Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Detta arbete stöds av den amerikanska armén medicinsk forskning förvärvsverksamhet (USAMRAA) genom idéutveckling Award underAward No. W81XWH-18-1-303 och W81XWH-18-2-0013 och dessutom genom tilldelning nr. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018, och W81XWH-18-2-0019 prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Finansieringsstöd till författar labbet av National Cancer Institute vid National Institutes of Health (bidrags nummer RO1CA177984) erkänns också. Rajvir Dahiya är en senior forskarkarriär forskare vid Institutionen för Veterans Affairs, BX004473 och finansieras av NIH-UO1CA199694 (RD). Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är de av författaren och är inte nödvändigtvis godkändes av Department of Defense eller US Army. Vi är tacksamma till Judy Shigenaga, chef för Core facility på San Francisco VAMC, för hennes hjälp med NextSeq 500 Sequencer.

Denna studie genomfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna i USA common Rule och godkändes av den institutionella kommittén för mänsklig forskning.
1. microdissection
Anmärkning: FFPE metastaserad CRPC vävnader med adenocarcinom funktioner (CRPC-Adeno) eller NE differentiering (CRPC-NE) erhölls från prostata cancer Biorepository nätverk (PCBN). Tio-micron PCa sektioner på glas diabilder var förberedda för manuell microdissection som d...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att isolera RNA från FFPE-vävnader och serumbaserade EVs med hjälp av satser som optimerats för att öka avkastningen och kvaliteten på isolerade RNAs. Vidare användes de renade RNAs-biblioteken för att generera cDNA-bibliotek för små RNA-sekvensering. Båda de listade stegen är viktiga för att bestämma kvaliteten och djupet av sekvensering läsningar som är slutresultatet från körningen24. Därför är det viktigt att optimera des...

Prostatacancer drivs av androgener som agerar via AR-signalering. Därför, inriktning på AR vägen är stöttepelaren behandling för sjukdomen1. Emellertid, resistens uppstår ofta som ett resultat av riktade terapier och sjukdomen fortskrider till en avancerad metastaserad CRPC2. CRPC behandlas av andra generationen av ar-behandling som inkluderar enzalutamid och abirateron2,3 vilket förbättrar överlevnaden initialt. Men dödliga varianter som NEPC uppstår ofta i 25 − 30% av behandlade CRPC fall som har begränsade behandlingsalternativ, vilket leder till ökad dödlighet3. Nepc uppstår via en reversibel transdifferentieringsprocess som kallas ned, vari PCa celler genomgår en härstamnings växling från adenocarcinom och visar minskat uttryck av ar och ökat uttryck av ne Lineage markörer inklusive knäck 2 (ENO2), chromogranin a (chga), och synaptophysin (SYP)4. Med tanke på att dessa resistens varianter uppstår som ett resultat av terapeutiska interventioner, är det viktigt att dechiffrera vägar som leder till generering av denna dödliga, svårt att behandla form av PCa.
Genomik av nepc var nyligen dechiffreras i en uttömmande studie som gjorts av Beltran et al. där kopior antal förändringar, mutationer, enstaka nukleotid polymorfismer (SNP), och DNA-metylering från patient-derived metastatiska vävnader analyserades5. Trots betydande framsteg i förståelsen av genomik av denna aggressiva form av PCa, är lite känt om epigenetiska faktorer, inklusive den lilla icke-kodning RNAs (microRNAs) som är inblandade i övergången av CRPC-adenocarcinom till NEPC. Micrornas (mirnas) är 22 BP lång, dubbelsträngad rnas som agerar främst genom att undertrycka genuttryck efter transkriptionellt genom sekvens-specifika interaktioner med 3 '-oöversatta regioner (utrs) av besläktat mRNA mål6. Flera oncomirs och tumörsuppressorer har nu identifierats, och deras roll i regleringen av sjukdomsdebut och metastaser har studerats väl i olika cancerformer6,7. Dessa små icke-kodbara rnas fungerar ofta som mycket viktiga mål för att kontrollera sjukdoms dödligheten6,8,9. Nyare forskning har fokuserat på att förstå parakrin effekterna av mirnas i cancermetastaser via deras transport i EVS, såsom exosomes, att flödet i blodet och låta tumörceller att skicka dessa sekundära budbärare till metastaserande platser i en nukleasfri miljö10,11,12. EVs bär miRNAs från tumörcellerna för att överföra omformande effekterna från värdcellerna12. Identifiering av EVs som sekundära budbärare av tumörceller kan därför vara användbara i noninvasiv detektion av sjukdoms svårighetsgrad.
MiR-1246 är mycket uppreglerad i EVs från aggressiva PCa, och det indikerar sjukdomens svårighetsgrad13. Dessa EV-associerade miRNAs inte bara fungera som noninvasiv biomarkörer för sjukdomen, men också spela funktionellt viktiga roller i körningen tumorigenesis. Därför är det viktigt att förstå betydelsen av miRNA-repertoaren som är förknippad med resistenta former av PCa för att möjliggöra bättre identifiering av noninvasiv biomarkörer samt deras funktionella betydelse.
Tillkomsten av nästa generations sekvensering har erbjudit den mest omfattande plattform för att studera detaljerna i tumör landskap med förändringar i genomet såsom mutationer, kromosomala omlokaliseringar, kromothripsis, och metylering, som alla bidrar avsevärt till formen och arten av cancer14,15,16. Likaså, det är också ett viktigt verktyg för att förstå de stora epigenomiska förändringar som sker i en tumör cell och som ofta är viktiga aktörer i sjukdomens svårighetsgrad17. I syfte att förstå miRNA repertoar i samband med generering av NEPC, liten RNA sekvensering utfördes på FFPE metastaserad CRPC vävnader och deras motsvarande serum-derived EVs. RNA som härrör från någon av dessa två provkällor är (1) låg i avkastning och (2) av dålig kvalitet på grund av nedbrytningen som ofta sker på grund av formalin fixering och EV isolering. Dessutom är generering av cDNA-bibliotek en kritisk, men besvärlig, steg i en sekvenserings körning. Metoder för att isolera dessa RNAs och använda dem för att generera bibliotek för små RNA-sekvensering kräver därför optimering för att generera korrekta och tillförlitliga data.
Det finns flera metoder för att profilera miRNA uttryck i olika prover, inklusive RT-PCR, Microarrays, och in situ hybridisering (ISH). Ett protokoll som använder FFPE vävnad-härledda RNA för att utvärdera miRNA uttryck av RT-PCR och ISH publicerades nyligen18. Nyare teknik erbjuder mer uttömmande och omfattande plattformar för profilering miRNA uttryck i ett prov. NanoString nCounter erbjuder en känslig miRNA detekterings plattform19, men upptäckten är ofta begränsad av antalet mirnas som är tillgängliga i matrisen (~ 2 000). I ett sådant scenario, en känsligare och uttömmande plattform som nästa generations sekvensering erbjuder mycket bredare djup av miRNA identifiering och samtidig profilering i olika prover20. Metoden har använts för att bestämma Mirna-signaturer i urin eller plasma från PCa-patienter21,22,23. I den nuvarande artikeln presenteras ett protokoll för att använda en nästa generations sekvenserings plattform för att studera miRNA-profiler i samband med aggressiv CRPC med hjälp av FFPE-vävnader och serum-härledda EV-RNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

Ablation av androgenreceptorn (AR) signalering av androgen deprivation är målet för den första raden av behandling för prostatacancer som initialt resulterar i cancer regression. Emellertid, i ett stort antal fall, sjukdomen fortskrider till avancerad, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), som har begränsade terapeutiska alternativ och är ofta aggressiv. Avlägsen metastaser observeras främst i detta skede av den aggressiva sjukdomen. CRPC behandlas av en andra generation av AR-utbildningshämmare som förbättrar överlevnaden initialt, följt av uppkomsten av behandlingsresistens. Neuroendokrina prostatacancer (NEPC) är en sällsynt variant av prostatacancer (PCa) som ofta utvecklas som ett resultat av terapi resistens via en transdifferentiering process som kallas neuroendokrina differentiering (NED), vari PCa celler genomgår en Lineage switch från adenocarcinom och Visa ökat uttryck för neuroendokrina (NE) härstamning markörer. Förutom de genomiska förändringar som driver utvecklingen och transdifferentieringen till NEPC, epigenetiska faktorer och mikromiljö signaler anses vara viktiga aktörer för att driva sjukdomsprogression. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att identifiera de epigenetiska drivrutinerna (dvs. små icke-kodning RNAs) som är förknippade med Advanced PCa. Med hjälp av renad mikroRNAs från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) metastatiska vävnader och motsvarande serumhärledda extracellulära blåsor (EVs), beskriver protokollet hur man förbereder bibliotek med lämplig kvalitetskontroll för sekvensering mikroRNAs från dessa provkällor. Isolera RNA från både FFPE och EVs är ofta utmanande eftersom de flesta av det är antingen försämrad eller är begränsad i kvantitet. Detta protokoll kommer att utveckla olika metoder för att optimera RNA-ingångar och cDNA-bibliotek för att ge mest specifika läsningar och data av hög kvalitet vid sekvensering.

Biblioteket utarbetades efter RNA-isolering och en kvalitetskontroll utfördes. Gel rening för det förstärkta cDNA-biblioteket som framställs av RNA som isolerats från mikrodissekerade vävnader och serum-derived EVs visas i figur 1 och figur 2. Den produkt storlek för adapter-ligated miRNAs motsvarade cirka 136 − 160 BP för varje prov. Figur 1A-B är markerade för att visa det sortiment av gelen som ska v...

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Terapi resistens utvecklas ofta hos patienter med avancerad prostatacancer, och i vissa fall, cancer fortskrider till en dödlig subtyp kallas neuroendokrina prostatacancer. Att bedöma de små icke-kodning RNA-medierade molekylära förändringar som underlättar denna övergång skulle möjliggöra bättre sjukdoms stratifiering och identifiering av kausala mekanismer som leder till utveckling av neuroendokrina prostatacancer.

Sekvensering av små icke-kodande RNA från formalin-fasta vävnader och serum-härledda exosomer från Kastrationsresistenta prostata cancer patienter

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Med hjälp av detta protokoll forskare kan identifiera nya exome eller extracellulära vesikel baserade och vävnadsbaserade mikro cellulära för avancerad prostatacancer. Isolera RNA från både F-F-B vävnader och extracellulära vesiklar är ofta utmanande eftersom de flesta av det är antingen de skapas eller är i begränsad mängd Denna partikel kommer att utveckla olika metoder för att optimera R-N-A ingångar och C-D-N-A bibliotek till genen mest specifika fria och högkvalitativa data för nästa generations sekvensering. Nästa gen sekvensering erbjuder den mest omfattande plattformen för att förstå molekyl förändring i tumör som ligger bakom tumörprogression denna partikel är optimerad med prostatacancer kliniska prov, och kan ge nya insikter i den underliggande biologi avancerade aggressiv prostatacancer.Optimera C-D-N-A bibliotek från låg input material är ett avgörande steg för en framgångsrik sekvensering köra det är därför mycket viktigt att generera högkvalitativa C-D-N-A bibliotek för att få korrekta resultat. Efter att ha utfört mikro dissekering av vävnader som tidigare gjort gå vidare till isolera serum härledda E-V: s Thaw rader av patienten serum prover vid fyra grader celsius. Överför 110 mikro liter tinat serumprov till ett rör och snurra på två tusen gånger G i trettio minuter.Välj super naden för efterföljande E-V eller exosom isolering och kasta debree pellet. Vid 30 mikroleters av serum exosom isolering reagens till super natent. En inkubera det fyra grader celsius i trettio minuter.Snurra på tio tusen gånger G i tio minuter. Välj E-V super nadent försiktigt utan att störa pelleten i ett separat 1,5 milliliter rör och lagra minus 80 grader Celsius för framtida analys. Sedan åter upphäva E-V pellet i 70 mikro liter P-B-S beredd i nukleas fritt vatten.Efter att ha isolerat totala R-N-A från mikro dissekerade vävnader, och renas E-V: s med hjälp av kommersiella kit utföra Library Preparation i fem mikro liter av en normaliserad fyrtio nanogram per mikro liter R-N-A prov på en mikro liter av tre främsta adapter. Föruppvärm den termiska cyclern till 70 grader celsius och inkubera provet i två minuter. Omedelbart överföra proverna på is.I ett separat rör blanda två mikro liter ligering buffert, en mikro liter RNase-hämmare och en mikro liter T4 RNA ligase två, en borttagning mutant. Blanda bye paj sängkläder upp och ner. Tillsätt sedan fyra mikro liter av blandningen till röret med R-N-A 3 prime adapter på is.Förvärm den termiska cyclern till 28 grader Celsius. Och placera röret i den termiska cyclern att inkubera i en timme. Efter det, tillsätt en mikro liter stopplösning i röret samtidigt som provet på termiska cycler.Inkubera vid 28 grader Celsius i ytterligare 15 minuter. Ta sedan genast bort röret och håll på is. I ett separat rör lägga till en mikroliter av fem främsta adapter.Överför till en termisk cycler som har förvärmts till 70 grader Celsius. Och ruvar i två minuter. Placera omedelbart röret på is för att förhindra återannealing av adaptrarna.Lägg till en mikro liter av tio millimolE A-T-P till röret av D natured fem främsta adapter. Blanda bye pie pedding och tillsätt en mikro liter T4 R-N-A ligase till mixen. Blanda bye pie pedding.Överför tre mikroliter av denna mix till röret som innehåller de tre främsta adaptern ligated R-N-A. Placera röret på den termiska cycler som har föruppvärmts till 28 grader celsius och inkubera i en timme. Efter det omedelbart överföra röret på is och antingen gå vidare med proverna eller lagra på minus 80 grader Celsius för framtida bruk.För att utföra R-T-P-C-R, använd sex mikro ligers av varje adapter ligerade R-N-A och lägga till en mikro liger av R-N-A R-T primer till den. Överför röret till termiska cycler förvärmt till 70 grader Celsius och inkubera i två minuter. Överför röret till is.I ett separat rör blanda två mikro liter 5X, strand buffert, 5 mikro liter 12,5 milimoler DNTP's, en mikro liter 100 milimolar DTT, en mikro liter R-N-A: s hämmare, och en mikro liter omvänd transkriptas. Lägg till fem mikroliter av denna mix till adaptern ligated RNA och överför den till den termiska cycler som har förvärmts till 50 grader Celsius för att inkubera i en timme. Efter en timme överföring adaptern ligated gratis DNA omedelbart till is.I ett separat rör, blanda 25 mikroliter PCR mix, två mikro liter RNA PCR primer, två mikro liter RNA PCR primer index, och 8,5 mikroliter av RNA: s fria vatten. Lägg till 37,5 mikroliter av denna mix till 12,5 mikroliter av adaptern ligerade CDNA. Överför röret till den termiska cycler som har förvärmts till 98 grader celsius.Programmera termisk cycler som föreslås i tillverkarens protokoll med cykeln nummer ändrats till 15. Efter avslutad, hålla provet på fyra grader celsius. Fortsätt eller lagra på minus 80 grader celsius för framtida bruk.För att rena den ligated gratis DNA, tillsätt tio mikroliter av DNA-lastning färgämnet till varje gratis DNA-prov. Och till tio microliters av kickupplösta latteren och beställnings- RNA-sistnämnden. Kör 30 mikroliter av varje prov i två separata körfält intill varandra i sex procent TBE Polyakrylamide gel.Med anpassade RNA-sistnämnd och högupplösnings latter, tar prov mellanrummet mellan tvåna. Kör gelen i en X TBE-buffert vid 145 volt i cirka 30 till 40 minuter. Håll koll på den nedre blå fronten på lastningsfärgen.Stoppa elektroforesen när den närmar sig gelens botten. Överför gelen i en X TBE-buffert med 5 mikrogram per millimeters ethidiumbromid. Visualisera gelen i en transilluminator och skär gelen exakt mellan 145 basparet och 160 basparmarkörer och något över 145 basparets markör för att undvika kontaminering med adapterdysser.Ett kritiskt steg är renings ligated CDNA som görs genom att skära gelen just som adapter dimers springa mycket förlora till önskat varumärke. Överför gelbitarna till DNA-brytande rör som hålls i två millimetersamlande rör. Snurra på 20 tusen gånger G i två minuter.Och tillsätt tre hundra mikro liter RNase-fritt vatten och låt den rotera försiktigt på en vipp över natten vid rumstemperatur. För att utföra DNA-utfällningen följande dag överför innehållet i röret till 5 mikronfilterrör. Snurra 600 gånger G i strikt tio sekunder.Tillsätt sedan två mikroliter av glykogen trettio mikroliter av tre molar natriumacetat, 1X pelletfärg, och 975 mikroliter av 100 procent etanol till eluted DNA. Snurra på 17, 000 gånger G vid 4 grader Celsius i 20 minuter. Kassera supernatanten och tillsätt 75 procent etanol för att tvätta pelleten.Efter spinning på 17 tusen gånger G vid fyra grader celsius i fem minuter kasta supernatanten och inkubera rören på 37 grader celsius på ett termiskt block helt avdunsta etanol. Re suspend pelleten med 12 mikroliter av 10 millimolar triciderklorid vid PH 8.5. Nästa utföra ett bibliotek kvalitetskontroll genom att späda ut den renade och gratis DNA tio gånger och använda en mikroliter av den utspädda CDNA att köras på en bioanalyzer.Se till att den kostnadsfria DNA-produktstorleken motsvarar intervallet för det lilla RNA i elektroferogrammet mellan 136 och 160 baspar. Beräkna den totala molariteten för varje prov. Normalisera varje prov till 2 nanomolar med hjälp av trishydrokloriden vid PH 8.5.Håll biblioteken genom att blanda lika stora volymer av varje två nanomolarprov i ett enda tvåhundra microliter PCR-rör. Denaturer och sekvens som följer stegen enligt beskrivningen i manuskriptet. I denna studie upprättades biblioteket efter RNA-isolering och en kvalitetskontroll utfördes.Produktstorleken för adapter ligated micro Rnase motsvarade ca 136 till 160 baspar för varje prov. De markerade avsnitten visar utbudet av gelen som var exakt strukits för små RNA bibliotek av beredning. Denna figur visar gelelektrofores och elektroferogram för det renade kostnadsfria DNA-biblioteket.Micro dissekerade FFPE vävnad och serum härlett EV's. De representativa måtten från en liten RNA-sekvenseringskörning visar förväntad klusterdensitet, Q-poäng, kluster som passerar filterprocent och den uppskattade avkastningen och felfrekvenserna för mikro dissekerad FFP-vävnad och serum som härleds EV:s. Q-poängen i båda proverna visade ett värde över tre som indikerar 99,9 procent av bassamtalsnoggrannheten.Och felfrekvenserna var alla under en. Varje steg i biblioteksberedningen bör utföras noggrant och rören bör omedelbart överföras till is efter varje inkubation. Ett kritiskt steg i protokollet är att skära gelen just för att säkerställa att du har en adapter dimer fri och ren CDNA bibliotek.Generera CDNA bibliotek kräver optimering för en hög kvalitet sekvensering köra. Förstå detta protokoll kommer att hjälpa tittarna att extrapolera dessa små detaljer till andra sekvensering bibliotek prepration från begränsad källa prover tyder på serum och extracellulära vesicles. Denna teknik har hjälpt oss att identifiera nya mikronas som är associerade tumorate aggressivitet och terapi motstånd i metastaserande prostatacancer patienter.Dessa tekniker kan extrapoleras till andra sjukdomstyper som kan stöd i Novel biomarkör upptäckt. Eftersom denna teknik använder biologiska material såsom striation härledda serum och vävnadsprover, bör man vidta lämpliga försiktighetsåtgärder. Vidare är ethidiumbromid ett känt cancerframkallande ämne och bör hanteras mycket noggrant genom att använda detta protokoll.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En självlysande och fluorescerande ortotop syngena murina modell av Androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Använda 22C 3 Anti-PD-L1 antikropp koncentreras biopsi och cytologi prover från icke-small Cell Lung cancerpatienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Automatiserad Multiplex immunofluorescens Panel för immunonkologiska studier på Formalin-fasta Carcinoma vävnadsprover

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Fånga småmolekylära kommunikation mellan vävnader och celler som använder Imaging masspektrometri

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Etablering och analys av tredimensionella (3D) organoider som härrör från patienten prostatacancer Ben metastasering exemplar och deras Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Beredning av Mitokona från äggstocks cancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Automatiserat dissektionsprotokoll för tumöranrikning i vävnader med lågt tumörinnehåll

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Tre differentialuttrycksanalysmetoder för RNA-sekvensering: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...