Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato da una Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numero 100090/12/ s). Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Ashok Venkitaraman e Paul French per la consulenza critica e la guida sul progetto. Ringraziamo Chiara Cossetti e Gabriela Grondys-Kotarba presso lo stabilimento Cytometry del Cambridge Institute for Medical Research Flow per un eccellente supporto. Ringraziamo Liam Cassiday, Thomas Miller e Gianmarco Contino per aver revisionato il manoscritto.

1. Etichettatura differenziale delle cellule fluorescenti
<ol><li>Tagging genico con CRISPR Cas9<ol>
<li>Utilizzare l'editing del genoma di CRISPR Cas9 per taggare la radiceletina (o altri geni di interesse) con le proteine fluorescenti meGFP o mScarlet-I nelle linee cellulari del cancro umano. NOT:</</c1> I protocolli dettagliati per l'editing del genoma sono coperti altrove24,25,26.</li>
	</ol>
</li>
	<l...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. 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M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

Dimostriamo un protocollo facile ed economico per fondere le cellule e visualizzare la successiva architettura di ibridi cellulari con microscopia, impiegando circa due giorni dall'inizio alla fine. Le parti critiche di questo protocollo sono l'arricchimento delle cellule fuse mediante l'ordinamento delle cellule (sezione protocollo 3) e un'attenta convalida delle cellule fuse mediante microscopia (sezione protocollo 4). Queste sezioni assicurano che le cellule fuse siano facilmente ottenute e siano eteoka fideeeoni. Le ...

La manutenzione omeostatica della struttura cellulare è fondamentale per la vita. Le cellule hanno morfologie caratteristiche, numeri di orgelli subcellulari e composizione biochimica interna. Comprendere come vengono generate queste proprietà fondamentali e come vanno in stato di sfago durante la malattia richiede strumenti di laboratorio per perturbarli.
La fusione cellulare è la fusione di due o più celle separate. La fusione cellulare potrebbe essere stata fondamentale per l'emergere della vita eucarica1. Nel corpo umano, la fusione cellulare è relativamente rara, che si verifica durante circostanze di sviluppo e tipi di tessuto limitati, come durante la fecondazione o la formazione di muscoli, ossa e placenta2. Questo protocollo descrive l'induzione della fusione cellulare-cellula nelle linee cellulari di coltura dei tessuti con organelli etichettati in modo differenziale fluorescente, come strumento per comprendere i meccanismi che controllano la struttura e la funzione delle cellule.
La fusione cellulare-cellula indotta in vitro è fondamentale per la produzione di anticorpi monoclonali3,uno strumento importante per la ricerca biologica e il trattamento delle malattie. La fusione cellulare è stata utilizzata anche per porre molte diverse domande biologiche fondamentali delle cellule sulla dominanza del ciclo cellulare4, aneeuploidy5,6, riprogrammazione cellulare7,8, riparazione dei neuroni danneggiati9, proliferazione virale10, apoptosi11, tumorigenesi12, dinamiche citoscheletriche13e fusione della membrana14,15. Metodi basati su laboratorio per indurre la fusione cellulare-cellula16,17,18,19 indurre coalescenza della membrana lipidica attraverso la fusione fisica di due bistrati in uno. La fusione cellulare può essere indotta dall'elettricità18, dai metodi a base virale17, dal riscaldamento termoplascio20,dall'espressione transgenica19e da sostanze chimiche tra cui il glicole di polietilene (PEG)16,21,22.
I centrosori sono centri di organizzazione dei microtubuli che controllano la forma cellulare, la motilità, la polarizzazione e la divisione23. Le radici centrosomiche sono strutture fibrose che si estendono dai centrosomi contenenti la radice della proteina24 (codificata dal gene CROCC). Recentemente abbiamo usato la fusione cellulare-cellula per capire come la posizione e il numero del centrosome varialli all'interno degli etokaryon rispetto alle cellule parentali24. La logica alla base dell'uso di questo metodo è quella di tracciare la cellula di origine delle radici all'interno di un eterokaryon dopo la fusione di cellule parentali marcate in modo differenziale fluorescente, e quindi per immagini di fusione e fissione dell'organello. Le proteine fluorescenti etichettate rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I sono create dall'editing del genoma in linee cellulari separate che vengono poi fuse dalla fusione cellulare mediata da PEG. Descriviamo l'uso di coloranti cellulari (Tabella dei materiali) per identificare le cellule fuse per citometria di flusso e successiva identificazione della microscopia a fluorescenza della cellula centrosoria di origine e morfologia ( Figura1). Questo approccio è un metodo robusto e unico per studiare come i grandi cambiamenti nello stato cellulare, tra cui il numero di organelle, incidono sull'omeostasi cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

La vita è suddivisa spazialmente all'interno di membrane lipidiche per consentire la formazione isolata di stati molecolari distinti all'interno di cellule e organelli. La fusione cellulare è la fusione di due o più cellule per formare una singola cellula. Qui forniamo un protocollo per la fusione cellulare di due diversi tipi di cellule. Le cellule ibride fuse sono arricchite da uno smistamento a base di citometria di flusso, seguito dalla microscopia a fluorescenza della struttura e funzione delle cellule ibride. Le proteine fluorescenti etichettate generate dall'editing del genoma sono immagini all'interno delle cellule fuse, consentendo di identificare le strutture cellulari in base all'emissione di fluorescenza e di tornare al tipo di origine della cellula. Questo metodo robusto e generale può essere applicato a diversi tipi di cellule o organelli di interesse, per comprendere la struttura cellulare e la funzione in una serie di domande biologiche fondamentali.

Le celle etichettate in modo appropriato sono visibili durante la citometria di flusso mediante segnale di fluorescenza superiore alle celle di controllo non etichettate (Figura 2A). I cancelli sono impostati per la selezione di cellule doppie positive, arricchendo questa popolazione direttamente in piatti di imaging per ulteriori analisi microscopiche. Le cellule fuse sono rilevabili come cellule doppie fluorescenti fluorescenti distinte e c...

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Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Lo scopo di questo protocollo è quello di fondere due diversi tipi di cellule per creare cellule ibride. L'analisi della microscopia a fluorescenza delle cellule fuse viene utilizzata per tracciare la cellula di origine degli organelli cellulari. Questo saggio può essere usato per esplorare come la struttura cellulare e la funzione rispondono alla perturbazione con la fusione cellulare.

Fusione cellulare di linee cellulari modificate per la perturbazione della struttura cellulare e della funzione

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Questo metodo consente alla struttura cellulare e alla funzione di essere perturbate attraverso la fusione di due diversi tipi di cellule per affrontare domande come come le cellule rispondono ai cambiamenti nel numero di organelli. Imaging di proteine contrassegnate fluorescentmente all'interno di cellule fuse, le strutture cellulari possono essere referenziate al loro tipo di origine cellulare per studiare i meccanismi dell'omeostasi e della funzione degli organelli. Per l'etichettatura fluorescente dei coloranti, vedere le popolazioni di cellule tumorali umane di interesse in modo tale che ogni coltura si sia espansa ad almeno sei volte 10 alla sesta cella con una confluenza dal 70 al 90% entro la mattina successiva.Il giorno dell'etichettatura, lavare le cellule rootletin eGFP e rootletin-mScarlet due volte con 10 millilitri di PBS per lavaggio. Diluire il colorante a cellule viola a 500 nanomolari nel colorante PBS e far red cell a 200 nanomolari in PBS. Etichettare le cellule rootletin eGFP con il colorante a cellule violette diluito e le cellule rootletin-mScarlet con il colorante diluito a celle far red per un minuto a temperatura ambiente.Alla fine delle incubazioni, interrompere le reazioni con 10 millilitri di DMEM per cinque minuti. Lavare sia colture cellulari etichettate che una coltura cellulare parentale senza etichetta con 10 millilitri di PBS fresco prima di incubare tutte le colture con un millilitro di triptamina prebellica. Al termine dell'incubazione, trasferire le soluzioni cellulari staccate su singoli tubi conici da 15 millilitri per la centrifugazione e rimorsi delicatamente i pellet etichettati coloranti in un millilitro di PBS e le celle non etichettate in un millilitro di DMEM.Quindi restituire tutti i campioni di cellule all'incubatore di coltura cellulare. Per l'esperimento di fusione cellulare, mescolare 500 microlitri di cellule etichettate coloranti Violet con 500 microlitri di celle etichettate coloranti Far Red in un nuovo tubo da 15 millilitri e sedimentare le restanti cellule etichettate non miscelate per centrifugazione. Resuspend i pellet in un millilitro di DMEM fresco e riposizionare le cellule nell'incubatrice.Raccogliere le cellule miste per centrifugazione e aggiungere 700 microlitri del 50%1450 PEG in modo drop-wise al pellet per un periodo di 30 secondi. Dopo 3,5 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 10 millilitri di DMEM senza siero per un periodo di 30 secondi e posizionare i tubi nell'incubatrice per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, sedimentare le cellule miste mediante centrifugazione e rimorsi delicatamente il pellet in un millilitro di mezzo completo.Per arricchire per la popolazione cellulare fusa da FACS, filtrare delicatamente tutte le cellule in singoli tubi FACS attraverso un colino da 70 micrometri e creare grafici di discriminazione di dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale e al farsesco nel software del citometro. Eseguire le celle senza etichetta per registrare la loro intensità di fluorescenza e creare porte per identificare le celle fuse. Successivamente, esegui le singole cellule etichettate violette positive per confermare che non c'è fuoriuscita di segnale Violet nel canale Far Red e le singole cellule etichettate di colorante Far Red positive per confermare che non c'è alcun segnale Far Red nel canale Violet.Quindi eseguire brevemente il campione di fusione per confermare che le celle fuse sono visibili con questi cancelli. Una volta impostati i parametri di smistamento, allineare centralmente il flusso di smistamento in un piatto di imaging a otto pozzi contenente 100 microlitri di mezzo di crescita e ordinare le doppie cellule fuse positive direttamente nel piatto. Quando tutte le cellule sono state ordinate, posizionare immediatamente il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per due o 16 ore.Per la colorazione immunofluorescente, sostituire prima il supernatante di coltura cellulare con 200 microlitri del 4% di paraformaldeide per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS per lavaggio prima di permeabilizzare le cellule in 200 microlitri dello 0,1% di tensioattivo non ionico per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, bloccare il legame non specifico con 200 microlitri di albumina sierice bovina al 3% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente seguita dall'etichettatura con gli anticorpi di interesse in 150 microlitri di tampone di colorazione.Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le celle due volte in 300 microlitri di PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il lavaggio con 200 microlitri di PBS fresco. Per acquisire immagini delle celle fuse, utilizzare un microscopio a fluorescenza appropriato in grado di immagini a quattro colori e raccogliere immagini tridimensionali.Le cellule opportunamente etichettate sono visibili durante la citometria del flusso tramite segnale fluorescente ad un livello superiore rispetto alle celle di controllo non etichettate. I cancelli possono essere impostati per lo smistamento per arricchire per la doppia popolazione cellulare positiva direttamente in piatti di imaging per ulteriori analisi microscopiche. La fusione induce un importante riarrangiamento dell'architettura cellulare attraverso la miscelazione di due cellule in una sola.Gli eterokaryon sono identificati come cellule contenenti entrambi i segnali di colorante fluorescenti mescolati all'interno di una singola cellula senza intervenire su membrane plasmatiche. Inoltre, due nuclei possono anche essere visibili nelle celle fuse mediante imaging Brightfield. La struttura e la funzione cellulare possono essere ulteriormente studiate attraverso la fusione di cellule contenenti meGFP e mScarlet proteine taggate.La fusione si traduce in un raddoppio del numero baricentro all'interno di eterokaryons visibili come almeno quattro focolai di materiale pericentrilare quando il componente pericentrilare centrosomalo NEDD1 è contrassegnato fluorescentmente. La fusione di cellule con rootletina taggata endogenamente fluorescentmente consente di identificare la cellula di origine di ciascun centrosoma in un eterocarione. Questo protocollo dimostra come fondere linee cellulari etichettate in modo differenziato e come immagini i loro organelli per comprenderne la struttura e la funzione.Questo robusto protocollo è sia relativamente facile che relativamente economico da eseguire rispetto a metodi simili. Questa tecnica può essere usata per porre una serie di domande come come è regolata la fusione degli organelli e come le cellule rispondono ai cambiamenti nel numero di organelli subcellulari.

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