Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי ברוכים העקב חומרי גלם באמון מחבר הנרי ברוכים המספרים (https://wellcome.ac.uk/grant מספר 100090/12/Z). לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אנו מודים לאשוק ולפול פרנץ ' לייעוץ ביקורתי ולהדרכה על הפרויקט. אנו מודים לקיארה וגבריאלה Grondys-Kotarba במכון קיימברידג ' לזרימת המחקר הרפואי מתקן Cy, לתמיכה מעולה. , אנו מודים לליאם קסידיי, תומס מילר. וג'אנמרקו קונארו על הגהה של כתב היד

1. תא פלורסנט משלים התיוג
<ol><li>התיוג הגנטי עם Cas9<ol>
<li>השתמש ב-CRISPR Cas9 הגנום עריכה לתייג שורטלטין (או גנים אחרים של עניין) עם חלבונים פלורסנט meGFP או mScarlet-I בתאי הסרטן האנושי. הערה: פרוטוקולים מפורטים עבור עריכת הגנום מכוסים במקום אחר24,25,...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

אנו מדגימים נתיישב ופרוטוקול חסכוני עבור תאים פיוזינג ומדמיין את הארכיטקטורה הבאה של תאים היברידיות עם מיקרוסקופ, לוקח בערך יומיים מתחילתו ועד סופו. חלקים קריטיים של פרוטוקול זה הם העשרת התאים המוחלקים על-ידי מיון התאים (מקטע פרוטוקול 3) ואימות קפדני של תאים מוחלקים באמצעות מיקרוסקופ (פרו...

הומסטטי תחזוקה של מבנה הסלולר הוא קריטי לחיים. לתאים יש מורפולוגיות אופייניות, מספרי משנה-תאית וקומפוזיציה ביוכימית פנימית. הבנת האופן שבו מאפיינים בסיסיים אלה נוצרים וכיצד הם משתבש במהלך המחלה מחייב כלי מעבדה כדי לperturb אותם.
Fusion תא הוא המיזוג בין שני תאים נפרדים או יותר. היתוך תא אולי היה קריטי הופעתה של חיים איקריוטית1. בגוף האדם, פיוז'ן התא הוא נדיר יחסית, המתרחשים בנסיבות התפתחותיות מוגבלות סוגי רקמות, כגון במהלך הפריה או היווצרות של שריר, עצם השליה2. פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של היתוך תא התא בקווי תרבות של רקמה עם שורות מפורטות בצורה מסודרת, ככלי להבנת המנגנונים השולטים במבנה התאים ובתפקוד.
בהשפעת מחוץ לגוף היתוך תא התא הוא מרכזי לייצור נוגדנים חד שבטיים3, כלי חשוב עבור מחקר ביולוגי וטיפול במחלות. הפיוז תא גם שימש כדי לשאול שאלות רבות שונות ביולוגית תא ביולוגי על מחזור התא הדומיננטיות4, אנאפלואידיה5,6, הסלולר מחדש7,8, תיקון של נוירונים פגומים9, ויראלי התפשטות10, אפופטוזיס11, tuמוריגנזה12, ציטושלד דינמיקה13, ו ממברנה פיוז'ן14,15. מעבדה מבוסס שיטות כדי לגרום היתוך תא תא16,17,18,19 לגרום לשומנים הממברנה ממברנה דרך המיזוג הפיזי של שני bilayers לתוך אחד. היתוך תא יכול להיגרם על ידי חשמל18, שיטות ויראלי מבוסס17, חימום תרמוטרמונית20, הביטוי הטרנסגנטי19, וכימיקלים כולל פוליאתילן גליקול (יתד)16,21,22.
הסנטזומים הם מרכזי ארגון השולטים בצורה התאית, בתנועתיות, בקיטוב ובחטיבה23. השורשים הסנטורזומוניים הם מבנים סיבי הארכת מ סנטרוזומים המכילים את החלבון שורטלטין24 (מקודד על ידי הגנים crocc). השתמשנו לאחרונה היתוך תא התא כדי להבין כיצד centrosome מיקום ומספר משתנה בתוך heterokaryons יחסית לתאי הורים24. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו היא לעקוב אחר התא של המקור של שורשים בתוך הטרולויון לאחר היתוך של מתויג באופן שולי בתאי הורים מסומנים, ובכך היתוך אורגונל התמונה ביקוע. הפלואור מתויג בעזרת חלבונים שרוסטין-ממגה או שורטלטין-mScarlet-I נוצר על ידי עריכת הגנום בקווים נפרדים תאים אשר התמזגו אז על ידי היתוך תא יתד בתיווך. אנו מתארים את השימוש בצבעי תאים (טבלה של חומרים) כדי לזהות תאים התמזגו על ידי זרימה cy, ולאחר מכן זיהוי המיקרוסקופיה של מיקרוסקופ של תא של מקור ומורפולוגיה (איור 1). גישה זו היא שיטה איתנה וייחודית ללמוד כיצד השינויים העיקריים במצב הסלולר, כולל מספר ארגונית המגלגל על הומאוסטזיס התאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

החיים מחולק למחיצות בתוך קרום השומנים כדי לאפשר היווצרות מבודדת של מצבים מולקולריים ברורים בתוך תאים ואורגלים. Fusion תא הוא מיזוג של שני תאים או יותר כדי ליצור תא בודד. כאן אנו מספקים פרוטוקול למיזוג תאים של שני סוגי תאים שונים. תאים היברידית התמזגו מועשרים על ידי מיון cy, מבוססי הזרמת הזרם, ואחריו מיקרוסקופ פלואורסצנטית של מבנה תאים היברידית ותפקוד. פלואור שתייגת חלבונים שנוצרו על ידי עריכת הגנום הם התמונה בתוך תאים התמזגו, המאפשר מבנים סלולריים להיות מזוהה מבוסס על פליטת הזריחה והפניה בחזרה לסוג התא של המקור. השיטה האיתנה והכללית יכולה להיות מוחלת על סוגי תאים שונים או על-ידי אורגלים של עניין, להבין את המבנה התאי והתפקוד על-פני מגוון של שאלות ביולוגיות בסיסיות.

תאים מסומנים כראוי גלויים במהלך הזרימה cy, לנסות על ידי אות פלואורסצנטית גבוה יותר מאשר בתאי בקרה בלתי מסומן (איור 2א). גייטס מוגדר למיון תאים חיוביים כפולים, העשרת האוכלוסייה הזאת ישירות לתוך מנות הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. תאים התמזגו הם לזיה?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function at JoVE.com

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

מטרת פרוטוקול זה היא לנתיך שני סוגי תאים שונים כדי ליצור תאים היברידיים. ניתוח מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית של תאים התמזגו משמש כדי לעקוב אחר התא של המקור של אורגלים הסלולר. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לחקור כיצד המבנה התאי והפונקציה מגיבים להפרעות באיחוי התאים.

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

שיטה זו מאפשרת לטרטר מבנה ותפקוד תאיים באמצעות היתוך של שני סוגי תאים שונים כדי לענות על שאלות כגון כיצד תאים מגיבים לשינויים במספר organelle. על ידי הדמיה פלואורסצנטי מתויג חלבונים בתוך תאים מותכים, מבנים הסלולר ניתן להפנות בחזרה לסוג התא שלהם של מקור ללמוד את המנגנונים של הונוסטזיס organelle ותפקוד. עבור תיוג צבע פלואורסצנטי, ראה את אוכלוסיות התאים הסרטניים האנושיים של עניין כך שכל תרבות תתרחב לפחות שש פעמים 10 לתאים השישיים ב 70 עד 90% confluency עד למחרת בבוקר.ביום התיוג, לשטוף את השורש eGFP ותאי rootletin-mScarlet פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לדלל צבע תא סגול ל 500 nanomolar ב PBS וצבע תא אדום רחוק ל 200 nanomolar ב PBS. סמן את תאי השורש eGFP בצבע התא הסגול המדולל ותאי השורש-mScarlet עם צבע התא האדום הרחוק המדולל למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לעצור את התגובות עם 10 מיליליטר של DMEM במשך חמש דקות. לשטוף הן תרבות תאים שכותרתו ותרבות תאים הורית אחת ללא תווית עם 10 מיליליטר של PBS טרי לפני הדגירה כל התרבויות עם מיליליטר אחד של טריפסין טרום המלחמה. בסוף הדגירה, להעביר את פתרונות התא מנותק צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה בעדינות resuspend כדורי צבע שכותרתו במיליליטר אחד של PBS ואת התאים ללא תווית במיליליטר אחד של DMEM.ואז להחזיר את כל דגימות התאים לאינקובטור תרבות התא. לניסוי היתוך תאים, מערבבים 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע ויולט עם 500 מיקרוליטרים של תאים מסומנים בצבע אדום רחוק בצינור חדש של 15 מיליליטר ומשמידים את התאים הנותרים שאינם מתויגים על ידי צנטריפוגה. תן שוב את הכדורים במיליליטר אחד של DMEM טרי והחזר את התאים לאנקובטור.לאסוף את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 700 microliters של 50%1450 PEG באופן טיפה חכם לכדור על פני תקופה של 30 שניות. לאחר 3.5 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM נטול סרום לאורך תקופה של 30 שניות והמקמו את הצינורות באינקובטור למשך 10 דקות. בסוף הדגירה, מסיסים את התאים המעורבים על ידי צנטריפוגה ומערבבים בעדינות את גלולת במיליליטר אחד של מדיום שלם.כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים התמזגו על ידי FACS, בעדינות לסנן את כל התאים לתוך צינורות FACS בודדים דרך מסננת 70 מיקרומטר וליצור פיזור קדימה לעומת פיזור צד להכפיל חלקות אפליה בתוכנת ציטומטר. הפעל את התאים ללא תריס כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם וליצור שערים כדי לזהות את התאים התמזגו. לאחר מכן, הפעל את הצבע ויולט חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין זליגה של אות ויולט לתוך הערוץ האדום הרחוק ואת צבע אדום רחוק חיובי יחיד שכותרתו תאים כדי לאשר כי אין אות אדום רחוק בערוץ ויולט.לאחר מכן הפעל בקצרה את דגימת ההיתוך כדי לאשר כי התאים התמזגו גלויים עם שערים אלה. כאשר פרמטרי המיון נקבעו, יש ליישר את זרם המיון באופן מרכזי לתוך צלחת הדמיה בת שמונה בארות המכילה 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה ומיין את התאים המותכים החיוביים הכפולים ישירות לתוך המנה. כאשר כל התאים כבר ממוינים, מיד למקם את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך שעתיים עד 16 שעות.עבור כתמים immunofluorescent, תחילה להחליף את תרבות התא על טבעי עם 200 microliters של 4% paraformaldehyde עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף לפני permeabilizing התאים ב 200 microliters של 0.1% פעילי שטח לא יוני במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חסום את הכריכה הלא ספציפית עם 200 מיקרוליטרים של אלבומין סרום 3%bovine ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו תיוג עם נוגדנים בעלי עניין ב-150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים.לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים 300 microliters של PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, החלף את הכביסה עם 200 microliters של PBS טרי. כדי לרכוש תמונות של התאים המותכים, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים המסוגל לבצע הדמיה של ארבעה צבעים ולאסוף תמונות תלת מימדיות.תאים המסומן כראוי גלויים במהלך ציטומטריית זרימה על ידי אות פלואורסצנטי ברמה גבוהה יותר מאשר תאי בקרה ללא תווית. ניתן להגדיר את השערים למיון כדי להעשיר עבור אוכלוסיית התאים החיוביים הכפולים ישירות לתוך כלי הדמיה לניתוח מיקרוסקופי נוסף. היתוך גורם לסידור מחדש גדול של הארכיטקטורה התאית באמצעות ערבוב של שני תאים לאחד.הטרוקריונים מזוהים כתאים המכילים את שני אותות הצבע הפלואורסצנטיים המעורבים בתוך תא אחד מבלי להתערב במברנות פלזמה. בנוסף, שני גרעינים עשויים להיות גלויים גם בתאים מותכים על ידי הדמיה ברייטפילד. מבנה התא ותפקודו עשויים להיחקר עוד יותר באמצעות מיזוג של תאים המכילים meGFP וחלבונים מתויגים mScarlet.היתוך גורם להכפלה של מספר centrosome בתוך הטרוקריונים גלוי לפחות ארבעה foci חומר קרום המוח כאשר המרכיב pericentriolar centrosome NEDD1 מתויג באופן פלואורסצנטי. היתוך של תאים עם שורש מתויג אנדוגני פלואורסצנטי מאפשר לתא המקור של כל centrosome להיות מזוהה בהטרוקריון. פרוטוקול זה מדגים כיצד להתיך קווי תאים המסווים באופן דיפרנציאלי וכיצד לדמיין את האיברונים שלהם כדי להבין את המבנה והתפקוד שלהם.פרוטוקול חזק זה הוא גם קל יחסית וזול יחסית לביצוע בהשוואה לשיטות דומות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשאול מגוון של שאלות כגון איך היתוך organelle מוסדר וכיצד התאים מגיבים לשינויים במספר organelle subcellular.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...