Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
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Ce travail a été financé par une bourse Wellcome Trust Henry Wellcome à R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numéro 100090/12/Z). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Ashok Venkitaraman et Paul Français pour les conseils et les conseils essentiels sur le projet. Nous remercions Chiara Cossetti et Gabriela Grondys-Kotarba du Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry pour leur excellent soutien. Nous remercions Liam Cassiday, Thomas Miller et Gianmarco Contino d'avoir relu le manuscrit.

1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes
<ol><li>Marquage génétique avec CRISPR Cas9<ol>
<li>Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines. REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l'édition du génome sont couverts ailleurs24,25,26</s...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. 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M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l'architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l'enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s'assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et son...

L'entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d'organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.
La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l'émergence de la vie eucaryote1. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendant les circonstances de développement restreintes et les types de tissu, tels que pendant la fécondation ou la formation du muscle, de l'os et du placenta2. Ce protocole décrit l'induction de la fusion cellule-cellule dans les lignées cellulaires de culture de tissu avec les organites fluorescents différentiellement, comme outil pour comprendre les mécanismes contrôlant la structure et la fonction de cellules.
La fusion cellulaire induite in vitro est au cœur de la production d'anticorps monoclonaux3, un outil important pour la recherche biologique et le traitement des maladies. La fusion cellulaire a également été utilisée pour poser de nombreuses questions biologiques fondamentales différentes sur la dominance du cycle cellulaire4, aneuploidy5,6, reprogrammation cellulaire7,8, la réparation des neurones endommagés9, prolifération virale10, apoptose11, tumorigenesis12, dynamique cytosquelettique13, et fusion membranaire14,15. Méthodes basées en laboratoire pour induire la fusion cellule-cellule16,17,18,19 induire la coalescence de membrane lipidique par la fusion physique de deux bicouches en un seul. La fusion cellulaire peut être induite par l'électricité18, les méthodes virales17, chauffage thermoplasmonique20, expression transgène19, et les produits chimiques, y compris le polyéthylène glycol (PEG)16,21,22.
Les centrosomes sont des centres d'organisation de microtubules contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la polarisation, et la division23. Les racines centrosomal sont des structures fibreuses s'étendant des centrosomes contenant la racine de protéine24 (encodée par le gène CROCC). Nous avons récemment utilisé la fusion cellule-cellule pour comprendre comment la position centrosome et le nombre varie à l'intérieur des hétérodaryons par rapport aux cellules parentales24. La raison d'être de cette méthode est de suivre la cellule d'origine des racines dans un hétérookaryon après la fusion de cellules parentales étiquetées différemment fluorescentes, et donc d'imager la fusion et la fission organelle. Les protéines fluorescentes taguées rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I sont créées par l'édition du génome dans des lignées cellulaires séparées qui sont ensuite fusionnées par la fusion cellulaire médiée par PEG. Nous décrivons l'utilisation de colorants cellulaires (Tableau des matériaux) pour identifier les cellules fusionnées par cytométrie d'écoulement et identification subséquente de microscopie de fluorescence de la cellule centrosome d'origine et de la morphologie (figure 1). Cette approche est une méthode robuste et unique pour étudier comment les changements majeurs dans l'état cellulaire, y compris le nombre d'organelles empiéter sur l'homéostasie cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d'états moléculaires distincts à l'intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l'édition du génome sont représentées à l'intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d'identifier les structures cellulaires en fonction de l'émission de fluorescence et de les référencer au type d'origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d'intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.

Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d'écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d'imagerie pour d'autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à dou...

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Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L'analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d'origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Cette méthode permet de perturber la structure et la fonction cellulaires par la fusion de deux types de cellules différents pour répondre à des questions telles que la façon dont les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles. En élisant les protéines étiquetées fluorescentes dans les cellules fusionnées, les structures cellulaires peuvent être référencées à leur type d’origine cellulaire pour étudier les mécanismes de l’homéostasie et de la fonction organelles. Pour l’étiquetage des colorants fluorescents, voir les populations de cellules cancéreuses humaines d’intérêt de telle sorte que chaque culture aura augmenté à au moins six fois 10 à la sixième cellule à une confluence de 70 à 90% d’ici le lendemain matin.Le jour de l’étiquetage, laver deux fois les cellules de rootletine eGFP et de rootletin-mScarlet avec 10 millilitres de PBS par lavage. Diluer le colorant violet à 500 nanomolaires dans le colorant PBS et Far Red cell à 200 nanomolar dans PBS. Étiquetez les cellules eGFP de rootletin avec le colorant dilué de cellules violettes et les cellules de rootletin-mScarlet avec le colorant dilué de globule rouge lointain pendant une minute à la température ambiante.À la fin des incubations, arrêter les réactions avec 10 millilitres de DMEM pendant cinq minutes. Lavez les deux cultures cellulaires étiquetées et une culture cellulaire parentale non étiquetée avec 10 millilitres de PBS frais avant d’incuber toutes les cultures avec un millilitre de trypsine préchaurée. À la fin de l’incubation, transférer les solutions cellulaires détachées dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres pour centrifugation et résusuer doucement les granulés étiquetés de teinture dans un millilitre de PBS et les cellules non étiquetées dans un millilitre de DMEM.Retournez ensuite tous les échantillons de cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Pour l’expérience de fusion cellulaire, mélanger 500 microlitres de colorant violet étiquetés cellules avec 500 microlitres de colorants far red étiquetés cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres et sédimenter les cellules non mélangées restantes étiquetées par centrifugation. Resuspendez les granulés dans un millilitre de DMEM frais et placez les cellules dans l’incubateur.Recueillir les cellules mélangées par centrifugation et ajouter 700 microlitres de 50%1450 PEG d’une manière drop-wise à la pastille sur une période de 30 secondes. Après 3,5 minutes à température ambiante, ajouter 10 millilitres de DMEM sans sérum sur une période de 30 secondes et placer les tubes dans l’incubateur pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, sédimenter les cellules mélangées par centrifugation et resuspendre doucement la pastille en un millilitre de milieu complet.Pour enrichir pour la population cellulaire fusionnée par FACS, filtrez doucement toutes les cellules dans des tubes FACS individuels à travers une passoire de 70 micromètres et créez des diagrammes de dispersion vers l’avant par rapport à la dispersion latérale et à la discrimination des doublets dans le logiciel de cytomètre. Exécutez les cellules non étiquetées pour enregistrer leur intensité de fluorescence et créer des barrières pour identifier les cellules fusionnées. Ensuite, exécutez les cellules étiquetées de colorant violet positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de débordement du signal violet dans le canal rouge lointain et les cellules étiquetées de colorant far red positif unique pour confirmer qu’il n’y a pas de signal rouge lointain dans le canal violet.Ensuite, exécutez brièvement l’échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec ces portes. Lorsque les paramètres de tri ont été définis, alignez le flux de tri centralement dans un plat d’imagerie de huit puits contenant 100 microlitres de milieu de croissance et triez les cellules fusionnées doublement positives directement dans le plat. Lorsque toutes les cellules ont été triées, placez immédiatement le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à 16 heures.Pour la coloration immunofluorescente, remplacez d’abord le supernatant de culture cellulaire par 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde pour une incubation de 15 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, laver les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS par lavage avant de perméabiliser les cellules dans 200 microlitres de 0,1% de surfactant non ionique pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique avec 200 microlitres d’albumine de sérum 3% bovin dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de l’étiquetage avec les anticorps d’intérêt dans 150 microlitres de tampon de coloration.Après une heure à température ambiante, laver les cellules deux fois dans 300 microlitres de PBS pendant cinq minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacer le lavage par 200 microlitres de PBS frais. Pour obtenir des images des cellules fusionnées, utilisez un microscope à fluorescence approprié capable d’imagerie en quatre couleurs et de recueillir des images tridimensionnelles.Les cellules dûment étiquetées sont visibles pendant la cytométrie du flux par signal fluorescent à un niveau plus élevé que les cellules de contrôle non étiquetées. Les portes peuvent être fixées pour le tri à enrichir pour la population de cellules double positif directement dans les plats d’imagerie pour une analyse microscopique plus approfondie. La fusion induit un réarrangement majeur de l’architecture cellulaire par le mélange de deux cellules en une seule.Les heterokaryons sont identifiés comme des cellules contenant les deux signaux fluorescents de colorant mélangés à l’intérieur d’une seule cellule sans intervenir dans les membranes plasmatiques. En outre, deux noyaux peuvent également être visibles dans les cellules fusionnées par imagerie Brightfield. La structure et la fonction cellulaires peuvent faire l’objet d’études plus approfondies grâce à la fusion de cellules contenant des protéines étiquetées meGFP et mScarlet.La fusion entraîne un doublement du nombre centrosome à l’intérieur des heterokaryons visibles comme au moins quatre foyers matériels péricentriolaires lorsque le composant péricentriolaire centrosome NEDD1 est étiqueté fluorescentement. La fusion des cellules avec de la rootlétine taguée de façon endogène permet d’identifier la cellule d’origine de chaque centrosome dans un hétérokaryon. Ce protocole montre comment fusionner les lignées cellulaires étiquetées différemment et comment imager leurs organites pour comprendre leur structure et leur fonction.Ce protocole robuste est à la fois relativement facile et relativement peu coûteux à exécuter par rapport à des méthodes similaires. Cette technique peut être utilisée pour poser une série de questions telles que la façon dont la fusion organelle est réglementée et comment les cellules réagissent aux changements dans le nombre d’organelles subcellulaires.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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