Name: sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Edinme Aktivitesi (USAMRAA) tarafından Fikir Geliştirme Ödülü altında Ödül No ile desteklenir. W81XWH-18-1-303 ve W81XWH-18-2-0013 ve ayrıca Ödül no. W81XWH-18-2-0015, W81XWH-18-2-0016, W81XWH-18-2-0017, W81XWH-18-2-0018 ve W81XWH-18-2-0019 Prostat Kanseri Biyorepozitory Network (PCBN). Ulusal Sağlık Enstitüleri (Grant Number RO1CA177984) ulusal kanser enstitüsü tarafından yazarların laboratuvarına finansman desteği de kabul edilmektedir. Rajvir Dahiya, BX004473 Gazi İşleri Bölümü'nde Kıdemli Araştırma Kariyer BilimCisi dir ve NIH-UO1199694 (RD) tarafından finanse edilmektedir. Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Mutlaka Savunma Bakanlığı veya ABD Ordusu tarafından onaylanmaz. Biz Judy Shigenaga, San Francisco VAMC de çekirdek tesis müdürü, NextSeq 500 sequencer ile ona yardım için müteşekkiriz.

Bu çalışma, ABD Ortak Kuralı'nın etik kurallarına uygun olarak yürütülmüş ve Kurumsal İnsan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Mikrodiseksiyon
NOT: Adenokarsinom (CRPC-Adeno) veya NE farklılaşması (CRPC-NE) olan FFPE metastatik CRPC dokuları Prostat Kanseri Biyorepozitory Network'ten (PCBN) alındı. Cam slaytlar üzerinde on mikron PCa bölümleri daha önce18tartışıldığı gibi manu...

<ol>
	<li>Heinlein, C. A., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+in+prostate+cancer.">Androgen receptor in prostate cancer.</a> Endocrine Reviews. 25 (2), 276-308 (2004).</li><li>Tilki, D., Schaeffer, E. M., Evans, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Mechanisms+of+Resistance+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer:+The+Role+of+the+Androgen+Receptor.">Understanding Mechanisms of Resistance in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer: The Role of the Androgen Receptor.</a> European Urology Focus. 2 (5), 499-505 (2016).</li><li>Vlachostergios, P. J., Puca, L., Beltran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Variants+of+Castration-Resistant+Prostate+Cancer.">Emerging Variants of Castration-Resistant Prostate Cancer.</a> Current Oncology Reports. 19 (5), 32 (2017).</li><li>Aggarwal, R., Zhang, T., Small, E. J., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+prostate+cancer:+subtypes,+biology,+and+clinical+outcomes.">Neuroendocrine prostate cancer: subtypes, biology, and clinical outcomes.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 12 (5), 719-726 (2014).</li><li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+clonal+evolution+of+castration-resistant+neuroendocrine+prostate+cancer.">Divergent clonal evolution of castration-resistant neuroendocrine prostate cancer.</a> Nature Medicine. 22 (3), 298-305 (2016).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).</li><li>Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+prostate+cancer.">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 17 (1), 1-17 (2010).</li><li>Ambs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer.">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Research. 68 (15), 6162-6170 (2008).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li><li>Bhagirath, D., Yang, T. L., Dahiya, R., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+Regulators+of+Prostate+Cancer+Metastasis.">MicroRNAs as Regulators of Prostate Cancer Metastasis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1095, 83-100 (2018).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Bhagirath, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA-1246+Is+an+Exosomal+Biomarker+for+Aggressive+Prostate+Cancer.">microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (7), 1833-1844 (2018).</li><li>Witte, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+genomics:+towards+a+new+understanding.">Prostate cancer genomics: towards a new understanding.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (2), 77-82 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+distinct+patterns+of+DNA+methylation+in+prostate+cancer.">Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer.</a> Genome Research. 21 (7), 1028-1041 (2011).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+clinical+genomics+of+advanced+prostate+cancer.">Integrative clinical genomics of advanced prostate cancer.</a> Cell. 161 (5), 1215-1228 (2015).</li><li>Kim, J., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+genomic+and+epigenomic+data+to+understand+prostate+cancer.">Interrogating genomic and epigenomic data to understand prostate cancer.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1825 (2), 186-196 (2012).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+Expression+Analyses+in+Prostate+Cancer+Clinical+Tissues.">miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53123 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nature Biotechnology. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies.">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Laboratory Investigation. 94 (3), 350-358 (2014).</li><li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+noninvasive+miRNAs+biomarkers+for+prostate+cancer+by+deep+sequencing+analysis+of+urinary+exosomes.">Identification of noninvasive miRNAs biomarkers for prostate cancer by deep sequencing analysis of urinary exosomes.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 156 (2017).</li><li>Guelfi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+Generation+Sequencing+of+urine+exfoliated+cells:+an+approach+of+prostate+cancer+microRNAs+research.">Next Generation Sequencing of urine exfoliated cells: an approach of prostate cancer microRNAs research.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7111 (2018).</li><li>Daniel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Panel+of+MicroRNAs+as+Diagnostic+Biomarkers+for+the+Identification+of+Prostate+Cancer.">A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1281 (2017).</li><li>Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+in+the+clinic:+promises+and+challenges.">Next-generation sequencing in the clinic: promises and challenges.</a> Cancer Letters. 340 (2), 284-295 (2013).</li></ol>

Bu makalede, izole RNA'ların verimini ve kalitesini artırmak için optimize edilmiş kitleri kullanarak RNA'yı FFPE dokularından ve serum kaynaklı EV'lerden izole eden bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, saflaştırılmış RNA'lar küçük RNA dizilimi için cDNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılmıştır. Listelenen adımların her ikisi de,24'ünnihai sonucu olan sıralama okumalarının kalitesini ve derinliğini belirlemede gereklidir. Bu nedenle, bu önemli adımları optimiz...

Prostat kanseri AR sinyalizasyon yoluyla hareket androjenler tarafından tahrik edilir. Bu nedenle, AR yolu hedefleme hastalık için dayanak tedavi1. Ancak, direnç genellikle hedeflenen tedaviler in bir sonucu olarak ortaya çıkar ve hastalık ileri metastatik CRPC2ilerler. CRPC başlangıçta sağkalımı artırır enzalutamide ve abiraterone2,3 içeren AR tedavisinin ikinci nesil tarafından tedavi edilir. Ancak, NEPC gibi öldürücü varyantlar genellikle tedavi seçenekleri sınırlı olan tedavi edilen CRPC olgularının %25−30'unda ortaya çıkar ve mortalite artışına yol açar3. NEPC NED olarak bilinen bir geri dönüşümlü transfarklısyon süreci ile ortaya çıkar, PCa hücreleri adenokarsinomlardan bir soy anahtarı geçmesi ve AR azalmış ekspresyonu ve enolase 2 dahil OLMAK ÜZERE NE soy belirteçleri artan ekspresyonu göstermek 2 (ENO2), kromogranin A (CHGA), ve sinaptophysin (SYP)4. Bu direnç varyantları terapötik müdahaleler sonucunda ortaya çıkar göz önüne alındığında, bu ölümcül nesil yol açan yolları deşifre etmek esastır, PCa formu tedavi etmek zor.
NEPC'nin genomik leri yakın zamanda Beltran ve arkadaşları tarafından yapılan kapsamlı bir çalışmada deşifre edilmiştir ve kopya numarası değişiklikleri, mutasyonlar, tek nükleotit polimorfizmleri (SNP) ve hasta kaynaklı metastatik dokulardan DNA metilasyon 5 analizedilmiştir. PCa'nın bu agresif formunun genomiklerinin anlaşılmasında ki önemli ilerlemeye rağmen, CRPC-adenokarsinomunun NEPC'ye geçişinde rol oynayan küçük kodlamayan RNA'lar (mikroRNA'lar) dahil olmak üzere epigenetik faktörler hakkında çok az şey bilinmektedir. MicroRNA'lar (miRNA'lar) 22 bp uzunluğunda, çift iplikli RNA'lardır ve öncelikle gen ekspresyonunu transkripsiyon eliyle baskılayarak 3'-çevrilmemiş bölgelerle (UTR) diziye özgü etkileşimler yaparak hareket eden mRNA hedefleri6'dır. Birkaç oncomiRs ve tümör baskılayıcılar şimdi tespit edilmiştir, ve hastalık başlangıçlı ve metastaz düzenleyen rollerini de farklı kanserlerde çalışılmıştır6,7. Bu küçük kodlamaz RNA'lar genellikle hastalık mortalite6,8,9kontrolünde çok önemli hedefler olarak hizmet vermektedir. Daha yeni araştırmalar, kanser metastazında miRNA'ların parakrin etkilerini anlamak üzerine odaklanmıştır, örneğin ekzozomlar, kan dolaşımında akan ve tümör hücrelerinin bu ikincil habercileri çekirdeksiz bir ortamda metastatik yerlere göndermesine izin vermek10,11,12. EVs ev sahibi hücrelerden dönüştürücü etkileri aktarmak için tümör hücrelerinden miRNA'lar taşır12. Bu nedenle, tümör hücrelerinin ikincil habercileri olarak EVs belirlenmesi hastalığın şiddetinin noninvaziv tespitiyararlı olabilir.
MiR-1246 agresif PCa'lardan evs son derece upregulated, ve hastalığın şiddetini gösterir13. Bu EV ilişkili miRNA'lar sadece hastalığın noninvaziv biyobelirteçleri olarak hizmet değil, aynı zamanda tümörigenez sürüş işlevsel olarak önemli roller oynamaktadır. Bu nedenle, noninvaziv biyobelirteçlerin daha iyi tanımlanmasına ve işlevsel önemine olanak sağlamak için PCa'nın dirençli formları ile ilişkili miRNA repertinin önemini anlamak önemlidir.
Yeni nesil sıralama gelişiyle mutasyonlar, kromozomal tehsülasyonlar, kromotomal tehkisler ve metilasyon gibi genom değişiklikleri içeren tümör manzara ayrıntılarını incelemek için en kapsamlı platform sundu, bunların hepsi kanser in formu ve doğasına önemli ölçüde katkıda14,15,16. Aynı şekilde, aynı zamanda bir tümör hücresinde meydana gelen ve genellikle hastalık şiddeti önemli oyuncular olan büyük epigenomik değişiklikleri anlamak için önemli bir araçtır17. NEPC üretimi ile ilişkili miRNA repertuarının anlaşılması amacıyla FFPE metastatik CRPC dokuları ve buna karşılık gelen serum kaynaklı EV'lerde küçük RNA dizilimi yapılmıştır. Bu iki örnek kaynaktan birinden elde edilen RNA verimi (1) düşük ve (2) formalin fiksasyonu ve EV izolasyonu nedeniyle sıklıkla oluşan bozulmanedeniyle kötü kalitededir. Ayrıca, cDNA kitaplıkları oluşturmak kritik, ama hantal, bir sıralama çalışmasının adımıdır. Bu nedenle, bu RNA'ları yalıtmak ve bunları küçük RNA sıralamaiçin kitaplıkoluşturmak için kullanmak için yöntemler doğru ve güvenilir veri oluşturmak için optimizasyon gerektirir.
RT-PCR, mikrodiziler ve yerinde hibridizasyon (ISH) dahil olmak üzere farklı örneklerde miRNA ekspresyonu profillemek için çeşitli yöntemler vardır. RT-PCR ve ISH tarafından miRNA ekspresyonu değerlendirmek için FFPE doku kaynaklı RNA kullanarak bir protokol son zamanlarda18yayınlandı . Daha yeni teknolojiler, bir örnekte miRNA ifadesini profilleme için daha kapsamlı ve kapsamlı platformlar sunar. NanoString nCounter hassas bir miRNA algılama platformu19sunar, ancak algılama genellikle dizi (~ 2.000) mevcuttur miRNA sayısı ile sınırlıdır. Böyle bir senaryoda, yeni nesil sıralama gibi daha hassas ve ayrıntılı bir platform miRNA tanımlama ve farklı örneklerde eşzamanlı profilleme çok daha geniş bir derinlik sunuyor20. Yöntem PCa hastalarından idrar veya plazma da miRNA izlerini belirlemek için kullanılmıştır21,22,23. Mevcut makalede, ffpe dokuları ve serum kaynaklı EV RNA'lar kullanarak agresif CRPC ile ilişkili miRNA profillerini incelemek için yeni nesil bir sıralama platformu kullanmak üzere bir protokol sunulmuştur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3M NaOAc pH 5.5</td>
			<td>USB Corp.</td>
			<td>75897 100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#181;m filter tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>5388-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% TBE polyacrylamide gels</td>
			<td>Novex</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseSpace</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermostat plus</td>
			<td>Eppendorf 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtBr</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosomal RNA isolation kit</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>58000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel breaking tubes</td>
			<td>IST Engineering Inc.</td>
			<td>3388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen molecular biology grade</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Select</td>
			<td>Stat lab</td>
			<td>SL401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td>accuSpin Micro 17R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy FFPE kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientifc</td>
			<td>Nano Drop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>LM14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet paint</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>70748-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>LR2D11310K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Running buffer (5X)</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total exosome isolation reagent (from serum)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>4478360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P- 1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 3&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 5&#39; Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Oligo</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA RT Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>6 bases in adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CGTGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ACATCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCTAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGGTCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CACTGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ATTGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GATCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TCAAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTGATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AAGCTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTAGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA PCR Index Primer 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TACAAG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequencing small non-coding rna from formalin-fixed tissues and serum-derived exosomes from castration-resistant prostate cancer patients

Androjen reseptörünün ablasyon (AR) androjen yoksunluğu ile sinyal başlangıçta kanser regresyon ile sonuçlanan prostat kanseri için tedavinin ilk satırının hedefidir. Ancak, vakaların önemli sayıda, hastalık ileri ilerlemiş ilerler, hadım dirençli prostat kanseri (CRPC), hangi sınırlı tedavi seçenekleri vardır ve genellikle agresif. Uzak metastaz çoğunlukla agresif hastalığın bu aşamasında gözlenir. CRPC başlangıçta sağkalımı artırmak AR yol inhibitörleri ikinci nesil tarafından tedavi edilir, tedavi direnci ortaya çıkması takip. Nöroendokrin prostat kanseri (NEPC), nöroendokrin farklılaşma (NED) olarak bilinen bir transfarklısiasyon süreci ile tedavi direnci nin bir sonucu olarak sıklıkla gelişen prostat kanserinin (PCa) nadir bir çeşididir ve pca hücreleri bir soy değişimine uğrar. adenokarsinomlardan ve nöroendokrin (NE) soy belirteçlerinin artmış ekspresyonu gösterir. NEPC'ye ilerleme ve transdifferentiasyonu yönlendiren genomik değişikliklere ek olarak, epigenetik faktörler ve mikroçevresel ipuçları hastalığın ilerlemesini niçin yönlendiren temel oyuncular olarak kabul edilir. Bu el yazması, gelişmiş PCa ile ilişkili epigenetik sürücüleri (yani, kodlamayan küçük RNA'ları) tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) metastatik dokulardan ve buna karşılık gelen serum kaynaklı ekstrasellüler veziküllerden (EVs) saflaştırılmış mikroRNA'lar kullanan protokol, sıralama için uygun kalite kontrolüne sahip kütüphanelerin nasıl hazırlanacağını açıklar. bu örnek kaynaklardan mikroRNA'lar. RNA'yı hem FFPE hem de EVs'den yalıtmak genellikle zordur, çünkü çoğu bozulmuş tur veya miktar olarak sınırlıdır. Bu protokol, sıralama da en özel okumave yüksek kaliteli verileri elde etmek için RNA girişlerini ve cDNA kitaplıklarını optimize etmek için farklı yöntemler üzerinde ayrıntılı olacaktır.

Kütüphane RNA izolasyonundan sonra hazırlandı ve kalite kontrolü yapıldı. Mikrodiskoplu dokulardan ve serum türetilmiş EV'lerden izole edilen RNA'dan hazırlanan güçlendirilmiş cDNA kütüphanesi için jel arınması Şekil 1 ve Şekil 2'degösterilmiştir. Adaptör-ligated miRNA'ların ürün boyutu her numune için yaklaşık 136−160 bp'ye karşılık gelmektedir. Şekil 1A-B, küçük RNA kitaplığ...

Watch this Scientific Journal Video about Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients at JoVE.com

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Tedavi direnci genellikle ileri prostat kanseri olan hastalarda gelişir, ve bazı durumlarda, kanser nöroendokrin prostat kanseri denilen ölümcül bir alt tip ilerler. Bu geçişi kolaylaştıran küçük kodlamayan RNA aracılı moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi, daha iyi hastalık tabakalaşmasına ve nöroendokrin prostat kanserigelişimine yol açan nedensel mekanizmaların tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Bu protokolün kullanımı ile araştırmacılar ileri prostat kanseri için yeni eksom veya ekstrasellüler vezikül bazlı ve doku bazlı mikro hücresel belirleyebilirsiniz. RNA'yı hem F-F-B dokularından hem de hücre dışı veziküllerden izole etmek genellikle zor bir durumdur, çünkü çoğu de yaratılmıştır ya da sınırlı miktarda dır Bu parçacık, yeni nesil sıralama için en spesifik serbest ve yüksek kaliteli verileri genleştirmek için R-N-A girdileri ve C-D-N-A kitaplıklarını optimize etmek için farklı yöntemler üzerinde ayrıntılı olacaktır. Sonraki gen dizilişi tümör progresyonunun altında yatan tümörmolekül değişimini anlamak için en kapsamlı platformu sunar bu parçacık prostat kanseri klinik örneği ile optimize edilir ve ileri agresif prostat kanserinin altta yatan biyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.C-D-N-A kitaplıklarının düşük giriş li malzemeden optimize etmek, başarılı bir sıralama çalışması için çok önemli bir adımdır ve bu nedenle doğru sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli C-D-N-A kitaplıkları oluşturmak çok önemlidir. Daha önce yapılan gibi dokuların mikro diseksiyon yaptıktan sonra dört santigrat derece hasta serum örneklerinin serum türetilmiş E-V's Çözülme satırları izole devam edin. 110 mikro litre çözülmüş serum örneğini bir tüpe aktarın ve otuz dakika boyunca iki bin kez G'de döndürün.Sonraki E-V veya ekzozom izolasyon için süper naden seçin ve debree pelet atın. Süper natent için serum ekzozom izolasyon reaktif30 mikroleter at. 30 dakika boyunca 4 derece lik bir kuluçka.On dakika boyunca on bin kez G spin. Ayrı bir 1,5 mililitrelik tüp pelet rahatsız etmeden dikkatle E-V süper nadent seçin ve gelecekteki analiz için eksi 80 derece santigrat saklayın. Daha sonra çekirdeksiz suda hazırlanan 70 mikro p-b-s'lik E-V peletini yeniden askıya alın.Mikro diseksiyon dokulardan toplam R-N-A izole sonra, ve saflaştırılmış E-V ticari kitleri kullanarak üç asal adaptör bir mikro litre de mikro litre R-N-A örnek başına normalleştirilmiş kırk nanogram beş mikro litre içine Kütüphane Hazırlama gerçekleştirmek. Termal döngüciyi 70 dereceye ısıtın ve numuneyi iki dakika kuluçkaya yatırın. Örnekleri hemen buza aktarın.Ayrı bir tüp karışımı ligasyon tampon iki mikro litre, RNase inhibitörü bir mikro litre ve T4 RNA ligaz iki bir mikro litre, bir silme mutant. Mix bye pasta yukarı ve aşağı yatak. Daha sonra buz üzerinde R-N-A 3 prime adaptörü ile tüp karışımı dört mikro litre ekleyin.Termal döngücörü önceden 28 dereceye ısıtın. Ve tüpü termal döngüye yerleştirip bir saat kuluçkaya yatın. Bundan sonra, termal döngü üzerinde örnek tutarken tüp içine stop çözeltisi bir mikro litre ekleyin.28 derecede 15 dakika daha kuluçkaya yat. Sonra hemen tüp çıkarın ve buz üzerinde tutmak. Ayrı bir tüp beş asal adaptör bir mikrolitre ekleyin.Önceden ısıtılmış bir ısı döngüsüne transfer. Ve iki dakika kuluçkaya yat. Adaptörlerin yeniden anneolaling önlemek için hemen buz üzerine tüp yerleştirin.D tabiatlı beş ana adaptör tüpüne on milimole A-T-P bir mikro litre ekleyin. Mix bye pasta pedding ve karışımıtmak için T4 R-N-A ligaz bir mikro litre ekleyin. Mix bye pasta pedding.Bu karışımın üç mikrolitresini, üç ana adaptör içeren tüpe aktarın. Tüpü önceden 28 dereceye kadar ısıtılan termal döngüye yerleştirin ve bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bundan sonra hemen buz üzerine tüp aktarın ve ya örnekler ile daha fazla devam veya eksi 80 santigrat derece gelecekte kullanım için saklayın.R-T-P-C-R gerçekleştirmek için, her adaptör den altı mikro elendir r-n-a ligated kullanın ve r-n-A R-T astar bir mikro liger ekleyin. Tüpü önceden ısıtılmış ısıl döngüce 70 santigrat dereceye aktarın ve iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü buza aktarın.Ayrı bir tüp karışımı 5X iki mikro litre, ipliktampon, 12.5 milimoler DNTP 5 mikro litre, 100 milimolar DTT bir mikro litre, R-N-A inhibitörü bir mikro litre, ve ters transkriptaz bir mikro litre. Adaptör e bu karışımın beş mikrolitre siperratör ligated RNA ekleyin ve bir saat boyunca kuluçka için 50 santigrat derece önceden ısıtılmış olan termal döngücün aktarın. Bir saat sonra adaptör hemen buz için ücretsiz DNA ligated transfer.Ayrı bir tüpte, 25 mikrolitre PCR karışımı, iki mikro litre RNA PCR astar, iki mikro litre RNA PCR astar indeksi ve 8,5 mikrolitre RNA'nın serbest suyunu karıştırın. Adaptör ligated CDNA 12,5 mikrolitre bu karışımın 37,5 mikrolitre ekleyin. Tüpü önceden ısıtılmış olan termal döngüye aktarın.Termal çevrimciyi üreticiprotokolünde önerildiği gibi döngü numarası 15 olarak değiştirildiğinde programla. Tamamlandıktan sonra, numuneyi dört derece santigrat derecede tutun. İleride kullanmak için eksi 80 santigrat derece de devam edin veya saklayın.Ligated ücretsiz DNA arındırmak için, her ücretsiz DNA örneği için DNA yükleme boya on mikrolitre ekleyin. Ve yüksek çözünürlüklü ikinci ve özel RNA ikinci on mikrolitre. Her numunenin 30 mikrolitresini birbirine bitişik iki ayrı şeritte yüzde altı TBE Poliakrilamid jelde çalıştırın.Özel RNA ikinci ve yüksek çözünürlüklü ikinci ile, iki farklı örnek arasındaki ara boşluk. Yaklaşık 30 ila 40 dakika boyunca 145 volt bir X TBE tampon jel çalıştırın. Yükleme boyasının alt mavi ön kısmını takip edin.Jelin dibine yaklaştığında elektroforezi durdurun. Milimetre ethidium bromür başına 5 mikrogram ile bir X TBE tampon jel aktarın. Jeli bir transilluminator'da görselleştirin ve adaptör dimer ile kontaminasyonu önlemek için jeli tam olarak 145 baz çifti ve 160 baz çifti belirteçleri arasında ve 145 baz çifti belirteci arasında kesin olarak kesin olarak kesin.Adaptör dimerleri istenilen markaya çok yenik sayılsa da jelin tam olarak kesilmesiyle yapılan saflaştırma ligatlı CDNA'dır. Jel parçalarını iki milimetrelik toplama tüplerinde tutulan DNA kırma tüplerine aktarın. İki dakika boyunca 20 bin kez G'de dön.Ve rNase içermeyen su üç yüz mikro litre ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede bir rocker üzerinde yavaşça döndürmek için izin. Ertesi gün DNA çökeltisi gerçekleştirmek için tüpün içeriğini 5 mikron filtre tüpüne aktarın. 600 kez G'yi 10 saniye boyunca döndürün.Sonra üç molar sodyum asetat glikojen otuz mikrolitre iki mikrolitre ekleyin, 1X pelet boya, ve 975 mikrolitre 100 yüzde etanol eluted DNA. 17,000 kez G'de 4 santigrat derecede 20 dakika dön. Supernatant atın ve pelet yıkamak için yüzde 75 etanol ekleyin.17.000 g dört derece santigrat beş dakika döndükten sonra supernatant atın ve bir termal blok üzerinde 37 santigrat derece tüpler inkübün tamamen etanol buharlaşır. Ph 8.5'te 10 milimoler trikte klorür 12 mikrolitre ile pelet askıya alın. Daha sonra saflaştırılmış ve ücretsiz DNA'yı on kez seyrelterek ve bir biyoanalizörüzerinde çalıştırmak için seyreltilmiş CDNA'nın bir mikrolitresini kullanarak kütüphane kalite kontrolü yapın.Ücretsiz DNA ürün boyutunun elektroperogramdaki küçük RNA'nın 136 ile 160 baz çifti arasındaki aralığına karşılık gelen denemin. Her örnek için toplam azı lılığını hesaplayın. PH 8.5'teki tris hidroklorür kullanarak her numuneyi 2 nanomolara normalleştirin.Kütüphaneleri, her iki nanomolar numunenin eşit hacimlerini tek bir iki yüz mikrolitrelik PCR tüpte karıştırarak tutun. Detabiat ve sıra, el yazmasında açıklandığı gibi adımları takip eder. Bu çalışmada kütüphane RNA izolasyonu sonrası hazırlanarak kalite kontrolü yapılmıştır.Adaptör ligated mikro Rnase için ürün boyutu her örnek için yaklaşık 136 ila 160 baz çiftleri karşılık gelir. Vurgulanan bölümler, küçük RNA hazırlık kütüphanesi için hassas bir şekilde uyarılmış jelin aralığını gösterir. Bu şekil, saflaştırılmış ücretsiz DNA kütüphanesi için jel elektroforez ve elektroferogramları göstermektedir.Mikro diseksiyonlu FFPE dokusu ve serum ev kaynaklı. Küçük bir RNA sıralama çalışmasından elde edilen temsili ölçümler, beklenen küme yoğunluğunu, Q skoru, küme geçme filtre yüzdesini ve mikro parçalanmış FFP dokusu ve serum dan elde edilen EV'ler için tahmini verim ve hata oranlarını gösterir. Her iki örnekteki Q skoru, temel çağrı doğruluğunun yüzde 99,9'unu gösteren üç değerin üzerinde bir değer gösterdi.Ve hata oranları nın hepsi birin altındaydı. Kütüphane hazırlığındaki her adım dikkatle yürütülmeli ve tüpler her kuluçkadan sonra hemen buza aktarılmalıdır. Protokoldeki kritik bir adım, adaptör dimer ücretsiz ve saf CDNA kitaplığı olduğundan emin olmak için jeli tam olarak kesmektir.CDNA kitaplığı oluşturmak, yüksek kaliteli sıralama çalışması için optimizasyon gerektirir. Bu protokolü anlamak, izleyicilerin bu dakika ayrıntılarını sınırlı kaynak örneklerinden diğer sıralama kitaplık preprasyonuna ekstrapolating de yardımcı olacaktır serum ve hücre dışı veziküller öneririz. Bu teknik, metastatik prostat kanseri hastalarında tümörat agresifliği ve tedavi direnci ile ilişkili yeni mikronazın belirlenmesinde bize yardımcı olmuştur.Bu teknikler Roman biyomarker keşfiyardımcı olabilir diğer hastalık tipleri için tahmin edilebilir. Bu teknik, striation derived serum ve doku örnekleri gibi biyolojik malzemeler kullandığından, gerekli önlemler alınmalıdır. Ayrıca, ethidyum bromür bilinen bir karsinojendir ve bu protokol kullanılarak çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

22C 3 kullanarak Anti-PD-L1 antikor konsantre biyopsi ve küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda sitoloji örnekleri

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA Dizilimi için Üç Diferansiyel İfade Analizi Yöntemi: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...