Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por la Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos (USAMRAA) a través del Premio de Desarrollo de Ideas bajo el Premio No. W81XWH-18-1-303 y W81XWH-18-2-0013 y adicionalmente por Premio no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 y W81XWH-18-2-0019 Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). También se reconoce el apoyo a los autores del laboratorio de autores por parte del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (Número de Subvención RO1CA177984). Rajvir Dahiya es Científico Senior de Investigación en el Departamento de Asuntos de Veteranos, BX004473 y financiado por NIH-UO1CA199694 (RD). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa o el Ejército de los Estados Unidos. Estamos agradecidos a Judy Shigenaga, directora de instalaciones básicas de San Francisco VAMC, por su ayuda con el secuenciador NextSeq 500.

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Regla Común de los Estados Unidos y fue aprobado por el Comité Institucional de Investigación Humana.
1. Microdisección
NOTA: Los tejidos CRPC metastásicos FFPE con características de adenocarcinoma (CRPC-Adeno) o diferenciación NE (CRPC-NE) se obtuvieron de la Red de Birepositorios de Cáncer de Próstata (PCBN). Se prepararon secciones de PCa de diez micras en portaobj...

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	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

En este artículo, describimos un protocolo para aislar el ARN de los tejidos FFPE y los vehículos eléctricos derivados del suero utilizando kits optimizados para aumentar el rendimiento y la calidad de los ARN aislados. Además, los ARN purificados se utilizaron para generar bibliotecas de ADNc para la secuenciación de ARN pequeño. Ambos pasos enumerados son esenciales para determinar la calidad y profundidad de las lecturas de secuenciación que son el resultado final de la ejecución24. Por...

El cáncer de próstata es impulsado por andrógenos que actúan a través de la señalización AR. Por lo tanto, apuntar a la vía de AR es el tratamiento principal para la enfermedad1. Sin embargo, la resistencia a menudo se produce como resultado de terapias dirigidas y la enfermedad progresa a un CRPC2metastásico avanzado. CRPC es tratado por la segunda generación de arretroterapia que incluye enzalutamida y abiraterona2,3 que mejora la supervivencia inicialmente. Sin embargo, las variantes letales como la NEPC a menudo emergen en el 25-30% de los casos de CRPC tratados que tienen opciones de tratamiento limitadas, lo que conduce a un aumento de la mortalidad3. EL NEPC surge a través de un proceso de transdiferenciación reversible conocido como NED, en el que las células DeC se someten a un cambio de linaje de adenocarcinomas y muestran una disminución de la expresión de AR y una mayor expresión de marcadores de linaje NE incluyendo enolase 2 (ENO2), cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP)4. Dado que estas variantes de resistencia surgen como resultado de intervenciones terapéuticas, es esencial descifrar vías que conducen a la generación de esta forma mortal, difícil de tratar de PCa.
La genómica de NEPC fue descifrada recientemente en un exhaustivo estudio realizado por Beltrán y otros en el que se analizaron alteraciones del número de copias, mutaciones, polimorfismos de nucleótido único (SNP) y metilación del ADN de tejidos metastásicos derivados del paciente5. A pesar de los avances significativos en la comprensión de la genómica de esta forma agresiva de PCa, poco se sabe sobre los factores epigenéticos, incluyendo los pequeños ARN no codificantes (microARN) que están involucrados en la transición del CRPC-adenocarcinoma a NEPC. Los MicroRNAs (miRNAs) son ARN de 22 bp de largo y doble cadena que actúan principalmente suprimiendo la expresión génica post-transcripción mediante interacciones específicas de secuencia con las 3 regiones no traducidas (UTR) de las metas de ARNm cognado6. Ahora se han identificado varios oncomiRs y supresores de tumores, y su papel en la regulación de la aparición de la enfermedad y la metástasis ha sido bien estudiado en diferentes cánceres6,7. Estos pequeños ARN no codificantes a menudo sirven como objetivos muy importantes en el control de la mortalidad por enfermedad6,8,9. Investigaciones más recientes se han centrado en la comprensión de los efectos paracrinos de los miRNAs en la metástasis oncológica a través de su transporte en vehículos eléctricos, como los exosomas, que fluyen en el torrente sanguíneo y permiten que las células tumorales envíen a estos mensajeros secundarios a lugares metastásicos en un ambiente libre de nucleasas10,11,12. Los vehículos eléctricos transportan miRNAs de las células tumorales para transferir los efectos transformadores de las células huésped12. Por lo tanto, la identificación de los vehículos eléctricos como mensajeros secundarios de las células tumorales puede ser útil en la detección no invasiva de la gravedad de la enfermedad.
El miR-1246 está altamente regulado en vehículos eléctricos de PCa agresivo, e indica la gravedad de la enfermedad13. Estos miRNAs asociados a EV no sólo sirven como biomarcadores no invasivos de la enfermedad, sino que también desempeñan funciones funcionalmente importantes en la conducción de la tumorigenesis. Por lo tanto, es esencial entender la importancia del repertorio miRNA que se asocia con formas resistentes de PCa para permitir una mejor identificación de los biomarcadores no invasivos, así como su significado funcional.
El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha ofrecido la plataforma más completa para estudiar los detalles del paisaje tumoral que implican alteraciones en el genoma como mutaciones, reubicaciones cromosómicas, cromoripsis y metilación, todas las cuales contribuyen significativamente a la forma y naturaleza del cáncer14,15,16. Del mismo modo, también es una herramienta esencial para entender los vastos cambios epigenómicos que se producen en una célula tumoral y que a menudo son actores importantes en la gravedad de la enfermedad17. Con el objetivo de entender el repertorio de miRNA asociado con la generación de NEPC, se realizó la secuenciación de ARN pequeño en los tejidos CRPC metastásicos FFPE y sus correspondientes vehículos eléctricos derivados del suero. El ARN derivado de cualquiera de estas dos fuentes de muestra es (1) bajo en rendimiento y (2) de mala calidad debido a la degradación que a menudo ocurre debido a la fijación de formalina y aislamiento EV. Además, la generación de bibliotecas de ADNc es un paso crítico, pero engorroso, de una ejecución de secuenciación. Por lo tanto, los métodos para aislar estos ARN y usarlos para generar bibliotecas para la secuenciación de ARN pequeño requieren optimización para generar datos precisos y confiables.
Existen varios métodos para perfilar la expresión de miRNA en diferentes muestras, incluyendo RT-PCR, microarrays e hibridación in situ (ISH). Recientemente se publicó un protocolo que utiliza ARN derivado del tejido FFPE para evaluar la expresión de miRNA por RT-PCR e ISH18. Las tecnologías más recientes ofrecen plataformas más exhaustivas y completas para la generación de perfiles de expresión de miRNA en una muestra. NanoString nCounter ofrece una plataforma de detección de miRNA sensible19, pero la detección a menudo está limitada por el número de miRNAs que están disponibles en la matriz (2.000 euros). En tal escenario, una plataforma más sensible y exhaustiva como la secuenciación de próxima generación ofrece una profundidad mucho más amplia de identificación de miRNA y perfilado simultáneo en diferentes muestras20. El método se ha utilizado para determinar las firmas de miRNA en orina o plasma de los pacientes con PCa21,22,23. En el artículo actual, se presenta un protocolo para utilizar una plataforma de secuenciación de próxima generación para estudiar perfiles de miRNA asociados con CRPC agresivo utilizando tejidos FFPE y ARN EV derivados del suero.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

La ablación del receptor de andrógenos (AR) señalización por privación de andrógenos es el objetivo de la primera línea de terapia para el cáncer de próstata que inicialmente resulta en la regresión del cáncer. Sin embargo, en un número significativo de casos, la enfermedad progresa a cáncer de próstata avanzado y resistente a la castración (CRPC), que tiene opciones terapéuticas limitadas y a menudo es agresivo. La metástasis distante se observa principalmente en esta etapa de la enfermedad agresiva. La CRPC es tratada por una segunda generación de inhibidores de la vía AR que mejoran la supervivencia inicialmente, seguido de la aparición de resistencia terapéutica. El cáncer de próstata neuroendocrino (NEPC) es una rara variante del cáncer de próstata (PCa) que a menudo se desarrolla como resultado de la resistencia terapéutica a través de un proceso de transdiferenciación conocido como diferenciación neuroendocrino (NED), en el que las células PCa se someten a un interruptor de linaje adenocarcinomas y muestran una mayor expresión de marcadores de linaje neuroendocrino (NE). Además de las alteraciones genómicas que impulsan la progresión y transdiferenciación a la NEPC, los factores epigenéticos y las señales microambientales se consideran actores esenciales para impulsar la progresión de la enfermedad. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para identificar los controladores epigenéticos (es decir, pequeños ARN no codificantes) que están asociados con PCa avanzado. Utilizando microRNAs purificados a partir de tejidos metastásicos incorporados en parafina fijada de formalina (FFPE) y las correspondientes vesículas extracelulares derivadas del suero (EV), el protocolo describe cómo preparar bibliotecas con el control de calidad adecuado para la secuenciación microRNAs de estas fuentes de muestra. Aislar el ARN de FFPE y EVs es a menudo difícil porque la mayor parte de él está degradado o es limitado en cantidad. Este protocolo elaborará diferentes métodos para optimizar las entradas de ARN y las bibliotecas de ADNr para producir la mayoría de las lecturas específicas y los datos de alta calidad tras la secuenciación.

La biblioteca se preparó después del aislamiento del ARN y se realizó un control de calidad. La purificación de gel para la biblioteca de ADNamplificado preparada a partir de ARN aislado de tejidos microdiseccionados y vehículos eléctricos derivados del suero se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. El tamaño del producto para los miRNAs ligados por adaptadores correspondió a aproximadamente 136 a 160 bp para cada muestra. La Figura ...

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Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Con el uso de este protocolo los investigadores pueden identificar nuevos exomas o vesículas extracelulares y microcelulares basados en tejidos para el cáncer de próstata avanzado. Aislar el ARN de ambos tejidos F-F-B y vesículas extracelulares a menudo es difícil ya que la mayor parte de él es des creado o está en cantidad limitada Esta partícula profundizará en diferentes métodos para optimizar los insumos R-N-A y las bibliotecas C-D-N-A a los datos más específicos libres y de alta calidad para la secuenciación de próxima generación. La secuenciación de próxima generación ofrece la plataforma más completa para comprender la alteración de la molécula en el tumor que subyacen a la progresión tumoral esta partícula está optimizada con la muestra clínica de cáncer de próstata, y puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología subyacente del cáncer de próstata agresivo avanzado.La optimización de las bibliotecas C-D-N-A a partir de material de entrada baja es un paso crucial para una ejecución de secuenciación exitosa, por lo tanto, es muy importante generar bibliotecas C-D-N-A de alta calidad para obtener resultados precisos. Después de realizar la micro disección de los tejidos como se había hecho anteriormente, proceda a aislar las filas de descongelación derivadas de E-V de muestras de suero de pacientes a cuatro grados centígrados. Transfiera 110 micro litros de muestra de suero descongelada a un tubo y gire a dos mil veces G durante treinta minutos.Elija el súper naden para el posterior aislamiento E-V o exosoma y deseche el pellet de desbree. A 30 microleters de reactivo de aislamiento exosoma sérico al súper natent. Una incubación de cuatro grados centígrados durante treinta minutos.Gira a diez mil veces G durante diez minutos. Elija el súper nadent E-V cuidadosamente sin alterar el pellet en un tubo separado de 1,5 mililitros y almacene menos 80 grados Celsius para su análisis futuro. A continuación, vuelva a suspender el pellet E-V en 70 micro litros de P-B-S preparados en agua libre de nucleasas.Después de aislar el R-N-A total de los tejidos micro diseccionados, y los E-V purificados utilizando kits comerciales, realicen la preparación de la biblioteca en cinco micro litros de un nanogrando normalizado por micro litro de muestra R-N-A a un micro litro de tres adaptadores primos. Precaliente el ciclor térmico a 70 grados centígrados e incuba la muestra durante dos minutos. Transfiera inmediatamente las muestras sobre hielo.En un tubo separado mezclar dos micro litros de tampón de ligadura, un micro litro de inhibidor de la RNase y un micro litro de T4 ARN ligasa dos, un mutante de eliminación. Mezcle la ropa de cama de pastel de bye arriba y abajo. A continuación, agregue cuatro micro litros de la mezcla al tubo con el adaptador R-N-A 3 en hielo.Precalentar el ciclor térmico a 28 grados Celsius. Y coloque el tubo en el ciclor térmico para incubar durante una hora. Después de eso, agregue un micro litro de solución de parada en el tubo mientras mantiene la muestra en el ciclo térmico.Incubar a 28 grados centígrados durante otros 15 minutos. A continuación, retire inmediatamente el tubo y manténgalo en hielo. En un tubo separado añadir un microlitro de cinco adaptadores primos.Transfiera a un ciclor térmico que se ha precalentado a 70 grados centígrados. Y incubar durante dos minutos. Coloque inmediatamente el tubo sobre hielo para evitar la reannealing de los adaptadores.Agregue un micro litro de diez mililitros A-T-P al tubo de D natured cinco prime adapter. Mezclar adiós pastel y añadir un micro litro de T4 R-N-A ligase a la mezcla. Mezclar adiós pastel de orina.Transfiera tres microlitros de esta mezcla al tubo que contiene los tres adaptadores principales ligados R-N-A. Coloque el tubo en el ciclor térmico que se ha precalentado a 28 grados centígrados e incubar durante una hora. Después de eso, transfiera inmediatamente el tubo al hielo y proceda más con las muestras o guárdelo a menos 80 grados Celsius para su uso futuro.Para realizar R-T-P-C-R, utilice seis micro ligers de cada adaptador ligado R-N-A y agregue un micro liger de imprimación R-N-A R-T. Transfiera el tubo al ciclista térmico precalentado a 70 grados Centígrados e incubar durante dos minutos. Transfiera el tubo al hielo.En un tubo separado mezclar dos micro litros de 5X, tampón de hebra, 5 micro litros de 12,5 milimoler DNTP, un micro litro de TDT milimolar, un micro litro de inhibidor de R-N-A y un micro litro de transcriptasa inversa. Agregue cinco microlitros de esta mezcla al ARN ligado adaptador y transfiérelo al ciclor térmico que se ha precalentado a 50 grados Celsius para incubar durante una hora. Después de una hora, transfiera el adaptador ligando el ADN de cortesía inmediatamente al hielo.En un tubo separado, mezcle 25 microlitros de mezcla pcR, dos micro litros de imprimación RNA PCR, dos micro litros de índice de imprimación de ARN PCR y 8,5 microlitros de agua libre de ARN. Agregue 37,5 microlitros de esta mezcla a 12,5 microlitros del adaptador ligado CDNA. Transfiera el tubo al ciclor térmico que se ha precalentado a 98 grados centígrados.Programe el ciclor térmico como se sugiere en el protocolo del fabricante con el número de ciclo modificado a 15. Después de la finalización, mantenga la muestra en cuatro grados centígrados. Proceda o almacene a menos 80 grados centígrados para su uso futuro.Para purificar el ADN complementario ligado, agregue diez microlitros del tinte de carga de ADN a cada muestra de ADN de cortesía. Y a diez microlitros de la alta resolución de este último y ARN personalizado último. Ejecute 30 microlitros de cada muestra en dos carriles separados adyacentes entre sí en el gel de poliacrilamida de seis por ciento TBE.Con ARN personalizado último y alta resolución, el espacio intermedio entre las dos muestras diferentes. Ejecute el gel en un tampón X TBE a 145 voltios durante aproximadamente 30 a 40 minutos. Lleve un registro de la parte inferior azul delantera del tinte de carga.Detener la electroforesis cuando se acerca a la parte inferior del gel. Transfiera el gel en un tampón X TBE con 5 microgramos por milímetro de bromuro de etidio. Visualice el gel en un transiluminador y corte el gel con precisión entre el par base 145 y 160 marcadores de par base y ligeramente por encima del marcador de par base 145 para evitar la contaminación con dimer adaptador.Un paso crítico es la purificación ligada CDNA que se realiza cortando el gel con precisión a medida que los dimers del adaptador funcionan muy perder a la marca deseada. Transfiera las piezas de gel a tubos de rotura de ADN guardados en tubos de recolección de dos milímetros. Gira a 20 mil veces G durante dos minutos.Y añadir trescientos micro litros de agua libre de RNase y dejar que gire suavemente sobre un balancín durante la noche a temperatura ambiente. Para realizar la precipitación de ADN al día siguiente transfiera el contenido del tubo a tubos de filtro de 5 micras. Gira 600 veces G durante estrictamente diez segundos.A continuación, agregue dos microlitros de glucógeno treinta microlitros de tres molares de acetato de sodio, 1X de pintura de pellets y 975 microlitros de etanol 100 por ciento al ADN eluido. Gira a 17.000 veces G a 4 grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 75 por ciento de etanol para lavar el pellet.Después de girar a 17 mil veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos desecar el sobrenadante e incubar los tubos a 37 grados centígrados en un bloque térmico evaporar completamente el etanol. Re suspenda el pellet con 12 microlitros de cloruro de tricider milimétrico a PH 8.5. A continuación, realice una comprobación de calidad de la biblioteca diluyendo el ADN purificado y complementario diez veces y utilizando un microlitro del CDNA diluido para funcionar con un bioanalizador.Asegúrese de que el tamaño del producto de ADN complementario corresponde al rango del ARN pequeño en el electroferograma entre 136 y 160 pares base. Calcule la molaridad total para cada muestra. Normalizar cada muestra a 2 nanomolares utilizando el clorhidrato de tris a PH 8.5.Sostenga las bibliotecas mezclando volúmenes iguales de cada dos muestras nanomolares en un solo tubo PCR de doscientos microlitros. Denatura y secuencia siguiendo los pasos descritos en el manuscrito. En este estudio se preparó la biblioteca después del aislamiento del ARN y se realizó un control de calidad.El tamaño del producto para micro Rnase ligado al adaptador correspondía a aproximadamente 136 a 160 pares base para cada muestra. Las secciones resaltadas muestran la gama del gel que se excedió con precisión para la pequeña biblioteca de ARN de preparación. Esta figura muestra la electroforesis de gel y electroferogramas para la biblioteca de ADN de cortesía purificada.Tejido FFPE micro diseccionado y EV derivados del suero. Las métricas representativas de una pequeña ejecución de secuenciación de ARN demuestran la densidad esperada del clúster, la puntuación Q, el porcentaje de filtro de paso de clúster y las tasas estimadas de rendimiento y error para el tejido FFP microsesinscriptado y los EV derivados del suero. La puntuación Q en ambas muestra un valor por encima de tres que indica el 99,9 por ciento de la precisión de la llamada base.Y las tasas de error estaban todas por debajo de una. Cada paso en la preparación de la biblioteca debe ser cuidadosamente ejecutado y los tubos deben ser transferidos inmediatamente al hielo después de cada incubación. Un paso crítico en el protocolo es cortar el gel con precisión para asegurarse de que tiene un adaptador dimer libre y biblioteca CDNA puro.La generación de la biblioteca CDNA requiere optimización para una ejecución de secuenciación de alta calidad. Comprender este protocolo ayudará a los espectadores a extrapolar estos detalles minúsculos a otra prepration de la biblioteca de secuenciación de muestras de fuentes limitadas que sugieren vesículas séricas y extracelulares. Esta técnica nos ha ayudado a identificar nuevas micronasas que están asociadas a la agresividad tumoral y la resistencia a la terapia en pacientes con cáncer de próstata metastásico.Estas técnicas pueden extrapolarse a otros tipos de enfermedades que pueden ayudar en el descubrimiento de biomarcadores Novel. Como esta técnica utiliza materiales biológicos como muestras de suero y tejido derivados de la estrías, se deben tomar las precauciones adecuadas. Además, el bromuro de etidio es un carcinógeno conocido y debe manejarse con mucho cuidado mediante el uso de este protocolo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Con 22 3 anticuerpos Anti-PD-L1 concentrarse en biopsia y muestras citológicas de pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterización semiautomática PD-L1 y enumeración de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer de pulmón celular no pequeño por inmunofluorescencia

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

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Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tres métodos de análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...