Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship naar R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant Number 100090/12/Z). De Funder had geen rol in het studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript. We danken Ashok Venkitaraman en Paul French voor kritisch advies en begeleiding bij het project. We danken Chiara Cossetti en Gabriela Grondys-Kotarba in het Cambridge Institute for Medical Research flow Cytometry faciliteit voor uitstekende ondersteuning. We danken Liam Cassiday, Thomas Miller, en Gianmarco Contino voor het naleden van het manuscript.

1. differentiële fluorescerende Celetikettering
<ol><li>Gentagging met CRISPR Cas9<ol>
<li>Gebruik CRISPR Cas9 genoom Editing te labelen rootletin (of andere genen van belang) met de fluorescerende eiwitten meGFP of mScarlet-I in menselijke kanker cellijnen. Opmerking: Gedetailleerde protocollen voor genoom bewerking worden elders behandeld24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluorescerende kleurstof etiketter...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

We demonstreren een faciele en kosteneffectieve protocol voor het fusing cellen en visualiseren van de daaropvolgende architectuur van celhybriden met microscopie, het nemen van ongeveer twee dagen van start tot finish. Kritieke delen van dit protocol zijn de verrijking van gesmolten cellen door celsortering (protocol sectie 3), en zorgvuldige validatie van gesmolten cellen door microscopie (protocol sectie 4). Deze secties zorgen ervoor dat gesmolten cellen gemakkelijk worden verkregen en bonafide heterokaryonen zijn. C...

Homeostatisch onderhoud van cellulaire structuur is essentieel voor het leven. Cellen hebben karakteristieke morfologieën, sub-cellulaire organel getallen, en interne biochemische samenstelling. Inzicht in hoe deze fundamentele eigenschappen worden gegenereerd en hoe ze gaan mis tijdens de ziekte vereist laboratorium gereedschap om hen te perturb.
Celfusie is het samenvoegen van twee of meer afzonderlijke cellen. Celfusie kan cruciaal zijn geweest voor de opkomst van eukaryotische leven1. In het menselijk lichaam is celfusie relatief zeldzaam, die optreedt tijdens beperkte ontwikkelingsomstandigheden en weefsel typen, zoals tijdens de bevruchting of de vorming van spieren, botten en de placenta2. Dit protocol beschrijft de inductie van celcelfusie in weefselkweek cellijnen met differentieel fluorescently gelabelde organellen, als een instrument om de mechanismen te begrijpen die de celstructuur en-functie beheersen.
In vitro geïnduceerde celcelfusie staat centraal in de productie van monoklonale antilichamen3, een belangrijk hulpmiddel voor biologisch onderzoek en ziekte behandeling. Cell Fusion is ook gebruikt om te vragen veel verschillende fundamentele cel biologische vragen over celcyclus dominantie4, aneuploïdie5,6, cellulaire herprogrammering7,8, de reparatie van beschadigde neuronen9, virale proliferatie10, apoptosis11, tumorvorming12, cytoskelet Dynamics13, en membraan fusie14,15. Laboratorium gebaseerde methoden voor het opwekken van celcelfusie16,17,18,19 induceren lipide membraan coalescentie door de fysieke samenvoeging van twee bilayers in één. Celfusie kan worden geïnduceerd door elektriciteit18, virale gebaseerdemethoden 17, thermsmonic verwarming20, transgen expressie19, en chemicaliën met inbegrip van polyethyleenglycol (PEG)16,21,22.
Centrosomes zijn microtubulus organiserende centra die cellulaire vorm, beweeglijkheid, polarisatie en divisie23beheersen. Centrosomale wortels zijn vezelachtige structuren die zich uitstrekken van nucleotiderende met het eiwit rootletin24 (gecodeerd door het gen crocc). We hebben onlangs gebruikt cel-cel fusie om te begrijpen hoe centrosoom positie en het aantal varieert binnen heterokaryons ten opzichte van ouderlijke cellen24. De beweegreden achter het gebruik van deze methode is om de cel van oorsprong van wortels binnen een heterokaryon te volgen na fusie van differentieel fluorescendig gelabelde ouderlijke cellen, en dus voorbeeld organel fusie en splijting. De fluorescently gelabelde eiwitten rootletin-meGFP of rootletin-mScarlet-ik zijn gemaakt door genoom Editing in afzonderlijke cellijnen die vervolgens worden gesmolten door PEG-gemedieerde celfusie. We beschrijven het gebruik van celkleurstoffen (tabel met materialen) om gesmolten cellen te identificeren door Flowcytometrie en daaropvolgende fluorescentiemicroscopie-identificatie van centroeen cel van oorsprong en morfologie (Figuur 1). Deze aanpak is een robuuste en unieke methode om te bestuderen hoe belangrijke veranderingen in cellulaire toestand, met inbegrip van organel nummer afbreuk aan op cel homeostase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

Het leven is ruimtelijk gepartitioneerd binnen lipide membranen om de geïsoleerde vorming van verschillende moleculaire toestanden binnen cellen en organellen mogelijk te maken. Celfusie is de fusie van twee of meer cellen om een enkele cel te vormen. Hier bieden we een protocol voor celfusie van twee verschillende celtypen. Gesmolten hybride cellen worden verrijkt door flow cytometrie-gebaseerde sortering, gevolgd door fluorescentiemicroscopie van hybride celstructuur en-functie. Fluorescerend gelabelde eiwitten gegenereerd door genoom bewerking worden in gesmolten cellen afgebeeld, waardoor cellulaire structuren kunnen worden geïdentificeerd op basis van fluorescentie emissie en waarnaar wordt verwezen terug naar het celtype van oorsprong. Deze robuuste en algemene methode kan worden toegepast op verschillende celtypen of organellen van belang, om de cellulaire structuur en functie over een scala van fundamentele biologische vragen te begrijpen.

Correct gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens de stromings cytometrie door een fluorescentie signaal dat hoger is dan de niet-gelabelde controle cellen (Figuur 2A). Gates zijn ingesteld voor het sorteren van dubbele positieve cellen, die deze populatie rechtstreeks verrijken in beeldvormings gerechten voor verdere microscopische analyses. Gesmolten cellen zijn detecteerbaar als verschillende dubbele fluorescentienpositieve cellen en vormen ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Het doel van dit protocol is om twee verschillende celtypen te fuseren om hybride cellen te maken. Fluorescentiemicroscopie analyse van gesmolten cellen wordt gebruikt om de cel van oorsprong van cellulaire organellen te volgen. Deze test kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe cellulaire structuur en functie reageren op perturbatie door celfusie.

Celcelfusie van genoom bewerkte cellijnen voor Perturbatie van cellulaire structuur en functie

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Met deze methode kunnen cellulaire structuur en functie worden verstoord door de fusie van twee verschillende celtypen om vragen aan te pakken, zoals hoe cellen reageren op veranderingen in organellenummer. Door fluorescerende getagde eiwitten in gesmolten cellen te beelden, kunnen cellulaire structuren worden terugverwijzing naar hun celtype van oorsprong om de mechanismen van organelle homeostase en functie te bestuderen. Voor fluorescerende kleurstof etikettering, zie de menselijke kankercel populaties van belang zodanig dat elke cultuur zal zijn uitgebreid tot ten minste zes keer 10 tot de zesde cellen op een 70 tot 90%samenvloeiing door de volgende ochtend.Was op de dag van het etiketteren de rootletine eGFP- en rootletin-mScarletcellen twee keer met 10 milliliter PBS per wasbeurt. Verdun violette celkleurstof tot 500 nanomolar in PBS en Far Red cell dye tot 200 nanomolar in PBS. Label de rootletine eGFP-cellen met de verdunde Violet-celkleurstof en de rootletine-mScarletcellen met de verdunde Far Red-celkleurstof gedurende één minuut bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubaties, stop de reacties met 10 milliliter DMEM gedurende vijf minuten. Was beide gelabelde celculturen en een niet-gelabelde ouderlijke celcultuur met 10 milliliter verse PBS voordat alle culturen worden uitbroeden met één milliliter voorverwarmde trypsine. Breng aan het einde van de incubatie de losgemaakte celoplossingen over op afzonderlijke conische buizen van 15 milliliter voor centrifugatie en zet de kleurstof met het label pellets voorzichtig opnieuw op in één milliliter PBS en de niet-gelabelde cellen in één milliliter DMEM.Breng dan alle celmonsters terug naar de celkweek incubator. Voor celfusie experiment, meng 500 microliter van Violet kleurstof gelabeld cellen met 500 microliters van Far Red kleurstof gelabeld cellen in een nieuwe 15 milliliter buis en sediment de resterende ongemengde gelabelde cellen door centrifugatie. Resuspend de pellets in een milliliter verse DMEM en plaats de cellen terug in de couveuse.Verzamel de gemengde cellen door centrifugatie en voeg 700 microliters van 50%1450 PEG op een druppelwijze aan de pellet over een periode van 30 seconden. Voeg na 3,5 minuten bij kamertemperatuur 10 milliliter serumvrije DMEM drop-wise toe over een periode van 30 seconden en plaats de buizen gedurende 10 minuten in de couveuse. Aan het einde van de incubatie, sediment de gemengde cellen door centrifugatie en voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter van volledig medium.Om te verrijken voor de gesmolten celpopulatie door FACS, filter je voorzichtig alle cellen in individuele FACS-buizen door een 70 micrometerzeef en creëer je voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing en dubbeltdiscriminatiepercelen in de cytometersoftware. Voer de niet-gelabelde cellen uit om hun fluorescentieintensiteit op te nemen en poorten te maken om de gesmolten cellen te identificeren. Voer vervolgens de enkele positieve Violet kleurstof gelabeld cellen om te bevestigen dat er geen spillover van Violet signaal in de Far Red kanaal en de enkele positieve Far Red kleurstof gelabeld cellen om te bevestigen dat er geen Far Red signaal in het Violet kanaal.Voer vervolgens kort het fusiemonster uit om te bevestigen dat de gesmolten cellen zichtbaar zijn met deze poorten. Wanneer de sorteerparameters zijn ingesteld, lijnt u de sorteerstroom centraal uit in een acht-goed beeldvormingsschotel met 100 microliters groeimedium en sorteer de dubbele positieve gesmolten cellen rechtstreeks in de schotel. Wanneer alle cellen zijn gesorteerd, plaats het gerecht onmiddellijk in de celkweek incubator voor twee tot 16 uur.Voor immunofluorescente kleuring, eerst vervangen van de celcultuur supernatant met 200 microliters van 4%paraformaldehyde voor een 15-minuten incubatie bij kamertemperatuur. Aan het einde van de fixatie, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS per wasbeurt voordat u de cellen permeabiliseert in 200 microliters van 0,1% nonionische oppervlakteactieve stoffen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer vervolgens de niet-specifieke binding met 200 microliters van 3%bovine serum albumine in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door etikettering met de antilichamen van belang in 150 microliters van kleuringsbuffer.Na een uur bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in 300 microliter pbs gedurende vijf minuten per wasbeurt. Vervang na de laatste wasbeurt de was met 200 microliter verse PBS. Om beelden van de gesmolten cellen te verwerven, gebruik een geschikte fluorescentiemicroscoop die in staat is vier-kleur beeldvorming en het verzamelen van driedimensionale beelden.De aangewezen gelabelde cellen zijn zichtbaar tijdens stroomcytometrie door fluorescerend signaal op een hoger niveau dan niet-gelabelde controlecellen. De poorten kunnen worden ingesteld voor het sorteren te verrijken voor de dubbele positieve celpopulatie direct in beeldvorming schotels voor verdere microscopische analyse. Fusie induceert een grote herschikking van de cellulaire architectuur door het mengen van twee cellen in één.Heterokaryons worden geïdentificeerd als cellen die beide fluorescerende kleurstof signalen gemengd in een enkele cel zonder tussenliggende plasmamembranen. Bovendien kunnen twee kernen ook zichtbaar zijn in gesmolten cellen door Brightfield imaging. De celstructuur en functie kunnen verder worden onderzocht door het samenvoegen van cellen met meGFP en mScarlet gelabelde eiwitten.Fusie resulteert in een verdubbeling van het centrosome aantal binnen heterokaryons zichtbaar als ten minste vier pericentriolar materiaal foci wanneer de centrosome pericentriolar component NEDD1 fluorescerend wordt getagd. De fusie van cellen met endogene fluorescerend getagd rootletine maakt het mogelijk de cel van oorsprong van elk centrosome te identificeren in een heterokaryon. Dit protocol laat zien hoe differentieel gelabelde cellijnen kunnen worden samengefuseerd en hoe ze hun organellen kunnen beeld geven om hun structuur en functie te begrijpen.Dit robuuste protocol is zowel relatief eenvoudig als relatief goedkoop uit te voeren in vergelijking met vergelijkbare methoden. Deze techniek kan worden gebruikt om een reeks vragen te stellen, zoals hoe organelle fusie geregeld is en hoe de cellen reageren op veranderingen in subcellulair organellenummer.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...