Name: cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function
Uploaded: 2019-12-07T17:00:00
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이 작품은 R.M.에 웰컴 트러스트 헨리 웰컴 펠로우십에 의해 투자되었다 (https://wellcome.ac.uk/grant 번호 100090 / 12 / Z). 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다. 아쇼크 벤키타라만과 폴 프렌치가 프로젝트에 대한 중요한 조언과 안내를 해주신 것에 감사드립니다. 우리는 우수한 지원을위한 케임브리지 연구 흐름 세포 측정 시설에 대한 케임브리지 연구소의 키아라 코세티와 가브리엘라 Grondys-Kotarba 감사합니다. 리암 카시데이, 토마스 밀러, 지안마르코 콘티노에게 원고를 증명해 주신 것에 대해 감사드립니다.

1. 차등 형광 세포 라벨링
<ol><li>CRISPR Cas9로 유전자 태그 지정<ol>
<li>CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용하여 인간 암 세포주에서 형광 단백질 meGFP 또는 mScarlet-I와 함께 뿌리 줄기 (또는 관심 있는 다른 유전자)를 태그합니다. 참고: 게놈 편집을 위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서24,25,26을다룹니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형?...

<ol>
	<li>Lane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).</li><li>Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+fuse.">How cells fuse.</a> The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>Rao, P. N., Johnson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Cell+Fusion:+Studies+on+the+Regulation+of+DNA+Synthesis+and+Mitosis.">Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis.</a> Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instability+in+colorectal+cancers.">Genetic instability in colorectal cancers.</a> Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).</li><li>Fournier, R. E., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcell-mediated+transfer+of+murine+chromosomes+into+mouse,+Chinese+hamster,+and+human+somatic+cells.">Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).</li><li>Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+induce+epigenetic+reprogramming+of+somatic+nucleus+in+hybrid+cells.">Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells.</a> The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).</li><li>Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+control+of+cell+pairing+and+fusion.">Microfluidic control of cell pairing and fusion.</a> Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).</li><li>Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol+rapidly+restores+physiological+functions+in+damaged+sciatic+nerves+of+guinea+pigs.">Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs.</a> Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).</li><li>Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primate+virus+generates+transformed+human+cells+by+fusion.">A primate virus generates transformed human cells by fusion.</a> The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).</li><li>Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cells+suppress+oncogene-dependent+apoptosis.">Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis.</a> Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).</li><li>Duelli, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virus+causes+cancer+by+inducing+massive+chromosomal+instability+through+cell+fusion.">A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion.</a> Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).</li><li>Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+intermediate+filament+dynamics+in+cell+heterokaryons+reveals+diverse+behaviour+of+different+keratins.">Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins.</a> Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).</li><li>Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+as+a+tool+to+gain+insight+into+membrane+fusion.">PEG as a tool to gain insight into membrane fusion.</a> European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).</li><li>Lentz, B. R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+glycol)+(PEG)-mediated+fusion+between+pure+lipid+bilayers:+a+mechanism+in+common+with+viral+fusion+and+secretory+vesicle+release?.">Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?.</a> Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).</li><li>Pontecorvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+mammalian+somatic+cell+hybrids+by+means+of+polyethylene+glycol+treatment.">Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment.</a> Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).</li><li>Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+giant+polynuclear+cell+formation+caused+by+HVJ+virus+from+Ehrlich's+ascites+tumor+cells.+I.+Microscopic+observation+of+giant+polynuclear+cell+formation.">Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation.</a> Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).</li><li>Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+field-mediated+fusion+and+related+electrical+phenomena.">Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).</li><li>Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+cellular+fusion+using+optically+trapped+plasmonic+nano-heaters.">Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters.</a> Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).</li><li>Kao, K. N., Michayluk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-frequency+intergeneric+fusion+of+plant+protoplasts.">A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts.</a> Planta. 115 (4), 355-367 (1974).</li><li>Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+fusion.">Mechanisms of cell fusion.</a> Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).</li><li>Mahen, R., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+centrosome+assembly.">Pattern formation in centrosome assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).</li><li>Mahen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+centrosomal+roots+disentangle+to+allow+interphase+centriole+independence.">Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence.</a> PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).</li><li>Mahen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+fluorescent+transgene+methods+for+quantitative+imaging+in+human+cells.">Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Yang, J., Shen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylene+glycol-mediated+cell+fusion.">Polyethylene glycol-mediated cell fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).</li><li>Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+pairing+and+polyethylene+glycol+(PEG)-mediated+cell+fusion+using+two-step+centrifugation-assisted+single-cell+trapping+(CAScT).">Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT).</a> Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).</li><li>Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+Cell-Cell+Fusion+Assay+for+Cytoplasmic+and+Organelle+Intermixing+Studies.">Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies.</a> Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).</li><li>Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+polyethylene+glycol-induced+cell+fusion+and+hybridization+in+lymphoid+cell+lines.">Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines.</a> Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).</li><li>Frye, L. D., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+intermixing+of+cell+surface+antigens+after+formation+of+mouse-human+heterokaryons.">The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons.</a> Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).</li><li>Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+mitochondria+in+mammalian+cells+is+dependent+on+the+mitochondrial+inner+membrane+potential+and+independent+of+microtubules+or+actin.">Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin.</a> FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).</li><li>Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+fusion+in+vivo+between+normal+host+and+tumor+cells:+possible+contribution+to+tumor+progression+and+metastasis+studied+with+a+lectin-resistant+mutant+tumor.">Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).</li></ol>

우리는 세포를 융합하고 현미경 검사법으로 세포 하이브리드의 후속 아키텍처를 시각화하기 위한 효과적이고 비용 효율적인 프로토콜을 시연하며, 처음부터 끝까지 약 2일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 세포 선별 (프로토콜 섹션 3)에 의한 융합 세포의 농축 및 현미경 검사법에 의한 융합 세포의 신중한 검증 (프로토콜 섹션 4)입니다. 이 단면도는 융합한 세포가 쉽게 장악되고 선의...

세포 구조의 적시성 유지는 삶에 매우 중요합니다. 세포에는 특징적인 형태, 세포 소기관 수 및 내부 생화학 적 조성이 있습니다. 이러한 근본적인 특성이 어떻게 생성되는지, 그리고 질병 중에 어떻게 엉망이 되는지 이해하려면 실험실 도구가 필요합니다.
세포 융합은 2개 이상의 분리된 세포의 병합이다. 세포 융합은 진핵 생명의 출현에 중요했을 수 있습니다1. 인체에서 세포 융합은 비교적 드물며, 수정 또는 근육, 뼈 및 태반의 형성과 같은 제한된 발달 상황 및 조직 유형 동안 발생한다2. 이 프로토콜은 세포 구조 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하는 도구로 서, 분별적으로 표지 된 세포기관과 조직 배양 세포 주에서 세포 융합의 유도를 설명합니다.
시험관내 유도 세포-세포 융합은 생물학적 연구 및 질병 치료를 위한 중요한 도구인 단일클론 항체3의생산의 중심이다. 세포 융합은 또한 세포 주기 우호에 관하여 많은 다른 근본적인 세포 생물학 질문을 하기 위하여 이용되었습니다4,aneuploidy5,6,세포 재프로그래밍7,8,손상된 신경의 수선9,바이러스성 증식10,세포증11,종양발생12,세포골격역학13,및 막 융합14,15. 세포-세포 융합을 유도하는 실험실 기반 방법16,17,18,19는 두 개의 이중층의 물리적 병합을 통해 지질막 유착을 유도한다. 세포 융합은 전기18,바이러스 기반 방법17,열플라스모닉 가열20,트랜스젠 발현19,폴리에틸렌 글리콜(PEG)16,21,22에의해 유도될 수 있다.
중원체는 세포 모양, 운동성, 편광 및 분열23을제어하는 미세소관 조직 센터입니다. 중심도 뿌리는 단백질뿌리줄기(24)를 함유하는 중심으로부터 연장되는 섬유질 구조이다(유전자 CROCC에의해 인코딩). 우리는 최근에 세포 세포 융합을 사용하여 부모 세포24에비해 중도위치및 수가 이종내의 다른 지 를 이해했습니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는 차별적으로 형광 태그 부모 세포의 융합 후 이종 내 뿌리의 기원의 세포를 추적하고, 따라서 이미지 세포 간 융합 및 핵분열이다. 형광 태그단백질 뿌리레틴-meGFP 또는 rootletin-mScarlet-I는 PEG 매개 세포 융합에 의해 융합되는 별도의 세포주에서 게놈 편집에 의해 생성됩니다. 우리는 유세포분석및 유래세포의 후속 형광 현미경 식별에 의한 융합세포를 식별하기 위해 세포염료(자료표)의사용을 설명한다(그림1). 이 접근은 세포 기관 번호를 포함하여 세포 상태에 있는 중요한 변경이 세포 항상성에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 강력하고 유일한 방법입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well imaging dishes</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gba-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Influx Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Filters (70um)</td>
			<td>Biofil</td>
			<td>CSS010070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Far Red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace Violet</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody</td>
			<td>NanoTag Biotechnologies</td>
			<td>N1302-At565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15 CO2 independent imaging medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21083027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free DMEM, high glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21063029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (1 x PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP151</td>
			<td>nonionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP337</td>
			<td>nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-cell fusion of genome edited cell lines for perturbation of cellular structure and function

생활은 세포와 세포기관 내부의 뚜렷한 분자 상태의 분리된 형성을 허용하기 위하여 지질 막 내의 공간적으로 분할됩니다. 세포 융합은 단일 세포를 형성하기 위해 2개 이상의 세포를 합병하는 것이다. 여기에서 우리는 2개의 다른 세포 모형의 세포 융합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 융합된 하이브리드 세포는 유세포분석 기반 선별에 의해 농축되고, 하이브리드 세포 구조 및 기능의 형광 현미경 검사법에 이어 풍부하다. 게놈 편집에 의해 생성된 형광 태그가 붙은 단백질은 융합된 세포 안쪽에 심상하게, 세포 구조물이 형광 방출에 근거를 둔 확인되고 기원의 세포 모형에 다시 참조되는 것을 허용합니다. 이 강력하고 일반적인 방법은 기본적인 생물학 질문의 범위에 걸쳐 세포 구조 및 기능을 이해하기 위하여 관심있는 다른 세포 모형 또는 세포기관에 적용될 수 있습니다.

적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 더 높은 형광 신호에 의해 유세포분석 중에 볼 수있다(도 2A). 게이츠는 이중 양성 세포의 선별을 위해 설정되어 있으며, 이 집단을 이미징 접시에 직접 풍부하게 하여 추가적인 현미경 분석을 제공합니다. 융합된 세포는 뚜렷한 이중 형광 양성 세포로서 검출가능하며 인구의 약 ~1%...

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Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

이 방법은 세포 구조와 기능이 세포 수의 변화에 반응하는 방법과 같은 질문을 해결하기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형의 융합을 통해 혼란을 수 있습니다. 융합된 세포 내의 형광태그 단백질을 이미징함으로써 세포 구조는 세포 간장성 및 기능의 메커니즘을 연구하기 위해 그들의 세포 유형의 기원에 다시 언급될 수 있습니다. 형광염 염료 라벨링의 경우, 각 배양이 다음 날 아침까지 70~90%의 인플루언서에서 6세포로 적어도 6배10으로 확대될 정도로 관심있는 인간 암세포 집단을 참조한다.라벨링 당일, 충청식 eGFP와 루트레틴-mScarlet 세포를 세척당 PBS 10밀리리터로 두 번 세척합니다. PBS및 파레드 셀 염료에서 500 나노몰러로 바이올렛 세포 염료를 PBS에서 200 나노몰러로 희석시. 뿌리 줄기 eGFP 세포를 희석된 바이올렛 세포 염료와 루트레틴-mScarlet 세포에 실온에서 1분 동안 희석된 파 레드 셀 염료로 라벨을 붙입니다.인큐베이션이 끝나면 5분 동안 DMEM의 10밀리리터로 반응을 중지합니다. 라벨이 부착된 세포 배양과 10밀리리터의 신선한 PBS를 세척한 후 예동 트립신1밀리리터로 모든 배양을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 분리된 세포 용액을 개별 15 밀리리터 원심분리튜브로 옮기고 PBS의 1밀리리터와 DMEM의 1밀리리터로 표지되지 않은 세포로 염료 표지펠릿을 부드럽게 재연한다.그런 다음 모든 세포 샘플을 세포 배양 인큐베이터로 반환합니다. 세포 융합 실험을 위해, 새로운 15 밀리리터 튜브에 파 레드 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터와 바이올렛 염료 표지 세포의 500 마이크로 리터를 혼합하고 원심분리에 의해 나머지 혼합되지 않은 표시 되지 않은 세포를 퇴적. 신선한 DMEM의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.원심분리에 의해 혼합 된 세포를 수집하고 30 초 동안 펠릿에 드롭 현명한 방식으로 50%1450 PEG의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 실온에서 3.5분 후, 30초 동안 10밀리리터의 세럼 없는 DMEM 드롭와이즈를 추가하고 튜브를 인큐베이터에 10분 간 넣습니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의한 혼합 세포를 침전시키고 완전한 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 재분리한다.FACS에 의해 융합된 세포 인구를 위해 모든 세포를 70 마이크로미터 여과기를 통해 개별 FACS 튜브로 부드럽게 필터링하고 사이토미터 소프트웨어의 측면 분산 및 이중 차별 플롯에 대한 전방 산란을 만듭니다. 레이블이 없는 세포를 실행하여 형광 강도를 기록하고 융합된 세포를 식별하기 위해 게이트를 만듭니다. 다음으로, 단일 양성 바이올렛 염료 표지 세포를 실행하여 보라색 신호가 파 레드 채널로 유출되지 않고 단일 양성 극적 염료 표시 세포에 유출되지 않는지 확인하여 바이올렛 채널에 극적 신호가 없음을 확인한다.그런 다음 융합 샘플을 짧게 실행하여 융합된 세포가 이러한 게이트와 함께 보이는지 확인합니다. 선별 매개 변수가 설정되면 선별 스트림을 100 마이크로리터의 성장 배지를 포함하는 8웰 이미징 접시에 중앙집중식으로 정렬하고 이중 양성 융합 세포를 접시에 직접 정렬합니다. 모든 세포가 정렬되면 즉시 2 ~ 16 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.면역형 염색의 경우, 먼저 실온에서 15분 동안 4%파라포름알데히드의 200마이크로리터로 세포 배양 상류체를 대체한다. 고정의 끝에서, 실온에서 10 분 동안 0.1 %의 nonionic 계면 활성제의 200 마이크로 리터에서 세포를 투과화하기 전에 세척 당 PBS의 200 마이크로 리터로 세포를 세 번 세척한다. 다음으로, 실온에서 30분 동안 PBS에서 3%소 세럼 알부민의 200마이크로리터를 적재하고, 150마이크로리터에 대한 관심 있는 항체로 라벨을 부착하여 염색 버퍼의 150마이크로리터로 비특이적 결합을 차단한다.실온에서 1 시간 후, 세척 당 5 분 동안 PBS의 300 마이크로 리터에 세포를 두 번 세척. 마지막 세척 후, 신선한 PBS의 200 마이크로 리터로 세척을 교체하십시오. 융합된 세포의 심상을 취득하려면 4색 이미징이 가능한 적절한 형광 현미경을 사용하고 3차원 이미지를 수집합니다.적절하게 표지된 세포는 표지되지 않은 대조군 세포보다 높은 수준에서 형광 신호에 의해 유동 세포 측정 중에 볼 수 있습니다. 게이트는 이중 양성 세포 집단을 더 현미경 분석을 위해 이미징 접시에 직접 풍부하게 분류하도록 설정할 수 있습니다. 융합은 두 세포의 혼합을 통해 세포 아키텍처의 주요 재배열을 유도한다.이종은 혈장 막을 개입하지 않고 단일 세포 내부에 혼합된 두 형광 염료 신호를 포함하는 세포로 확인된다. 추가적으로, 2개의 핵은 또한 브라이트필드 화상 진찰에 의해 융합된 세포에서 보일 수 있습니다. 세포 구조 및 기능은 meGFP 및 mScarlet 태그 단백질을 포함하는 세포의 병합을 통해 더 조사될 수 있다.융합은 백중구 백센토리올 성분 NEDD1이 형광으로 태그될 때 적어도 4개의 pericentriolar 물질 로 보이는 이종 내부의 중척추 수의 두 배로 증가시다. 내인성 형광표 뿌리제와 세포의 융합은 각 중구의 기원의 세포가 이종에서 확인될 수 있게 한다. 이 프로토콜은 차별화된 라벨이 부착된 세포주를 융합하는 방법과 세포기관을 이미지하여 구조와 기능을 이해하는 방법을 보여줍니다.이 강력한 프로토콜은 유사한 방법에 비해 비교적 쉽고 상대적으로 저렴합니다. 이 기술은 세포세포 융합이 어떻게 규제되는지, 세포가 세포 세포 외 세포 수의 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 다양한 질문을 하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

연구

발생학

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...