는 가장 포괄적인 플랫폼을 제공하며, 첨단 공격적인 전립선암의 근본적인 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다.낮은 입력 재질에서 C-D-N-A 라이브러리를 최적화하는 것은 성공적인 시퀀싱 실행을 위한 중요한 단계이므로 정확한 결과를 얻기 위해 고품질 C-D-N-A 라이브러리를 생성하는 것이 매우 중요합니다. 이전에 수행 된 조직의 마이크로 해부를 수행 한 후 4 섭씨에서 환자 혈청 샘플의 E-V의 해동 행을 분리하는 진행. 해동세럼 샘플 110마이크로리터를 튜브로 옮기고 30분 동안 2천 회 G로 회전합니다.후속 E-V 또는 엑소솜 절연슈퍼 나덴을 선택하여 데브리 펠릿을 폐기한다. 30 마이크로레터에서 혈청 엑소솜 절연 시약에서 슈퍼 나텐트에. 30 분 동안 섭씨 4도를 인큐베이션합니다.10분 동안 1만 회 G에서 회전합니다. 별도의 1.5 밀리리터 튜브에 펠릿을 방해하지 않고 E-V 슈퍼 네이덴트를 신중하게 선출하고 향후 분석을 위해 영하 80도를 저장하십시오. 그런 다음 뉴클레아제 프리 워터에서 제조된 70마이크로 리터의 P-B-S에서 E-V 펠릿을 다시 중단한다.마이크로 해부 된 조직에서 총 R-N-A를 분리한 후, 상용 키트를 사용하여 정제 된 E-V는 3 개의 프라임 어댑터 의 한 마이크로 리터에서 마이크로 리터 R-N-A 샘플당 정규화된 40 나노그램의 5 마이크로 리터로 라이브러리 준비를 수행합니다. 열 순환기를 섭씨 70도로 예열하고 샘플을 2분간 배양합니다. 즉시 얼음에 샘플을 전송합니다.별도의 튜브에서 결찰 버퍼의 두 마이크로 리터, RNase 억제제 1 마이크로 리터 및 T4 RNA 리개세 2, 삭제 돌연변이의 1 마이크로 리터를 혼합합니다. 바이 파이 침구를 위아래로 섞는다. 그런 다음 얼음에 R-N-A 3 프라임 어댑터와 함께 튜브에 믹스의 4 마이크로 리터를 추가합니다.열 순환기를 섭씨 28도로 예열합니다. 그리고 튜브를 열 사이클러에 1 시간 동안 배양합니다. 그 후, 열 사이클러에 샘플을 유지하면서 튜브에 정지 용액 의 마이크로 리터 를 추가합니다.섭씨 28도에서 15분 간 배양하세요. 그런 다음 즉시 튜브를 제거하고 얼음을 유지합니다. 별도의 튜브에서 5개의 프라임 어댑터의 마이크로리터 1개를 추가합니다.섭씨 70도로 예열된 열 사이클러로 옮김합니다. 그리고 2 분 동안 배양. 즉시 어댑터의 재annealing을 방지하기 위해 얼음에 튜브를 배치합니다.D 특성 5 프라임 어댑터의 튜브에 10 밀리몰 A-T-P의 마이크로 리터 를 추가합니다. 바이 파이 페딩을 혼합하고 믹스에 T4 R-N-A 리갈아의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 안녕 파이 페딩을 섞는다.이 믹스의 3개의 마이크로리터를 3개의 프라임 어댑터 계각 R-N-A를 포함하는 튜브로 옮기. 예열된 열 사이클러에 튜브를 섭씨 28도로 예열하고 1시간 동안 배양합니다. 그 후 즉시 튜브를 얼음으로 옮기고 샘플을 더 진행하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장합니다.R-T-P-C-R을 수행하려면 각 어댑터 리게트 R-N-A의 6개의 마이크로 리거를 사용하고 R-N-A R-T 프라이머의 마이크로 리거 1개를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 옮기고 섭씨 70도로 옮기고 2분 동안 배양합니다. 튜브를 얼음으로 옮기습니다.별도의 튜브믹스5X, 가닥 버퍼, 5 마이크로 리터 12.5 밀리몰러 DNTP, 100 밀리몰러 DTT의 1 마이크로 리터, R-N-A의 억제제 1마이크로 리터, 그리고 역전사 1 마이크로 리터. 어댑터 리게팅 된 RNA에이 믹스의 5 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 배양하기 위해 섭씨 50도로 예열 된 열 사이클러로 전송합니다. 1시간 후 어댑터가 무료 DNA를 얼음으로 즉시 래그드했습니다.별도의 튜브에서 PCR 믹스 25 마이크로리터, RNA PCR 프라이머 2개, RNA PCR 프라이머 지수 2개, RNA 자유 수분 8.5마이크로리터를 혼합합니다. 어댑터 리게싱 CDNA의 12.5 마이크로리터에 이 믹스의 37.5 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 예열된 열 사이클러로 98°C로 옮기습니다.제조업체의 프로토콜에서 제안된 대로 열 순환기를 15로 수정한 사이클 번호를 프로그래밍합니다. 완료 후 샘플을 섭씨 4도로 유지하십시오. 진행 하거나 향후 사용을 위해 영하 80도에서 저장.ligated 무료 DNA를 정화하려면 각 무료 DNA 샘플에 DNA 로딩 염료 10 마이크로리터를 추가합니다. 및 고해상도 후자 및 사용자 정의 RNA 후자의 10 마이크로 리터에. 6% TBE 폴리아크릴아미드 젤에서 서로 인접한 두 개의 별도 차선에서 각 샘플의 30 마이크로리터를 실행합니다.사용자 지정 RNA 후자 및 고해상도 후자를 사용하면 두 개의 서로 다른 샘플 사이의 중간 공간이 있습니다. 젤을 145볼트에서 약 30~40분간 1X TBE 버퍼로 실행합니다. 로딩 염료의 아래 파란색 전면을 추적합니다.젤 바닥에 접근할 때 전기전도를 중지합니다. 밀리미터 에디듐 브로마이드당 5 마이크로그램으로 하나의 X TBE 버퍼로 젤을 전달합니다. 겔을 트랜실루미네이터로 시각화하고 145개의 베이스 쌍과 160개의 베이스 쌍 마커 사이를 정밀하게 겔을 잘라내고 145개의 베이스 쌍 마커 보다 약간 높은 어댑터 이질로 오염을 방지합니다.중요한 단계는 어댑터 디머가 원하는 브랜드에 매우 손실실행으로 정확하게 젤을 절단하여 수행되는 정제 계각 CDNA입니다. 젤 조각을 2밀리미터 수집 튜브에 보관된 DNA 브레이킹 튜브로 전달합니다. 2분 동안 20,000회 G로 회전합니다.그리고 300 마이크로 리터의 RNase 없는 물을 추가하고 실온에서 하룻밤 동안 로커에서 부드럽게 회전 할 수 있습니다. 다음 날에 DNA 강수량을 수행하기 위해 튜브의 내용을 5 미크론 필터 튜브로 전송한다. 엄격하게 10 초 동안 600 배 G를 회전합니다.그런 다음 3개의 어금음 나트륨 아세테이트의 글리코겐 30 마이크로리터의 2개의 마이크로리터, 1X 펠릿 페인트 및 100% 에탄올의 975마이크로리터를 경례된 DNA에 추가합니다. 섭씨 4도에서 17, 000배 G에서 20분간 회전합니다. 상체를 버리고 75 %의 에탄올을 추가하여 펠릿을 씻습니다.섭씨 4도에서 17,000회 G에서 5분간 회전한 후 상류제를 버리고 열 블록에서 37°C의 튜브를 배양하여 에탄올을 완전히 증발시다. 다시 펠릿을 12 마이크로리터의 10 밀리머 트리피더 염화물PH 8.5에서 중단합니다. 다음으로 정제되고 무료 DNA를 10회 희석하고 희석된 CDNA의 마이크로리터 1개를 사용하여 생체 분석기에서 실행하여 라이브러리 품질 검사를 수행합니다.무료 DNA 제품 크기가 136과 160 개의 염기 쌍 사이의 전기 페로그램의 작은 RNA 범위에 해당하는지 확인하십시오. 각 샘플에 대한 총 어금니를 계산합니다. 각 샘플을 PH 8.5에서 염산염삼액을 사용하여 2나노몰러로 정규화한다.단일 200 마이크로 리터 PCR 튜브에 각 두 나노 몰라 샘플의 동일한 볼륨을 혼합하여 라이브러리를 유지합니다. 원고에 설명된 대로 단계를 따르는 변성 및 시퀀스. 이 연구에서 라이브러리는 RNA 격리 후 제조되었고 품질 검사가 수행되었다.어댑터 리게트 마이크로 Rnase의 제품 크기는 각 샘플에 대해 약 136 에서 160 염기 쌍에 대응하였다. 강조 된 섹션은 정확하게 준비의 작은 RNA 라이브러리에 대한 절제 된 젤의 범위를 보여줍니다. 이 수치는 정제 된 무료 DNA 라이브러리용 젤 전기 전구 및 전기 페로그램을 보여줍니다.마이크로 해부 FFPE 조직 및 혈청 파생 EV의. 작은 RNA 시퀀싱 실행의 대표적인 메트릭은 예상 클러스터 밀도, Q 점수, 클러스터 통과 필터 백분율 및 마이크로 해부된 FFP 조직 및 혈청 파생 EV에 대한 예상 수율 및 오차 비율을 보여줍니다. 두 샘플의 Q 점수는 기본 호출 정확도의 99.9%를 나타내는 3개 이상의 값을 보여 주였습니다.그리고 오류 율은 모두 하나 이하였다. 도서관 준비의 각 단계는 신중하게 실행되어야하며 각 배양 후 튜브를 즉시 얼음으로 옮겨야합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 어댑터가 없고 순수한 CDNA 라이브러리를 보장하기 위해 젤을 정확하게 절단하는 것입니다.CDNA 라이브러리를 생성하려면 고품질 시퀀싱 실행에 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 이해하면 제한된 소스 샘플에서 다른 시퀀싱 라이브러리 준비에 이러한 미세 세부 정보를 추정하는 시청자가 혈청 및 세포 외 소포를 제안합니다. 이 기술은 전이성 전립선암 환자에서 종양 공격성 및 치료 저항과 연관되는 새로운 micronase를 확인하는 데 도움이되었습니다.이 기술은 새로운 biomarker 발견에 원조할 수 있는 그밖 질병 모형으로 추정할 수 있습니다. 이 기술은 striation 파생 혈청 및 조직 샘플과 같은 생물학적 물질을 사용하기 때문에 적절한 예방 조치를 취해야합니다. 또한, 에디듐 브로마이드는 알려진 발암물질이며 이 프로토콜을 사용하여 매우 신중하게 처리되어야 한다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

연구

암 연구학

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

22C 3를 사용 하 여 반대로 PD L1 항 체 생 검 및 비 작은 세포 폐 암 환자에서 세포학 샘플에 집중

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

포 르 말린 고정 암 조직 표본에 면역-종양학 연구를 위한 자동화 된 다중 면역 형광 패널

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

낮은 종양 함량 조직에서 종양 농축을 위한 자동화된 해부 프로토콜

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA 시퀀싱을 위한 3개의 차동 발현 분석 방법: 림마, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...