Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av US Army Medical Research Acquisition aktivitet (USAMRAA) gjennom Idea Development Award underAward no. W81XWH-18-1-303 og W81XWH-18-2-0013 og i tillegg av Award no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, og W81XWH-18-2-0019 prostata Cancer Biorepository nettverk (PCBN). Finansiering støtte til forfatterne ' lab ved National Cancer Institute ved National Institutes of Health (Grant Number RO1CA177984) er også anerkjent. Rajvir Dahiya er senior Research Career forsker ved Institutt for Veteraner saker, BX004473 og finansiert av NIH-UO1CA199694 (RD). Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er de av forfatteren og er ikke nødvendigvis godkjent av Department of Defense eller US Army. Vi er takknemlige for Judy Shigenaga, direktør for kjerne anlegget i San Francisco VAMC, for hennes hjelp med NextSeq 500 Sequencer.

Denne studien ble gjennomført i samsvar med de etiske retningslinjene for USAs felles regel og ble godkjent av den institusjonelle komiteen for Human Research.
1. Microdissection
Merk: FFPE metastatisk CRPC-vev med adenokarsinom funksjoner (CRPC-Adeno) eller NE-differensiering (CRPC-NE) ble innhentet fra prostatakreft Biorepository Network (PCBN). Ti-mikron PCa seksjoner på glass lysbilder ble utarbeidet for manuell microdissection som omtalt tidlig...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å isolere RNA fra FFPE-vev og serum-avledede EV ' er med kits som var optimalisert for å øke avkastningen og kvaliteten på isolerte RNAs. Videre ble renset RNAs brukt til å generere cDNA biblioteker for små RNA sekvensering. Begge de oppførte trinnene er avgjørende for å bestemme kvaliteten og dybden av sekvensering leser som er det endelige resultatet fra kjøre24. Derfor er optimalisering av disse viktige trinnene avgjørende for en velly...

Prostatakreft er drevet av androgener opptrer via AR signalering. Derfor er rettet mot AR veien den bærebjelke behandling for sykdommen1. Men motstanden ofte oppstår som et resultat av målrettede terapier og sykdommen utvikler seg til en avansert metastatisk CRPC2. CRPC behandles av andre generasjon av AR-terapi som inkluderer enzalutamidog abirateron,som forbedrer overlevelse i starten. Dødelige varianter som NEPC dukker imidlertid ofte opp i 25 − 30% av de behandlede CRPC-tilfellene som har begrensede behandlingsalternativer, noe som fører til økt dødelighet3. NEPC oppstår via en reversibel transdifferentiation prosess kjent som NED, hvor PCa celler gjennomgår en avstamning bytte fra adenocarcinomas og viser redusert uttrykk for AR og økt uttrykk for NE avstamning markører inkludert enolase 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA), og synaptophysin (SYP)4. Gitt at disse motstands variantene oppstår som følge av terapeutiske intervensjoner, er det viktig å dechiffrere trasé som fører til generering av denne dødelige, vanskelig å behandle form av PCa.
Genomics av NEPC ble nylig tydet i en omfattende studie gjort av Beltran et al. der kopi nummer endringer, mutasjoner, enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs) og DNA-metylering fra pasient-avledet metastatisk vev ble analysert5. Til tross for signifikant fremgang i forståelsen av Genomics av denne aggressive formen av PCa, er lite kjent om epigenetic faktorene, inkludert de små ikke-koding RNAs (microRNAs) som er involvert i overgangen av CRPC-adenokarsinom til NEPC. MicroRNAs (miRNAs) er 22 BP lang, dobbel-strandet RNAs som opptrer hovedsakelig ved å undertrykke genuttrykk post-transcriptionally av sekvens-spesifikk interaksjon med 3-uoversatt regioner (UTRs) av beslektet mRNA mål6. Flere oncomiRs og tumor Suppressors har nå blitt identifisert, og deres rolle i å regulere sykdom utbruddet og metastasering har vært godt studert i ulike kreft6,7. Disse små ikke-koding RNAs ofte tjene som svært viktige mål i å kontrollere sykdom dødelighet6,8,9. Nyere forskning har vært fokusert på å forstå paracrine virkningene av miRNAs i kreft metastasering via deres transport i EV ' r, slik som exosomes, som renner i blodet og tillater tumorceller å sende disse sekundære Messengers til metastatisk steder i et nuklease-fritt miljø10,11,12. EV ' r bærer miRNAs fra tumorceller å overføre transformere effekter fra verten cellene12. Identifisering av EV ' r som sekundær budbringere av tumorceller kan derfor være nyttig i ikke-invasiv påvisning av alvorlighetsgrad av sykdom.
MiR-1246 er svært upregulated i EV ' r fra aggressiv PCa, og det indikerer sykdoms alvorlighetsgrad13. Disse EV-tilknyttede miRNAs ikke bare som ikke-invasiv biomarkører av sykdommen, men også spille funksjonelt viktige roller i kjøring tumorigenesis. Dermed er det viktig å forstå betydningen av den miRNA repertoar som er forbundet med resistente former for PCa å tillate bedre identifisering av ikke-invasiv biomarkører så vel som deres funksjonelle betydning.
Det advent av neste generasjon sekvensering har tilbudt den mest omfattende plattformen for å studere detaljene i tumor landskap med endringer i Genova som mutasjoner, kromosom Relocations, chromothripsis, og metylering, som alle bidrar betydelig til form og natur kreft14,15,16. Likeledes er det også et viktig verktøy for å forstå de store epigenomic endringene som skjer i en tumor celle, og som ofte er viktige aktører i sykdom alvorlighetsgrad17. Med sikte på å forstå miRNA repertoar knyttet til generering av NEPC, ble små RNA sekvensering utført på FFPE metastatisk CRPC vev og deres tilsvarende serum-avledet EV. RNA avledet fra en av disse to sample kildene er (1) lav i yield og (2) av dårlig kvalitet på grunn av fornedrelse som ofte skjer på grunn av formalin fiksering og EV isolasjon. Videre genererer cDNA biblioteker er en kritisk, men tungvint, trinn i en sekvensering kjøre. Således, metoder for å isolere disse RNAs og bruke dem til å generere biblioteker for små RNA sekvensering krever optimalisering for å generere nøyaktige og pålitelige data.
Det finnes flere metoder for å profil miRNA uttrykk i forskjellige eksempler, inkludert RT-PCR, Microarrays, og in-situ hybridisering (ISH). En protokoll som bruker FFPE-avledet RNA for å evaluere miRNA-uttrykk av RT-PCR og ISH ble nylig utgitt18. Nyere teknologi tilbyr mer omfattende og omfattende plattformer for profilering av miRNA uttrykk i en prøve. NanoString nCounter tilbyder en følsom miRNA oppdagelsen plattform19, bortsett fra oppdagelsen er ofte begrenset av antallet av miRNAs det er anvendelig inne det oppstille (~ 2 000). I et slikt scenario, en mer følsom og uttømmende plattform som neste generasjons sekvensering tilbyr mye større dybde av miRNA identifisering og samtidig profilering i forskjellige prøver20. Metoden har blitt brukt til å bestemme miRNA underskrifter i urin eller plasma fra PCa pasienter21,22,23. I den gjeldende artikkelen, en protokoll er presentert for å bruke en neste generasjons sekvensering plattform for å studere miRNA profiler forbundet med aggressive CRPC bruker FFPE vev og serum-avledet EV RNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

Ablasjon av androgen reseptor (AR) signalering av androgen deprivasjon er målet for den første linjen i terapi for prostatakreft som i utgangspunktet resulterer i kreft regresjon. Men i et betydelig antall tilfeller, sykdommen utvikler seg til avansert, kastrering prostatakreft (CRPC), som har begrensede terapeutiske alternativer og er ofte aggressiv. Fjern metastasering er mest observert på dette stadiet av den aggressive sykdommen. CRPC er behandlet av en annen generasjon av AR veien hemmere som forbedrer overlevelse i utgangspunktet, etterfulgt av fremveksten av terapi motstand. Nevroendokrine prostatakreft (NEPC) er en sjelden variant av prostatakreft (PCa) som ofte utvikler seg som følge av behandlings motstanden via en transdifferentiation prosess kjent som Nevroendokrine differensiering (NED), hvor PCa-celler gjennomgår en slekts bryter fra adenocarcinomas og vise økt uttrykk for Nevroendokrine (NE) avstamning markører. I tillegg til de genomisk endringene som driver fremdriften og transdifferentiation til NEPC, er epigenetic faktorer og microenvironmental stikkord ansett som viktige aktører når det kommer til å kjøre sykdomsprogresjon. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å identifisere epigenetic drivere (dvs. små ikke-koding RNAs) som er knyttet til avansert PCa. Ved hjelp av renset microRNAs fra formalin-fast parafin-embedded (FFPE) metastatisk vev og tilsvarende serum-avledet ekstracellulære blemmer (EV), protokollen beskriver hvordan du klargjør biblioteker med riktig kvalitetskontroll for sekvensering microRNAs fra disse eksempel kildene. Å isolere RNA fra både FFPE og EV ' r er ofte utfordrende fordi det meste av det er enten degradert eller er begrenset i kvantitet. Denne protokollen vil utdype ulike metoder for å optimalisere RNA innganger og cDNA biblioteker for å gi mest spesifikke leser og høykvalitets data på sekvensering.

Biblioteket ble utarbeidet etter RNA-isolasjon, og en kvalitetskontroll ble utført. Gel rensing for forsterket cDNA biblioteket fremstilt fra RNA isolert fra microdissected vev og serum-avledet EV ' er vist i figur 1 og figur 2. Produkt størrelsen for adapter-ligaturer miRNAs tilsvarte om lag 136 − 160 BP for hver prøve. Figur 1A-B er merket for å vise rekkevidden av gelen som skal være nøyaktig excised for ...

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Terapi resistens utvikler ofte hos pasienter med avansert prostatakreft, og i noen tilfeller, utvikler kreft til en dødelig under type kalt Nevroendokrine prostata kreft. Vurdere de små ikke-koding RNA-mediert molekylære endringer som letter denne overgangen ville tillate bedre sykdom lagdeling og identifisering av årsakssammenheng mekanismer som fører til utvikling av Nevroendokrine prostatakreft.

Sekvensering liten non-Coding RNA fra formalin-fast vev og serum-avledet Exosomes fra kastrering-resistente prostata kreftpasienter

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Med bruk av denne protokollen forskere kan identifisere romanen eksome eller ekstracellulær vesikkel basert og vev basert mikrocellulær for avansert prostatakreft. Isolere RNA fra både F-F-B vev og ekstracellulære vesikler er ofte utfordrende som det meste av det er enten de opprettet eller er i begrenset mengde Denne partikkelen vil utdype ulike metoder for å optimalisere R-N-A innganger og C-D-N-A biblioteker til gen mest spesifikke gratis og høy kvalitet data for neste generasjon sekvensering. Neste generasjons sekvensering tilbyr den mest omfattende plattformen for å forstå molekylendring i svulst som ligger til grunn for tumorprogresjon denne partikkelen er optimalisert med prostatakreft klinisk prøve, og kan gi ny innsikt i den underliggende biologien til avansert aggressiv prostatakreft.Optimalisering av C-D-N-A-bibliotekene fra lav inndatamateriale er et avgjørende skritt for en vellykket sekvenseringskjøring, det er derfor svært viktig å generere C-D-N-A-biblioteker av høy kvalitet for å få nøyaktige resultater. Etter å ha utført mikro disseksjon av vev som tidligere gjort, fortsett å isolere serumavledet E-V's Thaw rader med pasientserumprøver ved fire grader celsius. Overfør 110 mikro liter tint serumprøve til et rør og spinn på to tusen ganger G i tretti minutter.Velg super naden for påfølgende E-V eller eksosom isolasjon og kast debree pellet. Ved 30 mikroletere av serum eksosom isolasjon reagens til super natent. En inkubere det fire grader celsius i tretti minutter.Spinn på ti tusen ganger G i ti minutter. Velg E-V super nadent nøye uten å forstyrre pellet i et eget 1,5 milliliter rør og lagre minus 80 grader Celsius for fremtidig analyse. Deretter re suspendere E-V pellet i 70 mikro liter P-B-S tilberedt i kjerner fritt vann.Etter å ha isolert totalt R-N-A fra mikrodenserte vev, og renset E-V ved hjelp av kommersielle sett utføre Library Preparation i fem mikro liter av en normalisert førti nanogram per mikro liter R-N-A prøve på en mikro liter tre prime adapter. Forvarm den termiske cycleren til 70 grader celsius og inkuber prøven i to minutter. Overfør prøvene umiddelbart på is.I et eget rør blande to mikro liter ligation buffer, en mikro liter RNase hemmer og en mikro liter T4 RNA ligase to, en sletting mutant. Bland bye pai sengetøy opp og ned. Tilsett deretter fire mikro liter av blandingen til røret med R-N-A 3 prime adapter på is.Forvarm den termiske cycler til 28 grader Celsius. Og plasser røret i den termiske cycleren for å inkubere i en time. Deretter legger du til en mikro liter stoppløsning i røret mens du holder prøven på den termiske cycleren.Inkuber ved 28 grader Celsius i ytterligere 15 minutter. Fjern deretter umiddelbart røret og hold på isen. I et separat rør legger du til en mikroliter med fem prime adapter.Overfør til en termisk cycler som er forvarmet til 70 grader Celsius. Og inkuber i to minutter. Plasser umiddelbart røret på isen for å hindre reannealing av adapterne.Tilsett en mikro liter ti millimol A-T-P til røret av D natured fem prime adapter. Bland bye pie pedding og legg til en mikro liter T4 R-N-A ligase til blandingen. Bland bye pai pedding.Overfør tre mikroliter av denne blandingen til røret som inneholder de tre hovedadapteren ligated R-N-A. Plasser røret på den termiske cycleren som har blitt forvarmet til 28 grader celsius og inkuber i en time. Deretter overfører du umiddelbart røret til is og enten fortsetter videre med prøvene eller lagrer på minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk.For å utføre R-T-P-C-R, bruk seks mikro ligers av hver adapter ligated R-N-A og legg til en mikro liger av R-N-A R-T primer til den. Overfør røret til den termiske cycler forvarmet til 70 grader Celsius og inkubere i to minutter. Overfør røret til is.I et eget rør blande to mikro liter 5X, strand buffer, 5 mikro liter av 12,5 milimoler DNTP,en mikro liter 100 milimolar DTT, en mikro liter R-N-A hemmer, og en mikro liter omvendt transkripsjon. Tilsett fem mikroliter av denne blandingen til adapteren ligated RNA og overføre den til den termiske cycler som har blitt forvarmet til 50 grader Celsius å inkubere i en time. Etter en time overføre adapteren ligated gratis DNA umiddelbart til is.I et separat rør blander du 25 mikroliter PCR-blanding, to mikroliter RNA PCR primer, to mikroliter RNA PCR primerindeks og 8,5 mikroliter av RNA's frie vann. Tilsett 37,5 mikroliter av denne blandingen til 12,5 mikroliter av adapteren ligated CDNA. Overfør røret til den termiske cycleren som er forvarmet til 98 grader celsius.Programmer den termiske cycler som foreslått i produsentens protokoll med syklusnummeret endret til 15. Etter ferdigstillelse, hold prøven på fire grader celsius. Fortsett eller oppbevar ved minus 80 grader celsius for fremtidig bruk.For å rense det ligatede gratis DNA, tilsett ti mikroliter av DNA-lastefargestoffet til hver gratis DNA-prøve. Og til ti mikroliter av høy oppløsning sistnevnte og tilpasset RNA sistnevnte. Kjør 30 mikroliter av hver prøve i to separate baner ved siden av hverandre i den seks prosent TBE Polyacrylamide gel.Med tilpasset RNA sistnevnte og høy oppløsning sistnevnte, mellomrommet mellom de to forskjellige prøvene. Kjør gelen i en X TBE-buffer på 145 volt i ca. 30 til 40 minutter. Hold oversikt over den nedre blå fronten av lastefargen.Stopp elektroforesen når den nærmer seg bunnen av gelen. Overfør gelen i en X TBE-buffer med 5 mikrogram per millimeter ethidiumbromid. Visualiser gelen i en transilluminator og kutt gelen nøyaktig mellom 145 baseparet og 160 basisparmarkører og litt over 145 baseparmarkøren for å unngå kontaminering med adapterdned.Et kritisk skritt er rensing ligated CDNA som gjøres ved å kutte gelen nøyaktig som adapter dimers kjøre svært taper til ønsket merke. Overfør gelbitene til DNA-bryterør som holdes i to millimeter samlerør. Spinn på 20 tusen ganger G i to minutter.Og tilsett tre hundre mikro liter RNase-fritt vann og la det rotere forsiktig på en rocker over natten ved romtemperatur. For å utføre DNA-nedbøren neste dag, overfør innholdet i røret til 5 mikron filterrør. Spinn 600 ganger G i strengt ti sekunder.Tilsett deretter to mikroliter glykogen tretti mikroliter av tre molarnatriumacetat, 1X pelletmaling og 975 mikroliter på 100 prosent etanol til eluted DNA. Spinn ved 17 000 ganger G ved 4 grader Celsius i 20 minutter. Kast det overnaturlige og tilsett 75 prosent etanol for å vaske pelleten.Etter å ha snurret på 17 tusen ganger G ved fire grader celsius i fem minutter, kast supernatanten og inkuber rørene ved 37 grader celsius på en termisk blokk som helt fordamper etanolen helt. Re suspendere pellet med 12 mikroliter på 10 millimolar tricider klorid ved PH 8.5. Utfør deretter en kvalitetssjekk for biblioteket ved å fortynne det rensede og kostnadsfrie DNA-et ti ganger og bruke en mikroliter av den fortynnede CDNA til å kjøre på en bioanalyzer.Kontroller at den kostnadsfrie DNA-produktstørrelsen tilsvarer området til den lille RNA i elektrofærtrammet mellom 136 og 160 basispar. Beregn den totale molariteten for hver prøve. Normaliser hver prøve til 2 nanomlar ved hjelp av trishydroklorid ved PH 8.5.Hold bibliotekene ved å blande like volumer av hver to nanomolar prøve i en enkelt to hundre mikroliter PCR tube. Denature og sekvens følger trinnene som beskrevet i manuskriptet. I denne studien ble biblioteket utarbeidet etter RNA-isolasjon og en kvalitetskontroll ble utført.Produktstørrelsen for adapter ligated micro Rnase tilsvarte ca 136 til 160 basispar for hver prøve. De uthevede delene viser utvalget av gelen som nettopp ble skåret ut for et lite RNA-bibliotek for forberedelse. Denne figuren viser gelelektroforese og elektroferogrammer for det rensede gratis DNA-biblioteket.Mikro dissekert FFPE vev og serum avledet EV's. De representative beregningene fra en liten RNA-sekvenseringskjøring viser forventet klyngetetthet, Q-poengsum, klynge som passerer filterprosent, og estimerte kapasitets- og feilfrekvenser for mikrodissert FFP-vev og serumavledede EV-er. Q-poengsummen i begge prøvene viste en verdi over tre som indikerer 99,9 prosent av nøyaktigheten av basisanropet.Og feilfrekvensene var alle under en. Hvert trinn i bibliotekpreparatet skal utføres nøye og rørene skal umiddelbart overføres til is etter hver inkubasjon. Et kritisk skritt i protokollen er å kutte gelen nøyaktig for å sikre at du har et adapterdyrfritt og rent CDNA-bibliotek.Generering av CDNA-bibliotek krever optimalisering for sekvensering av høy kvalitet. Å forstå denne protokollen vil hjelpe seerne med å ekstrapolere disse minuttdetaljene til andre sekvenseringsbibliotekforberedelse fra begrensede kildeprøver foreslår serum og ekstracellulære vesikler. Denne teknikken har hjulpet oss med å identifisere nye mikronase som er forbundet tumorat aggressivitet og terapiresistens hos metastatiske prostatakreftpasienter.Disse teknikkene kan ekstrapoleres til andre sykdomstyper som kan hjelpe til med Ny biomarkøroppdagelse. Siden denne teknikken bruker biologiske materialer som striasjon avledet serum- og vevsprøver, bør man ta nødvendige forholdsregler. Videre er ethidiumbromid et kjent kreftfremkallende og bør håndteres svært nøye ved hjelp av denne protokollen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En Bioluminescent og fluorescerende Orthotopic Syngeneic murint modell av Androgen-avhengige og kastrering-resistente prostatakreft

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Med 22C 3 Anti-PD-L1 antistoff konsentrere seg om biopsi og cytologi eksempler fra ikke-småcellet lungekreft pasienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Automatisert Multiplex Immunofluorescence Panel Immuno-onkologi studier på Formalin-fast Carcinoma vevsprøver

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Fange små molekyl kommunikasjon mellom vev og celler ved hjelp av Imaging massespektrometri

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablering og analyse av tredimensjonale (3D) organoider avledet fra pasient prostatakreft benmetastase prøver og deres Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatisert disseksjonsprotokoll for tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre differensialuttrykksanalysemetoder for RNA-sekvensering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...